Imágenes de Ca2 + respuestas durante la infección de Shigella de células epiteliales

Resumen

Aquí, presentamos protocolos para visualizar las respuestas de calcio (Ca^{2 +}) provocadas por las células HeLa infectadas por Shigella. Optimización de los parámetros de infección bacteriana y la proyección de imagen con sondas fluorescentes de Ca^{2 +} , se caracterizan atípicos globales y locales Ca^{2 +} señales inducidas por bacterias sobre una amplia gama de cinética de la infección.

Resumen

CA^{2 +} es un ion omnipresente en todos los procesos celulares conocidos. Aunque global Ca^{2 +} respuestas pueden afectar el destino de la célula, variaciones locales en libre Ca^{2 +} citosólicas concentraciones, ligadas a la liberación de tiendas interiores o un flujo a través de canales de la membrana plasmática, regulan procesos celulares corticales. Patógenos se adhieren a o invadir el huésped células gatillo una reorganización del citoesqueleto de actina subyacente a la membrana plasmática de host, que probablemente afecta a nivel global y local de Ca^{2 +} señalización. Porque estos eventos pueden ocurrir en frecuencias bajas de manera pseudo-estocástica sobre cinética extendida, el análisis de Ca^{2 +} señales inducidas por patógenos plantea importantes desafíos técnicos que deben abordarse.

Aquí, Divulgamos los protocolos para la detección de Ca^{2 +} señales globales y locales en una Shigella infección de células epiteliales. En estos protocolos, artefactos vinculados a una exposición prolongada y fotoenvejecimiento asociado con la excitación de Ca^{2 +} fluorescentes puntas de prueba se removio controlando estrictamente los parámetros de adquisición durante períodos de tiempo definidos durante un Shigella invasión. Procedimientos se implementan para analizar rigurosamente la amplitud y la frecuencia de Ca^{2 +} señales citosólicas globales durante la cinética de la infección extendida usando la sonda química Fluo-4.

Introducción

CA^{2 +} regula todos los procesos de células conocidas, incluyendo la reorganización del citoesqueleto, las respuestas inflamatorias y vías de muerte celular relacionadas con las interacciones huésped-patógeno^1,2,3. En condiciones fisiológicas, basal Ca^{2 +} las concentraciones citosólicas son bajas, en los cientos de rango nM, pero pueden ser sometidas a aumentos transitorios sobre el estímulo del agonista. Estas variaciones demuestran a menudo comportamiento oscilatorio a través de la acción de las bombas y canales en las membranas del retículo endoplásmic....

Protocolo

1. preparaciones

1. Preparación de bacterias
   1. Las bacterias de la placa: cepa de tipo salvaje deShigella expresando la adhesina de AfaE (M90T-AfaE) — en un tripticasa agar de soja (TCS) placa que contiene 0.01% Congo rojo (CR) e incubar de 18 h a 37 ° C.
      Nota: Para aumentar su reproducibilidad, las placas de Shigella obtenidas en el paso 1.1.1 se almacenan a 4 ° C y deben ser usadas dentro de una semana, porque todas las colonias en medio de CR se pondrá rojas eventualmente con el tiempo.
   2. Inocular el TCS caldo de cultivo previo escogiendo 3 colonias rojo de las placas de la raya.
      Nota: Se realiza una....

Resultados

Invasión de Shigella se asocia con anormal duradero Ca^{2 +} respuestas locales:

Siguiendo el protocolo mencionado anteriormente, las células HeLa Fluo-4-cargado se desafiaron con WT Shigella y se realizaron adquisiciones de secuencia para analizar señales de Ca^{2 +} . En figura 1, se muestra un experimento representativo con serie de Time-lapse de imágenes de la inte.......

Discusión

Este manuscrito describe el protocolo que hemos diseñados para seguir Ca^{2 +} señales locales durante las cinéticas relativamente corto de una invasión de Shigella , así como Ca^{2 +} respuestas globales durante la cinética extendida de Shigella. A continuación, clave se encuentran cuestiones que deben abordarse para optimizar la detección de Ca^{2 +} señales y reducir al mínimo cualquier interferencia con los procesos biológicos.

Química y gené.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
Metamorph versión 7.7	Universal Imaging
Sistema de iluminación CoolLED pE-2	Roper Scientific
micro-plato 35 mm, alto	IBIDI	81156
Caldo de tripticasa de soja (TCS)	Thermofisher		B11768
TCS agar	Thermofisher		B11043
Congo rojo	Sigma-Aldrich		75768
M90T-AfaE	Sun et al. 2017	Shigella flexneri serotipo V. que expresa la AfaE adhesin
ipgD-AfaE	Sun et al. 2017	cepa mutante isogénica ipgD que expresa la adhesina

AfaE