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Artículo de método

Formación de Biofilm oral sobre diferentes materiales para implantes dentales

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DOI:

10.3791/57756

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24 de junio de 2018

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1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo, 2Department of Restorative Dentistry, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la formación de biofilm oral sobre materiales de titanio y zirconio para pilares de prótesis dental, incluyendo el análisis de la viabilidad de las células bacterianas y características morfológicas. Un modelo en situ asociado con técnicas de microscopía de gran alcance se utiliza para el análisis de biofilm oral.

Resumen

Implantes dentales y sus componentes protésicos son propensos a la colonización bacteriana y formación de biopelículas. El uso de materiales que proporciona la adherencia microbiana baja puede reducir la prevalencia y progresión de enfermedades peri-implante. Teniendo en cuenta el medio ambiente oral oral y complejidad biofilm heterogeneidad, microscopia se necesitan técnicas que puede hacer un análisis de biofilm de las superficies de los dientes y materiales dentales. Este artículo describe una serie de protocolos implementados para comparar la formación de biofilm oral sobre titanio y materiales cerámicos de aditamentos protésicos, así como los métodos de análisis de biopelículas orales a nivel morfológico y celular. El modelo en situ para evaluar la formación de biofilm oral sobre materiales de titanio y zirconio para pilares de prótesis dentales como se describe en este estudio ofrece una satisfactoria preservación de la biopelícula de 48 h, lo que demuestra la adecuación metodológica. Microscopía multifotón permite el análisis de un representante del área de la biopelícula formada en la prueba de materiales. Además, el uso de fluoróforos y el procesamiento de las imágenes mediante microscopía multifotón permiten el análisis de la viabilidad bacteriana en una población muy heterogénea de microorganismos. La preparación de muestras biológicas para microscopia electrónica promueve la preservación estructural de biofilm, imágenes con buena resolución y sin artefactos.

Introducción

Biofilms bacterianos son complejos, funcionalmente y estructuralmente organizada las comunidades microbianas, caracterizado por una diversidad de especies microbianas que sintetizan una matriz extracelular polímero biológicamente activo1,2. La adhesión bacteriana a superficies bióticas o abióticas es precedida por una formación de la película adquirida, que consiste en principalmente glicoproteínas salivales1,3,4. Débiles interacciones fisicoquímicas entre los microorganismos y la película son inicialmente establecidas y seguidas por fuertes interacciones adhesinas bacterianas y receptores de la glicoproteína de la película adquirida. Diversidad microbiana aumenta gradualmente a través de la coaggregation de los colonizadores secundarios a los receptores de las bacterias ya atados, formando una comunidad de especies1,3,4, 5.

Homeostasis de la microbiota oral y su relación simbiótica con el hospedero es importante en el mantenimiento de la salud oral. La disbiosis dentro de los biofilms orales pueden aumentar el riesgo para el desarrollo de caries y enfermedad periodontal2,5. Estudios clínicos demuestran una relación de causa y efecto entre la acumulación de biofilm en los dientes o implantes dentales y el desarrollo de gingivitis o peri-implante mucositis6,7. La progresión del proceso inflamatorio conduce a peri-implantitis y la consiguiente pérdida del implante8.

Implantes dentales y sus componentes protésicos son propensos a la colonización bacteriana y biofilm formación9. El uso de materiales con una composición química y la topografía de la superficie que proporciona la adherencia microbiana baja puede reducir la prevalencia y progresión de peri-implante enfermedades9,10. El titanio es el material más utilizado para la fabricación de aditamentos protésicos para implantes; sin embargo, los materiales cerámicos fueron introducidos recientemente y están ganando popularidad como una alternativa al titanio debido a sus propiedades estéticas y biocompatibilidad11,12. También importante, materiales de cerámica se han asociado con un potencial supuestamente reducido a adherirse a los microorganismos, principalmente debido a su rugosidad, la humectabilidad y la energía libre superficial10,13.

Estudios in vitro han contribuido a importantes avances en la comprensión de la adherencia microbiana a pilar protésico superficies9,14,15,16,17. Sin embargo, el dinámico ambiente de la cavidad oral, caracterizado por sus diversos temperatura y pH y la disponibilidad de nutrientes, así como por la presencia de las fuerzas de corte, no es reproducible en vitro protocolos experimentales18, 19. Para superar este problema, una alternativa es el uso de modelos en situ de la formación de biofilm, que ventajosamente conserva su estructura tridimensional para ex vivo análisis10,20, 21 , 22 , 23 , 24.

