Fraccionamiento subcelular de especímenes gastrointestinales frescos y congelados

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para realizar un fraccionamiento celular simple para la separación subcelular de proteínas citoplásmicas y nucleares en biopsias intestinales humanas frescas y congeladas.

Resumen

El propósito de este protocolo es fraccionar tejido intestinal humano obtenido por endoscopia en compartimentos citoplásmicos y nucleares para el análisis de localización de proteínas específicas o complejos de proteína en Estados diferentes del tejido (es decir, saludable frente a la enfermedad). Este método es útil para el fraccionamiento de ambas muestras de tejido intestinal frescos y congelados; es fácilmente accesible para todos los laboratorios y no requiere mucho tiempo.

Introducción

Las proteínas participan en casi todas las funciones biológicas dentro de una célula y cualquier variación en su estructura, la cantidad o la ubicación puede conducir a un escenario de patógeno. Métodos de fraccionamiento de muestras de tejido son un método útil para reducir la complejidad de la enfermedad relacionados con el análisis de la proteína. Algunos estudios utilizan información de localización de la proteína o enriquecen una proteína de un compartimento celular específico, por lo que un protocolo reproducible fraccionamiento de proteínas intactas es útil para responder a ciertas cuestiones biológicas. Determinación de la localización subcelular de las proteínas y vigilar su redistribución compartimentación o interacciones en basal y las condiciones de la enfermedad ayudará a identificar la enfermedad relacionada con las diferencias funcionales^1,2. Así, este método pretende fraccionar reproducible las biopsias de tejido intestinal, frescas y congeladas, en compartimentos subcelulares citoplásmicas y nucleares.

Las muestras de biopsia intestinal habitualmente se obtienen durante la endoscopia procedimientos³ (figura 1) y pueden ser utilizadas eficazmente para la cuantificación de la proteína o los estudios de inmunoprecipitación. Puesto que las muestras de tejido del intestinal epitelios contiene proteínas que pueden estar directamente involucradas en la patogénesis de la enfermedad⁴, las muestras de biopsia intestinal son una fuente muy valiosa para la identificación exitosa de específicos de la enfermedad intestinal proteínas. Muestras de tejido congelado, paciente almacenados junto con la información clínica son recursos útiles para el análisis de la proteína, y una preparación simple y reproducible es una cuestión clave para proporcionar información de compartimentación celular utilizando cantidades limitantes de congelados tejido⁵.

Hay varios kits disponibles en el mercado para la separación de fracciones celulares, pero son más caras y generalmente más lento que el protocolo presentado aquí. Protocolos basados en varios pasos centrifugación degradado y gradientes continuos también se han utilizado previamente para el fraccionamiento de los diversos compartimentos celulares en diferentes tejidos^6,7. Sin embargo, mantener la consistencia de gradientes continuos suele ser una tarea difícil. Similares protocolos basados en la secuencial lisis de las membranas se han descrito anteriormente pero generalmente necesitan más de dos tampones y las manos el tiempo es más largo⁸ .

Fraccionamiento de muestras de tejido, tener en cuenta ese tejido muestras presentes célula-célula y célula-matriz de interacciones que son no presentes en células cultivadas e importantes cuando proceder a la extracción de proteínas. El adecuado desglose entre células y matriz extracelular sin afectar la calidad de la proteína será un factor crítico en el tejido intestinal proteínas aislamiento⁹. En este protocolo, contactos célula-célula y célula matriz primero se rompen, liberando las células y permitiendo que el búfer llegar a las células individuales. Para evitar la proteína-compartimiento de mezcla antes del fraccionamiento, la ruptura de los contactos debe ocurrir sin alterar la integridad de las células o las membranas nucleares.

Por el enriquecimiento de distintas proteasas en la mucosa intestinal¹⁰, es importante para el control de la degradación de la proteína durante la extracción. Para minimizar la potencial degradación de las proteínas, múltiples inhibidores de proteasa deben incluirse en los buffers de extracción de proteína. Además, si extractos van a utilizarse para el análisis funcionales, es esencial para evitar la desnaturalización de las proteínas o la proteólisis, pues esto ocasionará una pérdida de proteína actividad¹¹. Para ello, el protocolo se lleva a cabo a 4 ° C y fresco phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) se añade a los buffers en una concentración final de 0,1 mM justo antes de usar además inhibir la proteólisis.

