Análisis de AtHIRD11 trastorno intrínseco y vinculante hacia los iones del Metal por electroforesis capilar y afinidad de electroforesis capilar

Las plantas son más dependientes de su entorno que muchas otras formas de vida. Puesto que las plantas no se pueden mover a otros lugares, tienen que adaptarse a los cambios en su entorno (por ejemplo, sequía, frías y altas concentraciones de sal). En consecuencia, las plantas superiores desarrollan proteínas estrés especializados como dehidrinas, que cumplan múltiples tareas para reducir el estrés celular relacionadas con alta salinidad. Estas proteínas unen el agua y los iones dentro de las células, reduce el estrés oxidativo atando Cu^{2 +}-los iones e interactuar con los fosfolípidos, así como los citoesqueletos. Además, enlace Zn^{2 +}-los iones permite a estas proteínas actuar como factores de transcripción. Su capacidad Ca^{2 +}-iones después de fosforilación también ha sido informaron¹.

El comportamiento de múltiples funciones de estas proteínas está relacionada con la ausencia de residuos de aminoácidos hidrofóbicos. En consecuencia, carecen de cualquier interacción hidrófoba dentro de la cadena peptídica y también una estructura restringida. Sin embargo, porque estas proteínas tienen una estructura restrictiva, que ocupan diferentes conformadores en las mismas condiciones. Por lo tanto, puede describir mejor como un conjunto de estructuras en lugar de una conformación única. Proteínas con estas propiedades se conocen como intrínsecamente desordenadas proteínas (IDP) son un concepto ampliamente utilizado para las proteínas de estrés y diafonía entre caminos diferentes en las células eucariotas².

Uno de estos desplazados internos relacionados con el estrés es AtHIRD11. Es uno de los desplazados de altamente expresada por sequía más de Arabidopsis thaliana. Por lo tanto, los diferentes conformadores pueden ser separados por su radio eficaz para cargar cociente y electroforesis capilar (CE) se ha utilizado para otras investigaciones. Experimentos anteriores ACE demostraron las interacciones entre los iones de metales de transición tales como Cu^{2 +}- Zn^{2 +}-, Co^{2 +}y Ni^{2 +}y AtHIRD11-iones. Los resultados detallados se pueden encontrar en Hara et al. ³ y Nachbar et al. ⁴.

El método ACE que se utilizará aquí se basa en nuestros anteriores trabajos publicados⁶. Sin embargo, la adición de la acetanilida marcador de EF a la muestra de proteína no es conveniente. AtHIRD11 muestra patrones de amplio pico, y agregar el marcador de EF a la muestra disimular dos picos. Por lo tanto, el marcador se utiliza para un funcionamiento independiente. Antes de que se examina el comportamiento del enlace, se confirma que los picos encontrados en experimentos anteriores son de diferentes conformadores. Así, CGE se utiliza para distinguir entre los Conformadores de la proteína, el poste-de translación modifica las proteínas y las impurezas, tales como fragmentos de AtHIRD11, por sus diferentes masas. Posteriormente, se investiga el comportamiento del enlace de la muestra de AtHIRD11 caracteriza a diversos iones metálicos diferentes.

El propósito de este artículo es describir una instalación experimental para distinguir entre un IDP y otros componentes de una muestra para evaluar las diferencias en el comportamiento del enlace de diferentes conformadores.

