Análisis de AtHIRD11 trastorno intrínseco y vinculante hacia los iones del Metal por electroforesis capilar y afinidad de electroforesis capilar

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la tectónica de las proteínas de desorden intrínseco, como los cambios conformacionales debidos a la unión de metales y hierro. La principal ventaja de esta técnica es que requiere muy poco equipo y los resultados se pueden obtener muy rápidamente. El demostrador del procedimiento estará a cargo de Matthias Stein, un estudiante de posgrado de mi laboratorio.

Para comenzar, use un cortador de vidrio en una placa de vidrio para cortar un capilar de sílice fundida desnudo con un recubrimiento externo de poliamida y un diámetro interior de 50 micras en longitudes de 33 y 30 centímetros. Utilice un bolígrafo para marcar el centro de una ventana de detección de un centímetro de ancho a una distancia de 24,5 centímetros de un extremo del capilar para el experimento CGE y a 21,5 centímetros de un extremo del capilar para el experimento ACE. Con un soplete, queme el recubrimiento externo de poliamida 0,5 centímetros antes y después de cada marca.

Del mismo modo, utilice el soplete para eliminar un centímetro del recubrimiento en ambos extremos de los capilares. A continuación, utilice etanol y un pañuelo blando para limpiar los extremos de los capilares y las ventanas de detección. Instale un capilar en el sistema CE con la ventana de detección cerca de la salida.

Después de preparar las soluciones, de acuerdo con el protocolo de texto, use una solución de cloruro de calcio de 250 micromolares para llenar una jeringa de 10 mililitros. A continuación, coloque un filtro de PVDF de 0,2 micras en la jeringa y empuje 2 mililitros de la solución a través del filtro para desecharla. Utilice el cloruro de calcio restante en la jeringa para llenar 10 viales hasta el volumen máximo permitido.

Etiquete cada vial como un vial de entrada de solución de cloruro de calcio de 250 micromolares. A continuación, con la solución de cloruro de calcio, llene 10 viales hasta la mitad. Marque cada uno como vial de salida de solución de cloruro de calcio de 250 micromolares.

Luego, con otras soluciones que contengan sal metálica, llene los viales de manera similar. Además, para cada par de viales de entrada y salida, utilice 30 micromolares Tris Buffer para preparar un conjunto similar de viales de entrada y salida. Con el marcador EOF de acetanilida de 60 micromolares, llene 10 viales.

A continuación, utilice la solución de muestra de un miligramo por mililitro para llenar un vial. Después de preparar el análisis, de acuerdo con el protocolo de texto, ejecute la separación inyectando hidrodinámicamente la solución de muestra para los experimentos CGE y aplicando 0,1 bar durante cuatro minutos en la entrada. A continuación, aplique 16,5 kilovoltios negativos y una presión de 2,0 bar en ambos extremos del capilar durante 25 minutos.

Después de preparar el método para las mediciones sin ligandos, prepare el método para las mediciones con ligandos utilizando primero una solución de EDTA 0,1 molar para enjuagar el capilar a 2,5 bar durante 1 minuto. Luego use agua desionizada para enjuagar el capilar. A continuación, equilibre el capilar utilizando una solución de ligando para enjuagarlo a 2,5 bar durante 1,5 minutos.

A continuación, inyecte la solución de acetanilida a 0,05 bar durante 6 segundos y cambie los viales de entrada y salida por los viales tampón que contienen ligando. Aplique 0,05 bar durante 2,4 segundos para empujar la solución de acetanilida más adentro desde la punta del capilar. Aplique 10,0 kilovoltios durante 6 minutos y detecte el pico de acetanilida del activo a una longitud de onda de 200 nanómetros.

Después de enjuagar el capilar con agua desionizada con EDTA y la solución de ligando, como antes, inyecte la muestra de proteína y cambie los viales de entrada y salida por viales tampón que contengan ligando fresco. Alternativamente, repita la toma de medidas con y sin ligandos. Luego, repita el método usando las soluciones de ligando alcalinotérreo.

Por último, utilice las siguientes soluciones para llevar a cabo el mismo método. A continuación, calcule el cambio en las proporciones de tamaño de carga para las diversas interacciones de iones metálicos de proteínas. Aquí se muestra el electroferograma de la muestra de AtHIRD11 obtenida durante los experimentos CGE.

El tamaño del péptido aumenta de izquierda a derecha. El pico número cuatro tiene la masa más grande e indica la proteína intacta. Los picos más pequeños, dos y tres, representan impurezas más pequeñas.

Esta figura representa el electroferograma de acetanilida durante los experimentos ACE. La solución de acetanilida muestra solo un pico alto, ya que no debería tener impurezas. El tiempo de detección para el pico máximo indica el tiempo de migración del flujo electroosmótico y se utiliza para el cálculo de la interacción.

Este electroferograma de la muestra de AtHIRD11 durante el experimento ACE se realizó en ausencia de SDS e iones metálicos. Además de las dos impurezas del electroferograma CGE, están presentes al menos cinco picos, que están relacionados con la propia proteína. Aquí se muestra una evaluación gráfica de los cambios de tiempo de migración medidos en presencia de los diversos iones metálicos para el pico seis.

Se representa mediante el valor calculado Delta R sobre RF. Cada resultado indica la intensidad de un cambio por su valor y su signo, indicados por el cambio general en la carga de los complejos de iones metálicos de la proteína. Una vez dominada, la técnica se puede realizar para un compañero de interacción en ocho horas, incluida la interacción CGE, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar cambiar las soluciones de proteínas para mediciones a largo plazo, ya que los productos de degradación pueden aumentar con el tiempo y cambiar las soluciones de Tris Buffer para obtener resultados más precisos.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo cortar y limpiar un capilar, así como configurar un método de electroforesis capilar de afinidad, para evaluar el comportamiento de unión de proteínas intrínsecas desordenadas.