Aquí, mostramos cómo hacer un análisis de proximidad de la ligadura (PLA) visualizar heterodimerization MST1/MST2 en células fijas con alta sensibilidad.
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Artículo de método
Detección de Heterodimerization de isoformas de la proteína usando un análisis de ligadura in Situ proximidad
En este artículo
Resumen
Resumen
Las interacciones proteína-proteína regulada están un principio rector de muchos eventos de señalización, y la detección de este tipo de eventos es un elemento importante en la comprensión de cómo estas vías están organizadas y cómo funcionan. Hay muchos métodos para detectar las interacciones proteína-proteína en las células, pero relativamente pocos pueden utilizarse para detectar interacciones entre proteínas endógenas. Un tal método, el análisis de ligadura de proximidad (PLA), tiene varias ventajas para recomendar su uso. En comparación con otros métodos comunes de análisis de interacción de proteínas, PLA tiene relativamente alta sensibilidad y especificidad, se puede realizar con la manipulación mínima de la célula y en el protocolo descrito en este documento, requiere sólo dos específico del destino anticuerpos derivan de diferentes especies (por ejemplo., de ratón y conejo) y un reactivo especializado: un conjunto de anticuerpos secundarios que son oligonucleótidos covalentemente ligados a determinado que, cuando muy cerca uno del otro, crear un plataforma amplificable en situ PCR o amplificación de círculo rodante. En esta presentación mostramos cómo aplicar la técnica PLA para visualizar cambios en proximidad MST1 y MST2 en células fijas. La técnica descrita en este manuscrito es particularmente aplicable para el análisis de estudios de señalización de la célula.
Introducción
Interrupción de señalización MST1/Hippo ha estado ligada a trastornos del desarrollo y carcinogénesis1. En mamíferos, se activan las quinasas MST1 y MST2 (fosforilan) MOB1 y LATS1/2, el último de los cuales luego fosforila y hace inactivo el coactivador transcripcional de la proteína asociada a Yes (YAP)2. En su forma activa (unphosphorylated), YAP tiene actividad oncogénica, mejorar la transcripción de genes de proliferación celular; por el contrario, cuando YAP es inactivado por la vía de Hippo, se suprime la proliferación celular y apoptosis promovido3. En los tejidos, MST1 y MST2 existen princ....
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Protocolo
1. preparación de soluciones
- Preparar solución de fijación: 4% paraformaldehido (PFA) en PBS 1 x. Para 10 mL, tomar 2.5 mL de 16% PFA y agregar 7,5 mL de PBS 1 x.
Peligros: PFA es carcinogénico a dosis bajas. Los vapores y el contacto con la piel son peligrosos. Almacenar a-20 ° C. - Preparar solución de permeabilización: 0,1% Tritón X-100 en PBS 1 x. Para 100 mL de solución, añada 100 μl de Tritón X-100 en 100 mL de 1 x PBS. Almacenar a temperatura ambiente (RT).
- Preparar el tampón de lavado: 1 x TBST. Para 1 L, tomar 100 mL de 10 x TBS y 890 mL de dH2O 10 mL de Tween 20 (10%).
- Preparar solución de ....
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Resultados
Se utilizó el ensayo PLA para probar la interacción entre MST1 y MST2 en HEK-293 y iHSC. Las células eran fijos, permeabilized y teñidas con anticuerpos diferentes, seguidos de amplificación en situ según el protocolo PLA (figura 1). Para documentar el nivel de heterodimerization MST1/MST2, las células fueron teñidas con anticuerpos MST1 y MST2 (figura 1A, 1C y 1 G). Como control positivo, también utiliz.......
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Discusión
Nos pareció útil portaobjetos de la cámara para este experimento, ya que es muy conveniente realizar el experimento con varias líneas de celulares (14-16) y no hay necesidad de cambiar la muestra cada vez que durante el análisis de microscopía. Pueden surgir algunas complicaciones, tales como un mayor riesgo de contaminación cruzada con los anticuerpos. Por lo tanto, sugerimos lavar cada pozo individual en lugar de utilizar un frasco de Coplin, a pesar de la mayor duración del experimento. Además, la remoción del inserto.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Agradecimientos
Agradecemos al laboratorio de Chernoff todo para contribuir a la optimización y validación de este protocolo, en particular María Radu y Galina Semenova. También agradecemos a Andrey Efimov de la instalación de la proyección de imagen de celular en el Fox Chase Cancer Center. Este trabajo fue financiado por una subvención del NIH (R01 CA148805) a JC.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Portaobjetos de cámara | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 pocillos, portaobjetos de vidrio Sonda |
| PLA Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contiene 1x Solución de bloqueo, 1x anticuerpo Diluyente Sonda |
| PLA Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contiene 1x Solución de bloqueo, 1x Anticuerpo Diluyente |
| Tampones de lavado, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contiene tampón de lavado A y tampón de lavado B |
| montaje con reactivos de detección de DUO82040 | Sigma-Aldrich | ||
| DUO92008 rojo | Sigma-Aldrich | Contiene 5 veces la ligasa, 1 ligasa, 5 veces el rojo de amilificación, 1 polimerasa | |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) | Señalización celular | 9102s | |
| Fosfo-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Célula Señalización | 5726s | anticuerpo pERK |
| anticuerpo MST2 | Señalización celular | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | Anticuerpo MST1 |
| 16% Paraformaldehído | Ciencias de la microscopía electrónica | 15710 | Diluido al 4% de PFA en PBS para solución de fijación |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | Para preparar Triton x-100 al 0,1 % en 1xPBS para la solución de permeabilización |
| Microscopía confocal | Leica TCS SP8, 63x | Análisis de imágenes con el software ImageJ |
Referencias
- Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J.
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Reimpresiones y permisos