1. preparación de los instrumentos de electroforesis capilar

1. Preparar los tubos capilares
   1. Utilice un cortador de cristal para cortar un sílice fundido desnudo capilar con un revestimiento externo de poliamida y un diámetro interno de 50 μm a 33 cm (para el experimento de la CGE) y capilares largo 30 cm (para el experimento ACE). Realizar el corte en una placa de vidrio.
      Nota: Las 2 diferentes configuraciones experimentales fueron desarrolladas para 2 instrumentos diferentes. Con el fin de utilizarlos en otros instrumentos, la transferencia de un método apropiado deberá llevarse a cabo y la longitud del tubo capilar debe ser ajustada a la longitud permitida del instrumento.
   2. Utilice un lápiz para marcar el medio de una ventana de detección de ancho de 1 cm a una distancia de 24,5 cm de un extremo del tubo capilar para el experimento de la CGE y 21,5 cm de un extremo del tubo capilar para el experimento ACE (longitud efectiva).
   3. Retire el revestimiento externo de poliamida de los capilares por quemar con un soplete, 0.5 cm antes y después de la marca. Asimismo, use el soplete para quitar 1 cm de la capa en ambos extremos de los tubos capilares.
      Nota: La longitud efectiva puede variar ligeramente ya que se basa en el instrumento de electroforesis capilar.
   4. Limpiar los extremos de los tubos capilares y las ventanas de detección con un tejido suave y etanol.
      Nota: Sin recubrimiento de los tubos capilares son menos flexibles y capaces de romper.
2. Instalar los tubos capilares
   1. Instale un tubo capilar en el sistema de la CE con la ventana de detección cerca de la salida.
      Nota: Los modelos CE instrumento tienen sistemas de explotación diferente de los capilares. Consulte el manual del instrumento usado para las instrucciones exactas.

