Interacciones de host-microbio intestinal fueron evaluadas usando un nuevo enfoque que combina una comunidad oral sintético, en vitro la digestión gastrointestinal y un modelo del epitelio del intestino delgado. Presentamos un método que puede ser adaptado para evaluar invasión celular de patógenos y biofilms multiespecies, o incluso para probar la supervivencia de las formulaciones probióticas.
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Artículo de método
Evaluar la viabilidad de un consorcio bacteriano sintético en la interfaz de Host-microbio In Vitro Gut
En este artículo
Resumen
Resumen
La interacción entre huésped y microbiota ha sido reconocida desde hace mucho y ampliamente descrito. La boca es similar a otras secciones del tracto gastrointestinal, como microbiota residente se produce y evita la colonización por bacterias exógenas. De hecho, más de 600 especies de bacterias se encuentran en la cavidad bucal, y una sola persona puede llevar alrededor de 100 diferentes en cualquier momento. Bacterias orales poseen la capacidad de adherirse a los diferentes nichos en el ecosistema oral, integrándose así dentro de las comunidades microbianas residente y que favorece crecimiento y supervivencia. Sin embargo, se ha propuesto el flujo de bacterias en el intestino durante la ingestión de perturbar el equilibrio de la microbiota intestinal. De hecho, la administración oral de p. gingivalis cambió de puesto la composición bacteriana en la microflora ileal. Utilizamos una comunidad sintético como una representación simplificada del ecosistema oral natural, a la supervivencia y viabilidad de bacterias orales sometidos a condiciones de tránsito gastrointestinal simulada. Catorce especies fueron seleccionadas sometidas a en vitro salival, gástrica y procesos de la digestión intestinal y presentó a un modelo de multicompartment de la célula que contiene las células Caco-2 y HT29-MTX para simular el epitelio de la mucosa intestinal. Este modelo sirve para desentrañar el impacto de bacterias ingeridas en células que participan en la circulación enterohepática. Utilizando las comunidades sintéticas permite la capacidad de control y reproducibilidad. Por lo tanto, esta metodología puede ser adaptada para evaluar viabilidad del patógeno y la subsecuentes inflamación asociados cambios, capacidad de colonización de las mezclas de probióticos, y en última instancia, bacteriana potencial impacto en la circulación presistémica.
Introducción
Los seres humanos conviven con las bacterias, que están presentes en el mismo número que las células humanas1. Por lo tanto, es de crucial importante obtener un conocimiento integral del microbioma humano. La cavidad bucal es un entorno único en que se divide en varios hábitats más pequeño, así que contiene una gran variedad de bacterias y biofilms en los diferentes lugares. Ser un ecosistema abierto, algunas especies en la boca pueden ser visitantes transitorios. Sin embargo, ciertos microorganismos colonicen pronto después de nacimiento y forma organizan de biofilms2. Estas se encuentran en la superficie de los dientes....
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Protocolo
1. las cepas y condiciones de la cultura
Nota: La comunidad oral sintético fue compuesta por cepas comúnmente presentes en el microbioma oral3.
- Obtener las siguientes cepas de la American Type Culture Collection (ATCC): adelante actinomycetemcomitans (ATCC 43718), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (ATCC 25611) Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus sobrinus (ATCC 33478), Actinomyces naeslundii (ATCC 51655), Strept....