El análisis de la compleja estructura del biofilm formado sobre sustratos orales requiere el uso de técnicas de microscopía de ópticamente denso materia25. Microscopía multifotón láser es una opción moderna para biofilm análisis estructural26. Se caracteriza por el uso de la óptica no lineal con una fuente de iluminación cerca de la longitud de onda infrarroja pulsada a femtosegundos27. Este método está indicado para la adquisición de imágenes de Autofluorescencia o materiales marcados por fluoróforos, además de imágenes generadas por señales ópticas no lineales derivadas de un fenómeno conocido como segunda generación armónica. Entre las ventajas de la microscopía multifotón es la profundidad de la imagen obtenida con células mínimo daño causado por la intensidad de la luz de excitación27.

Para un análisis de viabilidad de biopelícula en superficies abióticas por microscopía multifotón, el uso de ácido nucleico fluorescente tiñe con diferentes características espectrales y una capacidad de penetración en las células bacterianas es necesario28. Fluorophores SYTO9 (verde fluorescente) y yoduro de propidio (rojo fluorescente) pueden ser utilizados para una diferenciación visual entre bacterias vivas y muertas28,29,30. Yoduro de propidio penetra solamente bacterias con membranas dañadas, mientras que SYTO9 entra en las células bacterianas con una membrana intacta y comprometida. Cuando ambos colorantes están presentes dentro de una celda, yoduro de propidio tiene una mayor afinidad por los ácidos nucleicos y desplaza SYTO9, marca rojo28,30.

Teniendo en cuenta el medio ambiente oral oral y complejidad biofilm heterogeneidad, microscopia se necesitan técnicas que permite el análisis de la biopelícula de las superficies de los dientes y materiales dentales. Este artículo describe una serie de protocolos implementados para comparar la formación de biofilm oral sobre titanio y materiales cerámicos de aditamentos protésicos, así como los métodos de análisis de biopelículas orales a nivel morfológico y celular.

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Protocolo

Este estudio fue aprobado por la Junta de revisión institucional de la Facultad de Odontología de Ribeirão Preto, y el participante voluntario firmado el consentimiento por escrito (proceso 2011.1.371.583).