2. preparar las soluciones

1. Preparar las soluciones para el análisis de la CGE
   1. Preparar el tris (hidroximetil) aminometano (Tris)-búfer de SDS (100 mM/1% w/v) a pH 8.0.
      1. Use una máscara respiratoria y una cabina para peso de 1,00 g de sodio dodecil sulfato (SDS) en un vaso de precipitados de 100 mL.
      2. Añadir 1,21 g de Tris en el vaso de precipitados de 100 mL y disolver con 50 mL de agua desionizada y una barra de agitación magnética en un agitador magnético.
      3. Colocar un electrodo de pH de la solución y ajustar el pH a 8.0 con 1,0 M de HCl.
      4. Completa la solución en un matraz aforado de 100 mL y añadir agua desionizada hasta la marca. Sacúdelo suavemente para evitar cualquier formación de espuma.
   2. Preparar la solución de NaOH de 0.1 M.
      1. Pesar 4,0 g de NaOH en un matraz aforado de 100 mL. Llene hasta la marca con agua desionizada para hacer un caldo de 1 M.
      2. Utilice una pipeta de bulbo de 10 mL para transferir 10 mL de esta solución a otro matraz aforado de 100 mL y completar hasta la marca con agua desionizada.
   3. Preparar la solución de HCl de 0.1 M.
      1. Poner 10 mL de 10 M de HCl en un matraz aforado de 100 mL con una pipeta aforada de 10 mL y llenarlo con agua desionizada hasta la marca. Repita este paso para obtener el 0.1 M HCl.
   4. Preparar la solución muestra.
      1. Pesar 0.5 mg de la proteína en un tubo de 1 mL. Agregar 0,5 mL de la solución del gel de SDS Tris de paso 2.1.1 con una micropipeta.
      2. Disolver la proteína agitando suavemente para evitar cualquier formación de espuma y la degradación de la proteína.
         Nota: Ultrasonidos de uso si la proteína no puede ser disuelto como se describe; evitar un calentamiento de la solución.
   5. Llene las soluciones en los frascos.
      1. Filtrar cada solución a través de un 0.22 μm del fluoruro del polivinilideno (PVDF) del filtro utilizando una jeringa adecuada directamente en el frasco.
         Nota: Para las soluciones que contienen el gel, la presión puede ser alta debido a su alta viscosidad.
      2. Preparar 15 frascos en total y marque cada uno para evitar cualquier confusión.
         1. Llenar 3 frascos con un búfer de gel comercialmente disponible sodio dodecil sulfato (SDS) a pH 8.
            Nota: El uso de un búfer disponible comercialmente de gel SDS proporciona resultados más precisos.
         2. Llenar 1 frasco con 0,1 M NaOH y 1 frasco con 0,1 M de HCl para el enjuague.
         3. Llenar 1 cubeta con la solución de la muestra.
         4. Llenar 5 cubetas con agua desionizada y 4 frascos con 0,1 mL de agua desionizada (sumergir los frascos).
            Nota: Los frascos que se utilizan como residuos viales durante el lavado del tubo capilar antes de cada carrera. Los extremos del capilares se sumergen en agua para enjuagar los residuos de gel.
2. Preparar las soluciones para el análisis de as
   1. Preparar la solución de NaOH de 1 M.
      1. Pesar 4,0 g de NaOH en un matraz aforado de 100 mL.
      2. Llene hasta la marca con agua desionizada para hacer un caldo de 1 M.
   2. Preparar el 0.1 M ethylendiaminetetraacetic ácido (EDTA) en una solución de NaOH de 0.1 M.
      1. Transferir 10 mL de 0,1 M NaOH en un matraz aforado de 100 mL con una pipeta de bulbo de 10 mL. Llene hasta la marca con agua desionizada.
      2. Pesa 2,42 g de EDTA en un barco pesado y disolver el compuesto sólido en 100 mL de 0,1 M NaOH.
   3. Preparar el tampón Tris (30 mM).
      1. Añadir 3,63 g de Tris, 200 mL de agua desionizada y una barra de agitación en un vaso de precipitados de 500 mL. Coloque el vaso sobre un plato de agitar y enciéndalo.
      2. Poner un electrodo medidor de pH en el vaso y ajustar el pH a 7.4 con 0.1 M de HCl.
      3. Llene la solución en un matraz aforado de 1 L y llenar hasta la marca con agua desionizada.
         Nota: Este procedimiento debe repetirse o un matraz aforado de mayor es necesario puesto que es necesario más de 1 L para el análisis conjunto.
   4. Preparar el flujo electroosmotic de acetanilida (EF)-solución de marcador (60 μm).
      1. Añadir 6 mg de acetanilida y 100 mL de tampón Tris en un matraz aforado de 100 mL.
      2. Poner el matraz volumétrico en un baño de ultrasonidos y accionarlo durante 30 minutos.
   5. Preparar la solución de muestra (1 mg/mL).
      1. Poner un tubo de microcentrífuga de 0, 5 mL en una balanza de precisión y añadir 0,3 mg de polvo liofilizado de AtHIRD11 en el tubo.
      2. Utilice una micropipeta para agregar 0,3 mL de un tampón de Tris de 30 mM (pH 7,4) en el tubo. Agitar el tubo cuidadosamente para disolver la proteína.
   6. Preparar las soluciones de ligando.
      1. Preparar la solución madre de CaCl₂ (5 mM).
         1. Tomar un barco pesado, poner en una balanza analítica y pesar de 36,76 mg de CaCl₂* H₂O.
         2. Utilizando una micropipeta, purgue el CaCl₂* H₂O desde el pesaje del barco en un matraz aforado de 50 mL con el tampón de Tris previamente preparado.
         3. Llene el matraz aforado con el tampón de Tris hasta la marca.
      2. Preparar las soluciones stock restantes (5 mM).
         1. Repita el paso 2.2.6.1 usando el otro metal sales en lugar de CaCl₂* H₂O [MgCl₂: 23,80 mg, volver₂: 26,02 mg, Sr (NO₃)₂: 52,91 mg, MnCl₂: 31,46 mg, SeCl₄: 52,91 mg, CoCl ₂* 2 H₂O: 41,47 mg, CuCl₂* 2 H₂O: 42,62 mg, vivencias₂: 3,41 mg y NiCl₂* 6 H₂O: 59,43 mg].
            Nota: La vivencias₂ solución tiene una concentración de 0.5 milímetros. Ya que se observaron fuertes interacciones entre los iones y la pared interna del capilar, la concentración fue reducida por un factor de 10⁴.
      3. Preparar la solución 500 μm CaCl₂ .
         1. Completa 10 mL de la solución madre de CaCl₂ y ponerlo en un matraz aforado de 100 mL.
         2. Llene el matraz aforado con un tampón de Tris a la marca y agite el frasco.
      4. Preparar la solución de 250 μm CaCl₂ .
         1. Completa 5 mL de la solución madre de CaCl₂ y ponerlo en un matraz aforado de 100 mL.
         2. Llene el matraz aforado con un tampón de Tris a la marca y agite el frasco.
      5. Repita pasos 2.2.6.3 y 2.2.6.4 las otras soluciones.
   7. Llene las soluciones en los frascos.
      Nota: Cada ejecución repetida tiene un conjunto de viales de entrada y salida. El uso de soluciones frescas ligando a la entrada y salida reduce los cambios en tiempo de la migración después de cada carrera.
      1. Llene la solución 250 μm CaCl₂ en jeringa de 10 mL.
      2. Poner un filtro PVDF 0.22 μm en la jeringa y empuje 2 mL de la solución a través del filtro con la jeringa para descartar esta solución filtrada.
      3. Llenar 10 cubetas hasta el volumen máximo permitido con residuo 250 μm CaCl₂ de la solución de la jeringa. Marque cada uno como vial entrada CaCl ₂ solución de 250 μm.
      4. Llenar 10 cubetas hasta que estén lleno hasta la mitad con la solución de₂ 250 μm CaCl. Marque cada uno como 250 μm CaCl ₂ solución salida vial.
      5. Repita los pasos 2.2.7.1 - 2.2.7.4 para las otras soluciones que contengan sal de metal.
      6. Repita los pasos para cada par de viales de entrada y salida utilizando el tampón de Tris (pH 7.4) de 30 mM en lugar de otro.
         Nota: Lo 30 mmol/L tampón Tris, pH 7.4 se utiliza entre las carreras con el fin de obtener los datos de tiempo de migración de la proteína en ausencia de iones metálicos. Es necesario para descuidar cambios en las expresiones del folclore.
      7. Repita los pasos anteriores para un frasco utilizando la acetanilida solución de EF-marcador (60 μm) en su lugar. También, repita estos pasos con la solución de muestra (1 mg/mL) en lugar de otro.

