Aquí, presentamos un protocolo para realizar un fraccionamiento celular simple para la separación subcelular de proteínas citoplásmicas y nucleares en biopsias intestinales humanas frescas y congeladas.
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Artículo de método
Fraccionamiento subcelular de especímenes gastrointestinales frescos y congelados
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El propósito de este protocolo es fraccionar tejido intestinal humano obtenido por endoscopia en compartimentos citoplásmicos y nucleares para el análisis de localización de proteínas específicas o complejos de proteína en Estados diferentes del tejido (es decir, saludable frente a la enfermedad). Este método es útil para el fraccionamiento de ambas muestras de tejido intestinal frescos y congelados; es fácilmente accesible para todos los laboratorios y no requiere mucho tiempo.
Introducción
Las proteínas participan en casi todas las funciones biológicas dentro de una célula y cualquier variación en su estructura, la cantidad o la ubicación puede conducir a un escenario de patógeno. Métodos de fraccionamiento de muestras de tejido son un método útil para reducir la complejidad de la enfermedad relacionados con el análisis de la proteína. Algunos estudios utilizan información de localización de la proteína o enriquecen una proteína de un compartimento celular específico, por lo que un protocolo reproducible fraccionamiento de proteínas intactas es útil para responder a ciertas cuestiones biológicas. Determinación de la localización subcelular de las proteí....
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Protocolo
Este estudio fue aprobado por el Consejo de ética de Hospital de Universitario de Cruces y los análisis se realizaron después de que se obtuvo consentimiento informado de todos los sujetos o a sus padres.
1. biopsia de la colección
Nota: Especímenes de la biopsia de duodeno distal de pacientes se obtienen durante la endoscopia de diagnóstico rutinaria gestión de biopsias que varían entre 2 y 10 mg de peso. Tejido hecho una biopsia es un tejido complejo compuesto por diversos tipos celulares incluyendo células epiteliales, inmunes y endoteliales. Gastroenterólogos clínicos realizan la endoscopia siguiente establecid....
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Resultados
La figura 1 muestra una hematoxilina eosina de una sección de la biopsia intestinal con las vellosidades intactas y las estructuras de la cripta.
Resultados representativos de fraccionamiento citoplasmática y nuclear mediante este protocolo se muestran en las figuras 2 y 3. En el experimento se muestra en la figura 2, un fresco (Fh) y u.......
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Discusión
El protocolo aquí descrito se utiliza para el fraccionamiento citoplasmático y nuclear de las biopsias intestinales. Las proteínas purificadas no son desnaturalizadas y puede ser utilizadas no sólo en el análisis de western blot como se muestra en la figura 2 y 3 y también en ensayos que requieren proteínas doblado nativo como inmunoprecipitación, análisis de cambio de movilidad electroforética (EMSA) o electroforesis en gel de poliacrilamida nativo (página).
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores reconocen la asistencia de Ander Lopez y Miren Telletxea para video grabación y edición. ACR es financiado por una beca de Ikerbasque y un proyecto de investigación de Asociación de Celiacos de Madrid (ACM). OCR es financiado por el proyecto ISCIII-PI16/00258 y cofinanciado por el Unión Europea FEDER/FSE "Una manera de hacer Europa". ES financiado por una subvención de proyecto de investigación 2015111068 del Departamento vasco de sanidad. IRG y AJM son apoyados por becas de beca predoctoral de la UPV/EHU y el Departamento vasco de educación, respectivamente.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich 10197777001 | ||
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Inhibidores de la proteinasa y la fosfatasa | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergente |
| Ensayo BCA | Thermo Scientific | 23227 | Kit de cuantificación de proteínas |
| Majas de plástico desechables | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Homogeneizador Dounce | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrífuga | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
Referencias
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).
- Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. Global, quantitative and ....
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Reimpresiones y permisos