El primer paso en el fraccionamiento celular es interrupción de tejido y lisis celular. Como se mencionó anteriormente, el objetivo es separar las células y les abren con mínimo daño de rotura. Las muestras de tejido intestinal deben ser homogeneizadas y lisis de las células para lograr máxima rotura de la membrana celular. En este protocolo, utilizamos una batidora de mano motorizado para romper el tejido intestinal que se homogeneiza dentro de segundos por medio de la acción de Vortex de alta velocidad. Después de la homogeneización, se incuban las células del tejido en un tampón hipotónico que estallará la membrana de la célula pero mantendrá los núcleos intactos, seguido por la adición de un detergente no desnaturalizantes (nonil phenoxypolyethoxylethanol) y un vortex corto para separar los núcleos de la fracción citoplasmática. Después de la separación del citoplasma, la membrana celular de los núcleos es irrumpió en un buffer hipertónico con agitación.

El método presentado aquí es un método adecuado para el fraccionamiento subcelular de las biopsias intestinales frescos y congelados que se han obtenido durante procedimientos endoscópicos y oscilan entre los 2 y 10 mg de peso. El protocolo es fácil y reproducible y se podría realizar utilizando equipos de laboratorio básicos y reactivos en menos de una hora.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Consejo de ética de Hospital de Universitario de Cruces y los análisis se realizaron después de que se obtuvo consentimiento informado de todos los sujetos o a sus padres.

1. biopsia de la colección

Nota: Especímenes de la biopsia de duodeno distal de pacientes se obtienen durante la endoscopia de diagnóstico rutinaria gestión de biopsias que varían entre 2 y 10 mg de peso. Tejido hecho una biopsia es un tejido complejo compuesto por diversos tipos celulares incluyendo células epiteliales, inmunes y endoteliales. Gastroenterólogos clínicos realizan la endoscopia siguiente establecido guías de práctica clínicas.

1. Colocar la biopsia en un papel de filtro estéril justo después de la endoscopia.
2. Utilice pinzas para transferir las biopsias en tubos de 1,5 mL, remójelos con PBS y colóquelo en un criotubo.
3. Mantener los tubos en hielo hasta que llegan al laboratorio.
   1. Iniciar proceso de biopsias frescas inmediatamente.
4. De biopsias congeladas, flash congelación de la biopsia que contienen tubos y almacenar en nitrógeno líquido hasta su utilización.
   Nota: Es importante mantener la muestra congelada hasta que se añade el buffer suplementado frío 1.

2. preparación de buffer

Nota: Antes de iniciar, complementar los buffers como sigue.

1. Añadir 1 mM TDT (concentración final) y proteasa y fosfatasa inhibidor de cóctel (1 x concentración final) en el búfer hipotónico hipertónico y 1 Tampón 2 (tabla 1).
   1. Preparar 1,5 mL de tampón 1 y 150 μL de tampón 2 por muestra. TDT previene la oxidación de las muestras.
2. Preparar el tampón de lavado núcleos mediante la adición de detergente al 1% (nonil phenoxypolyethoxylethanol) a una concentración final de 0.1% en el búfer ya completado 1. Preparar 1 mL de tampón de lavado núcleos por muestra.

3. biopsia de la homogeneización

1. Biopsias frescas
   1. Coloque el mortero descartable en el mezclador motorizado. Garantizar que el mortero llegue a la parte inferior del tubo.
   2. Sacar la biopsia desde el criotubo y colóquelo en un tubo de 1,5 mL con una pipeta.
   3. Añadir 200 μL de buffer suplementado 1 al tubo de 1,5 mL.
   4. Homogeneizar la biopsia con la mano del mortero hasta que el tejido es totalmente trastornado y mantenerlo en hielo.
   5. Una vez que todas las biopsias son homogeneizadas continúe con el paso 4.
      Nota: Disponibles Pisones deben cambiarse entre las biopsias.
2. Biopsias congeladas
   PRECAUCIÓN: Manipule nitrógeno líquido cuidadosamente; contacto del nitrógeno líquido con la piel o los ojos puede causar daños de congelación. Proteger las manos y los ojos siempre con nitrógeno líquido.
   1. Tomar algunos nitrógeno líquido en una caja para almacenar criotubos obtenido desde el tanque de nitrógeno.
   2. Encontrar la biopsia en el tanque de nitrógeno y el criotubo en la caja con el nitrógeno líquido. Repita este paso para todas las biopsias.
   3. Transferencia de la biopsia de la criotubo a un tubo de 1,5 mL.
      Nota: Las biopsias se unirá al tubo de congelados. Empuje la biopsia con una pipeta estéril para que se desprenda del tubo.
   4. Añadir 200 μL de buffer suplementado 1.
   5. Homogeneizar el tejido con la maja y el mortero hasta que el tejido se interrumpe totalmente, manteniendo la temperatura a 4 ° C a lo largo de todo el procedimiento.
      Nota: No deje que las biopsias descongelar antes de agregar el buffer.