3. capilar Gel separación electroforética

Nota: Preparar la separación según el método descrito en trabajos previos por Nachbar et al. ⁴.

1. Preparar el análisis
   1. Condición del tubo capilar
      1. Ajuste el termostato a 23 º C.
      2. Enjuague capilar de 10 minutos a 2,5 bar con 0,1 M NaOH.
      3. Enjuague capilar durante 5 minutos a 2,0 bar con 0.1 M de HCl.
      4. Enjuague el tubo capilar de 2 min a 2.0 bar con agua desionizada.
   2. Llenar el buffer del gel de SDS
      1. Llenar un tubo capilar de 10 minutos a 2,0 bar con el tampón de gel SDS comercialmente disponible a pH 8.0.
   3. Al ras del tubo capilar antes de cada ejecución de separación
      1. Enjuague el tubo capilar de 3 min a 4.0 bar con 0,1 M NaOH.
      2. Enjuague el tubo capilar de 1 min en 0.1 M HCl 4.0 bar.
      3. Enjuague el tubo capilar de 1 min a 4.0 bar con agua desionizada.
      4. Enjuague capilar de 10 minutos en el bar 4.0 con el buffer del gel de SDS.
2. Ejecute la separación
   1. Inyecte la solución de la muestra para los experimentos CGE (paso 2.1.4) hidrodinámico aplicando 0,1 bar durante 4 min en la entrada.
   2. Aplicar-16.5 kV y una presión de 2,0 bar en ambos extremos del tubo capilar durante 25 minutos.

4. afinidad análisis electroforético capilar

Nota: Preparar la separación según el método descrito en trabajos previos por Nachbar et al. ⁴ y Alhazmi et al. ⁵.