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Resultados
Este protocolo conduce a la generación de un modelo adecuado para elucidar la supervivencia y viabilidad de bacterias orales sometidos a condiciones de tránsito gastrointestinal simulada. Las cuentas de las células intactas de cepas individuales es de aproximadamente 108 células antes de mL-1 la creación de la comunidad sintético, mientras que el multiespecífico microcosmos contenido sobre el 90% de células viables durante el establecimiento de la comunidad (
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Discusión
El microbioma oral es un elemento clave en la salud humana reportada recientemente por varios autores20,21. Los resultados anteriores sugieren que la ingestión de saliva, que contiene grandes cargas de bacterias puede influir en el ecosistema microbiano del intestino, que es uno de los sitios principales para oscurecimiento inmunológico. La combinación de un modelo de digestión gastrointestinal superior estático con la interfaz de anfitrión, representado por las .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar
Agradecimientos
Los autores reconocen con gratitud el apoyo financiero de la Fundación de investigación de Flandes a Marta Calatayud Arroyo (FWO postdoctoral fellowship-12N2815N). Emma Hernandez-Sanabria es una beca posdoctoral apoyada por Flandes innovación y emprendimiento (Agentschap voor innovadores puerta Wetenschap en Technologie, IWT).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| CEPAS | |||
| Aggregatibacter actinomycetemcomitans | American Type Culture | Collection ATCC 43718 | |
| Fusobacterium nucleatum | American Type Culture Collection | ATCC 10953 | |
| Porphyromonas gingivalis | American Type Culture Colección | ATCC 33277 | |
| Prevotella intermedia | American Type Culture Collection | ATCC 25611 | |
| Streptococcus mutans | American Type Culture Collection | ATCC 25175 | |
| Streptococcus sobrinus | American Type Culture Collection | ATCC 33478 | |
| Actinomyces viscosa | American Type Culture Collection | ATCC 15987 | |
| Streptococcus salivarius TOVE-R | |||
| Streptococcus mitis | American Colección de cultivos | tipo ATCC 49456 | |
| Streptococcus sanguinis | BCCM/LMG Colección de bacterias | LMG 14657 | |
| Veillonella parvula | Instituto Leibniz DSMZ-Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares DSM | 2007 | |
| Streptococcus gordonii | Colección de Cultivos Tipo Americanos | ATCC 49818 | |
| CELULARES FUERTES | |||
| Caco-2 | fuertes Colección Europea de Cultivos Celulares Autentificados | 86010202 | |
| células HT29-MTX | Colección Europea de Cultivos Celulares Autentificados | 12040401 | |
| REACTIVOS Y CONSUMIBLES | |||
| Brain Caldo de infusión de corazón (BHI) | Oxoid | CM1135 | |
| Agar Sangre 2 | Oxoid | CM0055 | Medio Agar Sangre |
| Menadione | Sigma | M9429 | |
| Hemin | Sigma | H9039 | |
| 5% sangre de caballo estéril desfibrilada | E& O Laboratories | Ltd,P030 | |
| InnuPREP PCRpure Kit | Analytik Jena | 845-KS-5010250 | Kit de purificación de PCR |
| Big Dye | Applied Biosystems | 4337454 Dye para secuenciación ABI | |
| Prism BigDye Terminator v3.1 kit de secuenciación de ciclo | Applied Biosystems | 4337456 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| Iduro de propidio | Invitrogen | P1304MP | |
| T25 matraces de cultivo sin recubrimiento, tratados con cultivo celular, ventilados, estériles | VWR | 734-2311 | |
| Solución de tripsina-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Solución de Trypan Blue 0,4%, líquido, filtrado estéril | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| Medios de cultivo celular DMEM, con tecnologías GlutaMAX y Pyruvate | Life | 31966-047 | |
| Insertos de cultivo celular de membrana de poliéster Corning Transwell | Sigma-Aldrich | CLS3450-24EA | |
| Mucina de estómago porcino Tipo II | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| Suero fetal bovino inactivado | Greiner Bio One | 758093 | |
| Antibiótico-Antimicótico (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Triton X 100 para biología molecular | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DPBS sin calcio, magnesio | Gibco | 14190-250 | |
| Pierce LDH Kit de ensayo de citotoxicidad | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| Corning HTS Transwell-24 pozo, tamaño de poro 0,4 y micro; m | Corning Costar Corp | 3450 | |
| Agua libre de nucleasas | Electroforesis Serva | 28539010 | |
| EQUIPMENT | |||
| conteo mejorada | Carl Roth | T729.1 | |
| BD Accuri C6 Citómetro de flujo | BD Biosciences | 653118 | |
| PowerLyzer 24 Homogeneizador | MoBio | 13155 | |
| T100 Termociclador | BioRad | 186-1096 | |
| Sistema de descarga | a | medida-InnOva | |
| Brunswick Scientific | 8261-30-1007 | Agitador para incubadora | |
| Memmert CO2 | Memmert GmbH & Co. | ICO150med | |
| Millicell ERS (Sistema de Resistencia Eléctrica) | EMD Millipore, Merck KGaA | MERS00002 | |
| Millipore Milli-Q academic, sistema de agua ultra pura | Millipore, Merck KGaA-Shaker | ||
| (ROCKER 3D basic) | IKA | 4000000 | Shaker para 6.10 |
Referencias
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biology. 14, e1002533(2016).
- Kelly, D., King, T., Aminov, R. Importance of microbial ....
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Reimpresiones y permisos