1. Biofilm formación in Situ

  1. Selección de los participantes
    1. Seleccionar a los pacientes basados en los siguientes criterios de inclusión: un individuo sano con una dentición completa y sin signos clínicos de enfermedades orales.
    2. Excluir a los pacientes basados en los siguientes criterios de exclusión: embarazo, lactancia, caries dental, enfermedad periodontal o tratamiento antibiótico en los últimos 3 meses, fumador o cualquier enfermedad sistémica que podría influir en el estado periodontal.
  2. Preparación de dispositivo intraoral
    1. Registro de la arcada maxilar mediante una impresión de alginato.
    2. Preparar tipo IV piedra añadiendo 19 mL de agua y 100 g de polvo de piedra. Vierta la piedra en el molde de alginato para hacer un modelo del arco maxilar.
    3. Diseñar y fabricar un dispositivo intraoral acrílico para apoyar a las probetas (discos de cerámica y titanio).
      1. Fabricar cierres retentivos de alambre de NiCr (0,7 mm de diámetro) utilizando alicates ortodónticos #139 y posición en el modelo. Para colocar la abrazadera entre los premolares superiores, doblar un extremo de cada alambre de modo que formen un bucle.
        1. Adaptar el bucle en la región de la papila interdental. En oclusal, inserte una curvatura suave para no interferir con los puntos de contacto y la oclusión. Hacer un 90 º doblez en el extremo de la abrazadera de retención en el acrílico.
        2. Para montar la pinza en el segundo molar superior, adaptar la curvatura del alambre en el tercio cervical (vestibular) del contorno del diente (distal) y 90 º doblez en el extremo de la abrazadera de retención en el acrílico.
          Nota: Para proveer retención/estabilidad adecuada al dispositivo intraoral, los broches de retención se colocaron entre los premolares superiores y el aspecto distal del segundo molar en ambos lados de la arcada dental.
      2. Manipular la resina acrílica autopolimerizable según las instrucciones del fabricante y presiona la resina de acrílico entre 2 placas de vidrio (con un espaciador de espesor 3 mm interpuesto) durante la fase plástica, para hacer una hoja gruesa de 3 milímetros.
      3. Coloque la hoja de acrílico en la región palatina de la modelo, según el diseño del dispositivo y recortar el excedente la resina de acrílico con un carver, antes de la polimerización.
      4. Fabricación de discos de cera mediante una matriz metálica [10 mm de diámetro, 2 mm de espesor (área de superficie de 78,5 mm2)] colocando cera fundida en la matriz y a la espera de la cera se solidifique. Incorporar manualmente 4 discos de cera en la resina de acrílico, 2 de ellos entre los premolares y los otros 2 al lado de los segundos molares.
      5. Deje que la resina de acrílico polimerice en una olla a presión menores de 20 psi de aire comprimido por 20 min.
      6. Acabado el dispositivo intraoral con una pieza de mano eléctrica laboratorio dental y cortador y pulir con abrasivo de goma.
      7. Ajustar el dispositivo para un ajuste correcto en la boca, utilizar el equipo descrito anteriormente.
  3. Preparación de las probetas de titanio y zirconio
    Nota: Las muestras (n = 14) son 10 mm de diámetro y 2 mm de espesor y tienen una superficie de 78,5 mm2.
    1. Pulir las superficies de los especímenes con lijas refrigerado por agua de disminuir la abrasividad (600, 1200 y 2000 arena), durante aproximadamente 20 minutos.
      Nota: El pulido de las muestras fue realizado para uniformar la rugosidad de la superficie a 0.2 μm.
    2. Limpiar y desinfectar las muestras y los dispositivos intraorales con agua y detergente líquido y luego un baño de ultrasonidos de alcohol isopropílico para 15 minutos secar con toallas de papel absorbente.
    3. Fijar a las muestras en el aparato bucal intraoral con aproximadamente 0.1 mL de adhesivo de fusión en caliente no tóxico (figura 1).
    4. Instalar el dispositivo que contiene a las muestras de la cavidad bucal.
      Nota: El dispositivo intraoral que contiene a las muestras se debe usar durante 48 h. El dispositivo fue extraído y guardado en tampón fosfato salino (PBS) mientras que el paciente era comer y realizar la limpieza oral.

2. evaluación de viabilidad bacteriana

Nota: La muestra tamaño n = 10.

  1. Preparar una solución de teñido mediante la adición de 3 μl de SYTO9 (ácido nucleico fluorescente tinte verde) y 3 μl de yoduro de propidio (rojo ácido nucleico fluorescente tinte) a 1 mL de estéril de agua destilada.
    Nota: Preparar soluciones protegidas de la luz.
  2. Transferir a las muestras a una placa de 24 pocillos y lávelos bien con PBS para eliminar las células no adherentes.
  3. Añadir el volumen adecuado (1 mL) de solución de colorante fluorescente para cubrir a la muestra que contiene el biofilm. Añadir el colorante con mucho cuidado para no desorganizar el biofilm.
  4. Incubar a la muestra durante 20-30 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.
  5. Lave suavemente la muestra de biofilm con agua destilada estéril para eliminar cualquier exceso de tinte.
  6. Coloque al espécimen en un plato de fondo de cristal y efectuar multifotón láser microscopía para el análisis de biofilm.
    Nota: El análisis de la viabilidad de las células bacterianas se llevó a cabo mediante un sistema de microscopía multifotón. La fluorescencia de yoduro de propidio fue detectada usando un filtro con una longitud de onda de excitación/emisión de 546/680 nm y 477/600 nm para SYTO9. El tamaño de las imágenes obtenidas fue 5.16188 x 5.16188 mm, que corresponde a 26,64 mm2 de área total de cada muestra (78,5 mm2) o el 33.94% de la superficie total. Las imágenes fueron hechas desde la parte más central de la muestra, con una resolución de 1.024 x 1.024 píxeles. El canal rojo y canal verde imágenes se analizaron por separado de software Fiji31. Cada celda fue seleccionado utilizando una herramienta de selección y la intensidad de la fluorescencia fue medida a través de la densidad integrada de los píxeles, restando el fondo de la imagen.