1. Condición del tubo capilar
   1. Ajuste el termostato a 23 º C.
      Nota: La temperatura se utiliza según protocolos publicados y se puede cambiar a otras temperaturas^4,5. Sin embargo, las interacciones son dependientes de la temperatura y cambian en consecuencia.
   2. Enjuague capilar durante 40 minutos a 2,5 bar con 0,1 M NaOH.
   3. Enjuague capilar 10 min a 1,0 bar con agua desionizada.
   4. Enjuague capilar durante 30 min a 1,0 bar, con un tampón de Tris de 30 mM (pH 7,4).
2. Preparación para las modalidades ACE
   1. Prepare el método para las mediciones sin ligandos.
      Nota: Acetanilida no fue agregado a la solución de la muestra, mientras que disfraza 2 picos de proteínas.
      1. Enjuague el tubo capilar de 1 min a 2,5 bar con una solución de EDTA de 0.1 M.
      2. Enjuague el tubo capilar de 1 min a 2,5 bar con agua desionizada.
      3. Enjuague capilar durante 1,5 minutos a 2,5 bar con un tampón de Tris para equilibrar.
      4. Inyecte la solución de acetanilida para 6 s a 0,05 bar y cambio la entrada y salida viales a los frascos de buffer Tris.
      5. Aplicar 0.05 bar para 2.4 s con el fin de impulsar la solución de acetanilida desde la punta del capilar más interior.
      6. Aplicar 10.0 kV de 6 min y detectar el pico de la acetanilida en una longitud de onda de 200 nm.
      7. Repita los pasos 4.2.1.1. -4.2.1.6. utilizando la proteína de la muestra en lugar de la solución de acetanilida y detectar todos los picos de proteínas.
   2. Prepare el método para las mediciones con ligandos.
      1. Enjuague el tubo capilar de 1 min a 2,5 bar con una solución de EDTA de 0.1 M.
      2. Enjuague el tubo capilar de 1 min a 2,5 bar con agua desionizada.
      3. Enjuague capilar durante 1,5 minutos a 2,5 bar con la solución ligando para equilibrar.
      4. Inyecte la solución de acetanilida para 6 s a 0,05 bar y cambio la entrada y salida viales a los frascos de búfer que contiene el ligando.
      5. Aplicar 0.05 bar para 2.4 s con el fin de impulsar la solución de acetanilida desde la punta del capilar más interior.
      6. Aplicar 10.0 kV de 6 min y detectar el pico de la acetanilida en una longitud de onda de 200 nm.
      7. Repita los pasos 4.2.2.1 - 4.2.2.6 usar la muestra de proteína en lugar de la solución de acetanilida y detectar todos los picos de proteínas.
   3. Repita los pasos del 4.2.1 y 4.2.2 alternativamente para calcular el cambio en las proporciones de tamaño de carga de las diferentes interacciones proteína-metal ion (descritas en Resultados del representante).
      1. Cambiar la solución de proteína después de cada 60 h a una nueva versión.
         Nota: en este punto, el experimento puede pausarse. Este procedimiento es repetido por lo menos 10 x para cada concentración de los ligandos puesto que el patrón pico varía ligeramente de corrida a corrida. Si la solución se utiliza más de 60 h, las variaciones se convierten en demasiado grandes.
   4. Ejecutar los métodos de
      1. Ejecutar el método descrito en el paso 4.2.2, utilizando las soluciones de ligando de tierra alcalina (CaCl₂, MgCl₂, volver₂y SrCl₂ soluciones).
      2. Siga usando el método descrito en el paso 4.2.2, usando el MnCl₂, SeCl₄, CoCl₂, CuCl₂, vivencias₂y NiCl₂ soluciones en lugar de las soluciones de ligando de tierra alcalina.
         Nota: Los cloruros de metales de transición este último demostraron las interacciones más fuertes con el capilar y no pueden extraerse completamente. Estas interacciones dan como resultado cambios en el tiempo de la migración de corrida a corrida. En consecuencia, fueron investigados después de otros iones metálicos.

La figura 1 muestra el electroferograma para la muestra de AtHIRD11 obtenida durante los experimentos de la CGE. El tamaño del péptido aumenta de izquierda a derecha. Máximo número 4 tiene la masa más grande e indica la proteína intacta. Los picos más pequeños 2 y 3 representan las impurezas más pequeñas (por ejemplo, productos de degradación). El primer pico y la inconsistencia de la línea de fondo antes también podrían ser reproducidos sin la muestra de proteína. Por lo tanto, se relaciona con el SDS del gel sí mismo y no representa las impurezas asociadas muestra.

Figura 2 representa el electroferograma para acetanilida durante los experimentos ACE. La solución de acetanilida muestra sólo 1 pico alto ya que no debe tener impurezas. El tiempo de detección para el pico máximo indica el tiempo de migración del flujo electroosmotic (EOFde t) y se utiliza para el cálculo de la interacción.