4. citoplasma aislamiento

1. Incubar la biopsia homogeneizada en hielo durante 10 minutos.
2. Añadir 10 μl de detergente al 1% (nonil phenoxypolyethoxylethanol) a cada muestra a una concentración final de 0.05%.
   Nota: Las células se hinchan y estallan por lisis osmótica como el detergente, se interrumpirán la membrana celular.
3. Incubar en hielo durante 5 minutos.
4. Mezclar brevemente y centrifugar a 400 x g a 4 ° c por 2 min.
5. Después de Vortex, quite el sobrenadante y transferir a un tubo limpio de 1.5 mL nuevo; se trata de la fracción citoplasmática. Deseche los pellets.

5. nuclear aislamiento

1. Resuspender el precipitado del paso anterior con 200 μL de tampón de lavado de núcleos.
2. Centrifugar el tubo durante 2 min a 400 x g a 4 ° C.
3. Deseche el sobrenadante y repetir el lavado dos veces más.
   Nota: El lavado eliminará contaminación citoplásmica en la fracción nuclear.
4. Después del tercer lavado, Resuspender el precipitado en 100 μl de buffer 2.
5. Agitar la muestra vigorosamente a 4 ° c durante 30 minutos o bien, incubar la muestra en hielo y agitar cada 5 min.
6. Después de agitar, centrifugar la muestra 10 min a velocidad máxima (> 12.000 x g) y 4 ° C.
7. Después de Vortex, transferir el sobrenadante a un nuevo 1.5 limpio. tubo mL. Se trata de la fracción nuclear.

6. cuantificación de proteínas

Nota: Cuantificar las proteínas bicinchoninic ácido (BCA) proteína análisis kit. La concentración de proteínas en las fracciones que van entre 0.5 y 5 μg/μl, siendo menor en la fracción nuclear (ver tabla 2 para las concentraciones de la proteína resultantes de las biopsias de 2 mg).

1. Preparar una curva estándar con los siguientes albúmina de suero bovino (BSA) cantidad (μg)¹²: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.
2. Preparar los reactivos necesarios para utilizar 100 μl de la mezcla final de BCA por muestra.
3. Pipetear 2 μl de cada fracción de proteína en un plato bien 96, añadir la mezcla BCA y siga las instrucciones del fabricante para la lectura.

Resultados

La figura 1 muestra una hematoxilina eosina de una sección de la biopsia intestinal con las vellosidades intactas y las estructuras de la cripta.

Resultados representativos de fraccionamiento citoplasmática y nuclear mediante este protocolo se muestran en las figuras 2 y 3. En el experimento se muestra en la figura 2, un fresco (Fh) y u...

Discusión

El protocolo aquí descrito se utiliza para el fraccionamiento citoplasmático y nuclear de las biopsias intestinales. Las proteínas purificadas no son desnaturalizadas y puede ser utilizadas no sólo en el análisis de western blot como se muestra en la figura 2 y 3 y también en ensayos que requieren proteínas doblado nativo como inmunoprecipitación, análisis de cambio de movilidad electroforética (EMSA) o electroforesis en gel de poliacrilamida nativo (página).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-1kg
KCl	Sigma Aldrich	P9333-1kg
EDTA	Sigma Aldrich	E9884-100G
NaCl	Sigma Aldrich	5588886-1kg
DTT	Sigma Aldrich 10197777001
PMSF	Thermo Scientific	36978
Inhibidores de la proteinasa y la fosfatasa	Thermo Scientific	A32959
NP-40	Sigma Aldrich	CA-630	Detergente
Ensayo BCA	Thermo Scientific	23227	Kit de cuantificación de proteínas
Majas de plástico desechables	Sigma Aldrich	Z359947-100EA
Homogeneizador Dounce	VWR	431-0100
Microcentrífuga	Eppendorf	5415-R
Shacker	IKA	MS3 basic