Aquí, presentamos un protocolo para confirmar la presencia de la mutación de punto para la diagnosis del amyloidosis de transthyretin hereditario, con Ala97Ser, la mutación más común endémica de Taiwán, por ejemplo.
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Artículo de método
El análisis genético de Transthyretin Ala97Ser hereditario relacionadas con amiloidosis
En este artículo
Resumen
Resumen
Las pruebas genéticas están la prueba más fiable para hereditaria por transtiretina relacionada con amiloidosis y debe realizarse en la mayoría de los casos del amyloidosis de transthyretin (ATTR). ATR es una enfermedad rara pero fatal con fenotipos heterogéneos; por lo tanto, la diagnosis se retrasa a veces. Con el aumento de atención y el reconocimiento más amplio de manifestaciones tempranas de atributos, así como tratamientos emergentes, estudios diagnóstico apropiados, incluyendo el genética del transthyretin (TTR) de prueba, para confirmar los tipos y variantes del ATR son por lo tanto fundamental para mejorar el pronóstico. Análisis genéticos con métodos de reacción en cadena (PCR) polimerasa confirman la presencia de mutaciones puntuales TTR mucho más rápido y más seguro que los métodos convencionales como la mancha blanca /negra meridional. Aquí, demostramos la confirmación genética de la mutación Ala97Ser ATTR, la mutación más común endémica de Taiwán. El protocolo consta de cuatro pasos principales: recogiendo muestras de sangre entera, la extracción de ADN, el análisis genético de los cuatro exones TTR con PCR y secuenciación de ADN.
Introducción
Amyloidosis de transthyretin (TTR) (ATTR) es la forma más común de amiloidosis sistémica hereditaria1y puede ser causado por una mutación autosómica dominante heredada en la del gene del transthyretin (TTR)2. Mutaciones de TTR desestabilizan la estructura de la proteína tetramérica y conducen a su disociación en monómeros que vuelve a montar en2de las fibrillas amiloideas. Más de 100 mutaciones de TTR amyloidogenic han sido reportados en todo el mundo1. Análisis genéticos con métodos de reacción en cadena (PCR) polimerasa confirman la presencia de la mutación de punto TTR y....
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Protocolo
Las pruebas realizadas en el laboratorio se llevó a cabo conforme a las prescripciones de los clínicos laboratorio mejora enmiendas (CLIA) de 1988, las normas aprobadas por el institucional de Junta de Chang Gung Memorial Hospital y Universidad (licencia no. 100 - 4470A3 y 104-2462A3). Se obtuvo consentimiento informado de todos los pacientes.
1. sangre recogida
- Recoja la sangre en tubos de tratados con EDTA disponibles comercialmente. Mezclar suavemente y almacenar la muestra de sangre a 4 ° C hasta el procesamiento.
2. ADN extracción de sangre periférica
Utilice un Kit ....
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Resultados
Electroforesis en agarosa de dos pacientes y bandas reveló individuales saludables uno de los tamaños previstos, incluyendo un producto PCR bp 454 para el exón 4 del gene de TTR (figura 1).
Figura 1 . Electroforesis en gel con PCR amplificaron el gen TTR. Normal: un indi.......
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Discusión
Hay dos pasos críticos en el protocolo. En primer lugar, para tener el suficiente número de glóbulos blancos, un espécimen de hemodiluted debe ser evitada11. En segundo lugar, el uso de adecuados primers PCR es fundamental para obtener resultados fiables12. Utilizamos la herramienta de la web de cartilla-BLAST para diseñar los primers4,13; debe cubrir un mínimo de 40 pares de bases en cada lado de los cuatro exones .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Deseamos agradecer a Miss Shin-Fun Wu por su ayuda en los experimentos. Este estudio fue apoyado por una beca del programa de investigación médica Chang Gung (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) y 100-4470A3 de la IRB, 104-2462A3, Taiwán.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos tratados con EDTA | BD | ||
| kit de extracción de ADN | , Stratagen | 200600 | |
| espectrofotómetro NanoDrop, ND2000 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Limpiaparabrisas para tareas delicadas | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| ADN polimerasa | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR gene intronic | Exón1 | F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3' | |
| Exón1 | R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3' | ||
| Exón2 | F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3' | ||
| Exon2 | R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGGGCAAA-3' | ||
| Exon3 | F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGTGTGT-3' | ||
| Exón3 | R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3' | ||
| Exón4 | F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3' | ||
| Exón4 | R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3' | ||
| termociclador | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| célula de electroforesis | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| escalera de ADN | Protech | PT-M1-100 | |
| colorante | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| secuenciador automático | ADN 3730xl de | Applied Biosystems |
Referencias
- Planté-Bordeneuve, V., Said, G. Familial amyloid polyneuropathy. The Lancet Neurology. 10 (12), 1086-1097 (2011).
- Planté-Bordeneuve, V., et al. Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study. Journal of Neurology. 264
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Reimpresiones y permisos
