Se describe un método para la generación de MLG-base condicionales mutantes precipitación usando CRISPR/Cas9 edición del genoma del falciparum del Plasmodium .
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Artículo de método
CRISPR/Cas9 Gene edición para hacer condicionales mutantes de humano parásito de la Malaria por p. falciparum
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Resumen
Resumen
La malaria es una causa significativa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Esta enfermedad, que afecta sobre todo a los que viven en regiones tropicales y subtropicales, es causada por infección con los parásitos Plasmodium . El desarrollo de medicamentos más eficaces para combatir la malaria puede acelerarse mediante la mejora de nuestra comprensión de la biología de este parásito complejo. Manipulación genética de estos parásitos es clave para entender su biología; sin embargo, el genoma de p. falciparum ha sido históricamente difícil de manipular. Recientemente, CRISPR/Cas9 edición del genoma ha sido utilizada en parásitos de la malaria, permitiendo para la proteína más fácil etiquetado, generación de caídas de proteína condicional y canceladura de los genes. La edición del genoma CRISPR/Cas9 ha demostrado para ser una poderosa herramienta para avanzar en el campo de la investigación de la malaria. Aquí, describimos un método CRISPR/Cas9 para generar MLG-base de mutantes condicionales precipitación en p. falciparum. Este método es altamente adaptable a otros tipos de manipulaciones genéticas, incluyendo proteína etiquetado y golpes de gracia del gene.
Introducción
La malaria es una enfermedad devastadora causada por parásitos protozoarios del género Plasmodium. P. falciparum, el parásito del paludismo humano mortal más, hace aproximadamente 445.000 muertes por año, sobre todo en niños menores de cinco1. Plasmodium parásitos tienen un ciclo de vida complicado con un vector mosquito y un hospedador vertebrado. En primer lugar los seres humanos se infectan cuando un mosquito infectado toma una comida de sangre. Luego, el parásito invade el hígado donde crece, se desarrolla y se divide por aproximadamente una semana. Después de este proceso, los parásitos se liberan en el torrente ....
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Protocolo
Continua el cultivo de p. falciparum requiere el uso de glóbulos rojos humanos, y se utilizaron comercialmente compradas unidades de sangre que fueron despojados de todos los identificadores y anonimizada. La Junta de revisión institucional y la oficina de seguridad de la biotecnología en la Universidad de Georgia revisaron nuestros protocolos y aprobaron todos los protocolos utilizados en nuestro laboratorio.
1. elegir un gRNA secuencia
- Ir a CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) y seleccione ' Fasta Target'. En 'Target', pegar los 200 pares de bases del extremo 3' del marco de lectura abierto (ORF) de ....
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Resultados
Figura 1muestra un esquema de lo plásmidos utilizados en este método, así como un ejemplo de una mutación de escudo. Como un ejemplo de cómo identificar parásitos mutantes después de transfección, resultados de PCRs para comprobar la integración de la construcción HA -MLG se muestran en la figura 2. Una imagen representativa de una clonación de la placa se muestra en la figura 3 para demostr.......
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Discusión
La implementación de CRISPR/Cas9 en p. falciparum tiene tanto aumentó la eficacia de y redujeron la cantidad de tiempo necesario para modificar el genoma del parásito, en comparación con los métodos anteriores de manipulación genética. Este protocolo integral esboza los pasos necesarios para la generación de mutantes condicionales utilizando CRISPR/Cas9 en p. falciparum. Mientras que el método está orientado específicamente para la generación de mutantes deMLG HA -, esta estrategia puede adapta.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos Muthugapatti Kandasamy en el centro de microscopia Biomédica de Universidad de Georgia (UGA) para asistencia técnica y Juan Jose Lopez-Rubio por compartir la plásmidos pUF1 Cas9 y pL6. Este trabajo fue apoyado por premios de la Fundación de arcos D.W.C. y H.M.K., otorga fondos de inicio UGA a V.M., subvenciones de la Fundación marcha de Dimes (Premio de investigación de albahaca o ' Connor arrancador erudito) a V.M. y nos institutos nacionales de salud (R00AI099156 y R01AI130139) a V.M. y (T32AI060546) a H.M.K.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | Compramos los que están envueltos individualmente |
| Acetato de Sodio | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Gift de Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| TPP Cultivo de Tejidos 6 Placas | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100 mm Placas de Cultivo de Tejidos (Placa de 12 mL) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP Cultivo de Tejidos 96 Placas | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Cultivo de Tejidos 24 Placas | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | ||
| T4 ADN polimerasa | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Unidad de filtro de tapa de botella Steritop | Millipore | SCGPU10RE | Puede usar cualquier tamaño que se adapte a sus necesidades |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Generado por el Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Regalo del Laboratorio Jose-Juan López-Rubio | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucosa | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Bicarbonato de sodio | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Piruvato de sodio | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hipoxantina | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
| Reactivo de gentamicina | Gibco | 15710-064 | |
| timidina | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | generado por el laboratorio de Muralidharan | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | generado por el laboratorio Muralidharan | ||
| NucleoSpin Gel y limpieza de PCR | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | Querrá probar algunos lotes para averiguar cuáles serán los parásitos en el mejor |
| Blood Cells Humans | Technologies Interstate Blood Bank, Inc | Envíe un correo electrónico o llámelos directamente para realizar un pedido | Por lo general, usamos la |
| línea de parásitos O + blood 3D7 | Disponible a pedido | N/A | |
| Caldo de lisogén (LB) | Fisher | BP1426-2 | Puede hacer el suyo propio, no es necesario usar exactamente este |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | Hacemos un caldo de 1000X a 100 mg / ml en agua y almacenamos en el -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University en St. Louis | Puede usar su control de carga preferido para Western blots. Este es justo el que usamos en nuestro laboratorio |
| Rat Anti-HA Clon 3F10, monoclonal | Made by Roche, vendido por Sigma | 11867423001 | Puedes usar tu anticuerpo anti-HA preferido |
| Tubos de 0,6 mL Fisher | AB0350 | ||
| Fisher HealthCare* PROTOCOLO* Hema 3* Sistema de tinción manual (fijador + solución I y II) | Fisher | 22-122-911 | También puede usar el tinte |
| de giemsaPortaobjetos de microscopio esmerilado premium de Fisherfines - Tamaño: 3 x 1 pulg. | Pescador | 12-544-3 |
Referencias
- World Health Organization. World Malaria Report. , World Health Organization. Geneva. (2017).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Florentin, A., et al.
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Reimpresiones y permisos
