Calorespirometry: Es un enfoque potente y no invasivo para investigar el metabolismo energético celular

Resumen

Este protocolo describe calorespirometry, la medición directa y simultánea de disipación de calor y la respiración, lo que proporciona un enfoque no invasivo para evaluar el metabolismo energético. Esta técnica se utiliza para evaluar la contribución de las vías aeróbicas y anaeróbicas para utilización de la energía mediante el control del flujo total de energía celular.

Resumen

Muchas líneas celulares utilizadas en la investigación biológica y biomédica básica mantienen la homeostasis de la energía a través de una combinación de respiración aerobia y anaerobia. Sin embargo, la medida en que ambas vías contribuyan al paisaje de la producción de energía celular es constantemente pasado por alto. Las células transformadas se cultivan en los niveles de glucosa se satura a menudo muestran una dependencia disminuida en la fosforilación oxidativa para la producción de ATP, que es compensada por un aumento en la fosforilación a nivel de sustrato. Este cambio en el equilibrio metabólico permite a las células de proliferar a pesar de la presencia de las toxinas mitocondriales. En descuidar el equilibrio metabólico alterado de las células transformadas, los resultados de una investigación farmacéutica puedan ser mal interpretados desde el potencialmente efectos mitotoxic no pueden ser detectadas utilizando modelo de líneas de celulares cultivado en presencia de glucosa alta concentraciones. Este protocolo describe el apareamiento de dos poderosas técnicas, respirometría y calorimetría, que permite la evaluación cuantitativa y no invasiva de contribuciones aeróbicas y anaeróbicas a la producción de ATP celular. Respiración aerobia y anaerobia genera calor, que puede ser monitoreados mediante calorimetría. Mientras tanto, medir la tasa de consumo de oxígeno puede evaluar el grado de respiración aeróbica. Disipación de calor y consumo de oxígeno se miden al mismo tiempo, se puede determinar la relación calorespirometric. Puede entonces compararse con el valor experimentalmente obtenido el oxycaloric teórico equivalente y la amplitud de la respiración anaerobia puede ser juzgada. Así, calorespirometry ofrece un método único para analizar una amplia gama de cuestiones biológicas, incluyendo el desarrollo de medicamentos, crecimiento microbiano y bioenergéticas fundamentales bajo condiciones hipóxicas y normoxic.

Introducción

En los sistemas biológicos, el cambio de la liberación de calor o entalpia durante el metabolismo suele ser supervisado ya sea directamente (vía directa calorimetría) o indirectamente por el consumo de O₂ y CO₂ producción (mediante respirometría). Desafortunadamente, cuando estas técnicas se utilizan en el aislamiento, información crítica se pierde, como la contribución de las vías anaerobias al metabolismo celular. Calorespirometry es una técnica poderosa que se basa en la medición simultánea de la disipación de calor y respiración. Calorespirometric labor pionera investigó el metabolismo anaerobio en células de mamífero totalmente oxig....

Protocolo

1. cultivo celular

1. Mantener las células del carcinoma (HepG2) hepatocelular humano en medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) y sustratos adicionales (10 mM de glucosa, glutamina 2 mM y 1 mM piruvato) a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular (5% CO₂ , 95% aire, 100% de humedad).
   Nota: Utilice la anterior formulación de DMEM al DMEM se hace referencia en pasos posteriores para la respirometría y calorimetría.
2. La placa de las celdas de 1 x 10⁶ células por placa de 100 mm cultura y subcultura cada 7 días o antes de llegar a 90% de confluencia y renovar el medio cada 3-4 días.....

Resultados

La reproducibilidad de las mediciones de calorespirometric depende de una preparación adecuada y constante. Muestras preparadas a partir de cultivos celulares deben no utilizarse si las placas son muy crecidas, como recuentos de células pueden ser inexactos debido a la aglutinación. Además, flujos de calor reducida debido a la difusión limitada de sustrato en las células agrupadas pueden ocurrir. Por lo tanto, al utilizar células adherentes, es fundamental seleccionar una placa con la confluencia entre 60-80% y cambiar e.......

Discusión

El objetivo de calorespirometry es evaluar cuantitativamente la contribución de las vías aeróbicas y anaeróbicas a actividad metabólica y obtener una vista compuesta de flujo de la energía celular. Esto se logra mediante una medición simultánea de la disipación de calor y flujo de oxígeno, seguido por una comparación de la proporción de CR calculada con la oxycaloric teórica equivalente. Deben considerarse varios pasos críticos para datos reproducibles y confiables. El mantenimiento de un cultivo celular estéril y saluda.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Células HepG2 Colección	cultivos tipo americano	HB-8065	Células utilizadas para calorespirometría
O2k-Respirómetro	Oroboros Instruments	10022-02	Respirómetro
LKB 2277 monitor de actividad térmica (TAM)	Termométrico AB		Thermometric fue adquirida por TA Instruments
Piruvato de sodio (100 mM)	Thermofisher Scientific	11360070	Solución 100x añadida al medio DMEM
Suero fetal bovino - Premiuim Select	Atlanta Biologicals	S11550	Añadido al 10% en medio DMEM
Trypsn-EDTA (0,25%)	Thermofisher Scientific	25200072	Reactivo de disociación celular
Oligomicina de Streptomyces diastatochromogenes	Sigma Aldrich	O4876	Inhibidor mitocondrial
Cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona	Sigma	Aldrich C2920	Desacoplador mitocondrial
Corning 100 mm Placa de cultivo tratada con TC	Corning Corporation 430167		Placa de cultivo de tejidos
Glucosa, polvo	Thermofisher Scientific	15023021	Glucosa para medio DMEM
Galactosa, en polvo	Fischer Scientific	BP656500	Galactosa para medio DMEM
L-Glutamina (200 mM)	Thermofisher Scientific	25030081	Glutamina para medio
DMEM DMEM, sin glucosa	Thermofisher Scientific		11966025 Medio de cultivo celular

de