3. Análisis de la composición química de las muestras por espectroscopia de energía dispersiva (EDS)

Nota: La muestra tamaño n = 3.

  1. Seleccione a 3 ejemplares de cada material de la prueba libre de biofilm y evaluar la composición química en 2 zonas diferentes de cada muestra con un microscopio electrónico acoplado a un espectrómetro de energía dispersiva, con una tensión de haz de electrones de 10 kV32.

4. morfológico análisis del Biofilm bacteriano por microscopía electrónica de barrido

Nota: La muestra tamaño n = 1.

  1. Fijar el biofilm sumergiendo las muestras en glutaraldehído 2.5% diluido en buffer de cacodilato de sodio de 0.1 M, pH 7.0-7.3, para 24 h.
  2. Lavar la muestra en tampón PBS (pH = 7,6).
  3. Postfix el biofilm con tetróxido de osmio 1% durante 1 hora.
  4. Lavar la muestra en tampón PBS (pH = 7,6).
  5. Deshidratan las muestras de la biopelícula cuidadosamente, manteniéndolos sumergidos en el aumento de concentraciones de soluciones de etanol (50%, 70%, 90%, 95% y 100%).
    Nota: Realizar 3 intercambios de etanol a una concentración de 100%. El paso de deshidratación total toma aproximadamente 2 horas.
  6. Transferir las muestras en el secador de punto crítico y hacer varias sustituciones con dióxido de carbono (CO2) hasta que las muestras estén secas.
  7. Retire a las muestras secas del aparato y montar sobre los soportes de microscopio electrónico de barrido.
  8. Farfullar-capa una capa de nm 20 de oro sobre la superficie de la muestra de 120 s.
  9. Inserte los discos recubiertos de oro en la cámara de microscopio electrónico de barrido. Obtención de imágenes de 5 diferentes áreas de cada muestra, en 20-30 kV bajo presión variable y de aumento de 650 X12.

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Resultados

La densidad de colonización de la biopelícula después de 48 h de crecimiento en situ estuvo representada en este estudio por la proporción del área colonizada en los discos de titanio y zirconio en relación con el total área escaneada de la muestra mediante microscopía multifotón ( 26.64 mm2). Figura 2 representa la densidad de colonización bacteriana en la superficie de los materiales probados 3. Se observó una mayor densidad de biofilm e...

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Discusión

El protocolo descrito en este estudio se desarrolló para evaluar la formación de biopelículas sobre materiales de titanio y zirconio para aditamentos protésicos, incluyendo el análisis de la viabilidad de la célula bacteriana y características morfológicas. Para lograr esto, se diseñó un modelo en situ de la formación de biopelículas, que consta de un dispositivo intraoral capaces de acomodar las muestras de los materiales de prueba y mantenerlos expuestos al medio oral dinámico durante 48 h. El dispositivo era ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen José Augusto Maulin del laboratorio de microscopía multiusuario (Facultad de medicina de Ribeirão Preto) por su ayuda generosa con el EDS y SEM análisis y Hermano Teixeira Machado por su generosa asistencia técnica en la edición de vídeo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Hydrogum 5Zhermack DentalC302070
Durone IVDentsply17130500002
alambre de NiCr Morelli55.01.070
JET acrílico autopolimerizanteClá ssico
Cera dental Clá ssico
Olla de presión Esenciadental
Lijas grano 600NORTONT216
Lijas grano 1200NORTONT401
Lijas grano 2000NORTONT402
Pulidora metalográficaArotec
Alcohol isopropílicoSIGMA-ALDRICHW292907
Adhesivo termofusibleTECSILPAH M20017
Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Kit de viabilidadInvitrogenL10316
Puntas de pipeta, 10 y micro; LKASVIK8-10   
Puntas de pipeta, 1.000 y micro; LKASVIK8-1000B   
Placa de 24 pocillos KASVIK12-024
Plato con fondo de vidrioThermo Scientific150680
Microscopio invertido AxioObserver Láser ZEISS
Chameleon vision iicoherente
EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Aceite DICZEISS440452-9903-000
Sensores SDD - X-Max 20mm²Oxford Instruments
Solución de glutaraldehídoSIGMA-ALDRICHG5882
Tampón de cacodilato de sodio SIGMA-ALDRICH97068 
Tetróxido de osmioSIGMA-ALDRICH201030
Na2HPO4SIGMA-ALDRICHS9638Se utiliza para la preparación de solución salina tamponada con fosfato
KH2PO4SIGMA-ALDRICHP9791 
NaClMERK1.06404
KclSIGMA-ALDRICHP9333 
Absoluto de etanol para análisis EMSUREMERK1.00983
CPD 030 Secador de punto críticoBAL-TEC
JSM-6610 Series Microscopio electrónico de barridoJEOL
SCD 050 Recubridor por pulverización catódicaBAL-TEC
Objetivo