Figura 3 es el electroferograma de la muestra AtHIRD11 durante el experimento ACE en la ausencia de SDS y los iones del metal. Muestra, además de las 2 impurezas desde el electroferograma CGE, al menos 5 picos que corresponden a la proteína sí mismo. Pico 1 y 2 se puede asignar a las impurezas desde sus épocas de migración indican que son pequeñas o muy positivamente cargado. Esta hipótesis es apoyada por el aumento de la altura máxima y el área con el tiempo. Picos de AtHIRD11 3 y 4 son cerca de las EF, apenas pagan y no se puede separar en cada plazo. Casi no demuestran interacciones y representan conformaciones sin esenciales para las interacciones con los iones del metal accesibles residuos. AtHIRD11 muestra varios cargos-a-tamaño-relaciones diferentes debido a diferentes radios efectivos de diferentes conformadores. Estos conformadores pueden combinar continuamente. Posteriormente, son más amplios que los picos de proteínas generalmente picos de 5-7. Los picos grandes dan un toque en la cinética de las interacciones. Puesto que los picos no son estrechas, pueden excluirse un ayuno y una conversión muy lenta entre los diferentes conformadores. En ambos casos, los picos sería separado de línea de base4. En este caso, un paso preequilibrado puede cambiar el patrón de pico y daría una mejor penetración en las interacciones con cinética más lenta.

La figura 4 muestra que la evaluación gráfica de la época de migración medida cambia en presencia de varios iones metálicos para pico 6. Está representado por el valor calculado ΔR/Rf. Este valor indica qué tan fuerte es un cambio (por su valor) y el cambio total de la carga de complejos de proteína-metal iones (por su signo). Con el fin de diferenciar entre una interacción significativa y un cambio casual, los intervalos de confianza de α = 0.05 se calculan así. En casos donde el intervalo de confianza no es intersección con la línea cero, la interacción se considera tan importante. Resultados son tenidos en cuenta si el pico estaba presente en al menos 6 de 10 electropherograms. Pico 6 no estaba presente en cualquier funcionamiento con 500 μm Co2 +. La lista completa de las interacciones para cada pico AtHIRD11 es publicada en un trabajo anterior por Nachbar et al. 4.

ΔR/Rf se calcula usando los cocientes de tiempo de migración R (en presencia de ligando) y los cocientes de tiempo de migración Rf (en ausencia de ligando):

R y Rf se calculan utilizando el pico superior veces tproteína para los picos de la muestra de proteína y el correspondiente tiempo superior de pico para el marcador EF tEF:

R, los tiempos en presencia del ligando son usados y para Rf, veces en ausencia.

Figura 1 : Electroferograma para la separación de la CGE de la muestra de AtHIRD11 en gel buffer. Pico 1 y los picos a su izquierda se pueden observar incluso sin una inyección de la muestra, por lo que son artefactos. Desde las masas y la general las áreas pico de pico 2 y 3 son más pequeñas que el de pico 4, son las impurezas probables, tales como productos de degradación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Electroferograma de la acetanilida EF-marcador ejecutar. La figura muestra sólo 1 pico para el compuesto sin buffer del gel de SDS y los iones del metal. El tiempo de la parte superior del pico marca el flujo electroosmotic. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Ejemplo de un electroferograma de la separación de la muestra durante los experimentos ACE que demuestra un patrón complejo de pico en la ausencia de cualquier metal iones. Por lo menos 7 picos podrían identificados y relacionados con la proteína y sus 2 impurezas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Evaluación gráfica del comportamiento del enlace hacia los iones del metal investigados utilizando una concentración de 500 μm de pico 6. Los valores de ΔRRf dará una pista sobre la intensidad del cambio de tiempo de migración y por lo tanto, fuerza de los cambios conformacionales en el atascamiento del ion del metal. El signo de ΔRRf indica si el complejo es más positivamente o negativamente cargado en comparación con la proteína independiente. Las barras de error indican los intervalos de confianza de α = 0.05. Posteriormente, muestran el área donde el verdadero ΔR/Rf-valor puede encontrarse con una certeza del 95%. Las barras rojas indican los resultados calculados obtenidos por datos insuficientes (el pico estaba presente en menos de 6 electropherograms). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.