Referencias

  1. Do, T., Devine, D., Marsh, P. D. Oral biofilms: molecular analysis, challenges, and future prospects in dental diagnostics. Clinical, Cosmetic and Investigational Dentistry. 5, 11-19 (2013).
  2. Samaranayake, L., Matsubara, V. H. Normal Oral Flora and the Oral Ecosystem. Dental Clinics of North America. 61 (2), 199-215 (2017).
  3. Larsen, T., Fiehn, N. E. Dental biofilm infections - an update. Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 125 (4), 376-384 (2017).
  4. Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontology 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
  5. Marsh, P. D., Zaura, E. Dental biofilm: ecological interactions in health and disease. Journal of Clinical Periodontology. 44 Suppl 18, S12-S22 (2017).
  6. Zitzmann, N. U., Berglundh, T., Marinello, C. P., Lindhe, J. Experimental peri-implant mucositis in man. Journal of Clinical Periodontology. 28 (6), 517-523 (2001).
  7. Meyer, S., et al. Experimental mucositis and experimental gingivitis in persons aged 70 or over. Clinical and biological responses. Clinical Oral Implants Research. 28 (8), 1005-1012 (2017).
  8. Salvi, G. E., Cosgarea, R., Sculean, A. Prevalence and Mechanisms of Peri-implant Diseases. Journal of Dental Research. 96 (1), 31-37 (2017).
  9. Hahnel, S., Wieser, A., Lang, R., Rosentritt, M. Biofilm formation on the surface of modern implant abutment materials. Clinical Oral Implants Research. 26 (11), 1297-1301 (2015).
  10. Nascimento, C., et al. Bacterial adhesion on the titanium and zirconia abutment surfaces. Clinical Oral Implants Research. 25 (3), 337-343 (2014).
  11. Nakamura, K., Kanno, T., Milleding, P., Ortengren, U. Zirconia as a dental implant abutment material: a systematic review. The International Journal of Prosthodontics. 23 (4), 299-309 (2010).
  12. Scarano, A., Piattelli, M., Caputi, S., Favero, G. A., Piattelli, A. Bacterial adhesion on commercially pure titanium and zirconium oxide disks: an in vivo human study. Journal of Periodontology. 75 (2), 292-296 (2004).
  13. Nascimento, C., et al. Microbiome of titanium and zirconia dental implants abutments. Dental Materials. 32 (1), 93-101 (2016).
  14. Rimondini, L., Cerroni, L., Carrassi, A., Torricelli, P. Bacterial colonization of zirconia ceramic surfaces: an in vitro and in vivo study. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 17 (6), 793-798 (2002).
  15. de Avila, E. D., Avila-Campos, M. J., Vergani, C. E., Spolidorio, D. M., Mollo Fde, A. Jr Structural and quantitative analysis of a mature anaerobic biofilm on different implant abutment surfaces. Journal of Prosthetic Dentistry. 115 (4), 428-436 (2016).
  16. de Avila, E. D., et al. Impact of Physical Chemical Characteristics of Abutment Implant Surfaces on Bacteria Adhesion. Journal of Oral Implantology. 42 (2), 153-158 (2016).
  17. de Avila, E. D., et al. Effect of titanium and zirconia dental implant abutments on a cultivable polymicrobial saliva community. Journal of Prosthetic Dentistry. 118 (4), 481-487 (2017).
  18. Lin, N. J. Biofilm over teeth and restorations: What do we need to know? Dental Materials. 33 (6), 667-680 (2017).
  19. Prada-Lopez, I., Quintas, V., Tomas, I. The intraoral device of overlaid disk-holding splints as a new in situ oral biofilm model. Journal of Clinical and Experimental Dentistry. 7 (1), e126-e132 (2015).
  20. Prada-Lopez, I., Quintas, V., Vilaboa, C., Suarez-Quintanilla, D., Tomas, I. Devices for in situ Development of Non-disturbed Oral Biofilm. A Systematic Review. Frontiers in Microbiology. 7, 1055(2016).
  21. Burgers, R., et al. In vivo and in vitro biofilm formation on two different titanium implant surfaces. Clinical Oral Implants Research. 21 (2), 156-164 (2010).
  22. do Nascimento, C., et al. Oral biofilm formation on the titanium and zirconia substrates. Microscopy Research and Technique. 76 (2), 126-132 (2013).
  23. Al-Ahmad, A., et al. In vivo study of the initial bacterial adhesion on different implant materials. Archives of Oral Biology. 58 (9), 1139-1147 (2013).
  24. Al-Ahmad, A., et al. Bacterial adhesion and biofilm formation on yttria-stabilized, tetragonal zirconia and titanium oral implant materials with low surface roughness - an in situ study. Journal of Medical Microbiology. 65 (7), 596-604 (2016).
  25. Thomsen, H., et al. Delivery of cyclodextrin polymers to bacterial biofilms - An exploratory study using rhodamine labelled cyclodextrins and multiphoton microscopy. International Journal of Pharmaceutics. 531 (2), 650-657 (2017).
  26. Lakins, M. A., Marrison, J. L., O'Toole, P. J., van der Woude, M. W. Exploiting advances in imaging technology to study biofilms by applying multiphoton laser scanning microscopy as an imaging and manipulation tool. Journal of Microscopy. 235 (2), 128-137 (2009).
  27. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  28. Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry Part A. 61 (2), 189-195 (2004).
  29. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (79), e50729(2013).
  30. Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36(2015).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Placko, H. E., Mishra, S., Weimer, J. J., Lucas, L. C. Surface characterization of titanium-based implant materials. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 15 (3), 355-363 (2000).
  33. So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two-photon excitation fluorescence microscopy. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 399-429 (2000).
  34. Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.11 11-24 (2013).
  35. Gardi, J. E., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. The proportionator: unbiased stereological estimation using biased automatic image analysis and non-uniform probability proportional to size sampling. Computers in Biology and Medicine. 38 (3), 313-328 (2008).
  36. Melvin, N. R., Poda, D., Sutherland, R. J. A simple and efficient alternative to implementing systematic random sampling in stereological designs without a motorized microscope stage. Journal of Microscopy. 228 (Pt 1), 103-106 (2007).
  37. Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 68 (2), 901-909 (2002).
  38. Neu, T. R., Woelfl, S., Lawrence, J. R. Three-dimensional differentiation of photo-autotrophic biofilm constituents by multi-channel laser scanning microscopy (single-photon and two-photon excitation). Journal of Microbiological Methods. 56 (2), 161-172 (2004).
  39. Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23 (4), 233-242 (2015).
  40. Lacroix-Gueu, P., Briandet, R., Leveque-Fort, S., Bellon-Fontaine, M. N., Fontaine-Aupart, M. P. In situ measurements of viral particles diffusion inside mucoid biofilms. Comptes Rendus Biologies. 328 (12), 1065-1072 (2005).
  41. Briandet, R., et al. Fluorescence correlation spectroscopy to study diffusion and reaction of bacteriophages inside biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 74 (7), 2135-2143 (2008).
  42. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
  43. Bergmans, L., Moisiadis, P., Van Meerbeek, B., Quirynen, M., Lambrechts, P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. International Endodontic Journal. 38 (11), 775-788 (2005).
  44. Hannig, C., Follo, M., Hellwig, E., Al-Ahmad, A. Visualization of adherent micro-organisms using different techniques. Journal of Medical Microbiology. 59 (Pt 1), 1-7 (2010).
  45. Knutton, S. Electron microscopical methods in adhesion. Methods in Enzymology. 253, 145-158 (1995).
  46. Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2, Unit 2B.2 (2012).

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