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Artículo de método

Hoja de luz fluorescencia microscopía para el estudio del corazón murino

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DOI:

10.3791/57769

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15 de septiembre de 2018

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1Department of Bioengineering, University of California Los Angeles, 2Department of Bioengineering, University of Texas at Arlington, 3School of Optical and Electronic Information, Huazhong University of Science and Technology, 4Department of Biomedical Engineering, OSHU

En este artículo

Resumen

Este estudio utiliza una técnica de microscopía (LSFM) de hoja de luz fluorescencia iluminación doble cara combinada con la compensación óptica para estudiar el corazón murino.

Resumen

Microscopía de fluorescencia de la hoja de luz ha sido ampliamente utilizado para la adquisición rápida de la imagen con una resolución axial de micrómetro a escala milimétrica. Técnicas tradicionales de la hoja de luz incluyen el uso de un haz de iluminación único dirigido ortogonalmente en el tejido de muestra. Imágenes de muestras grandes que se producen con un rayo de iluminación solo contienen rayas o artefactos y sufren una resolución reducida debido a la dispersión y la absorción de luz por el tejido. Este estudio utiliza un haz de iluminación de doble cara y una simplificada claridad óptica compensación técnica al corazón murino. Estas técnicas permiten la proyección de imagen profunda mediante la eliminación de lípidos desde el corazón y producen un gran campo de imágenes, superior a 10 x 10 x 10 mm3. Como resultado, esta estrategia nos permite cuantificar las dimensiones ventriculares, rastrear el linaje cardiaco y localizar la distribución espacial de proteínas cardiacas específicas y canales iónicos de la post-natal a corazones de ratón adulto con suficiente contraste y resolución.

Introducción

Microscopía de fluorescencia de luz-hoja técnica desarrollado en 1903 y se utiliza hoy como un método para el estudio de expresión génica y también para producir modelos 3D o 4D de las muestras de tejido1,2,3. Este método de imagen utiliza una hoja fina de la luz para iluminar un solo plano de una muestra para que sólo ese plano es capturado por el detector. La muestra entonces puede mover en la dirección axial para capturar cada capa, una sección a la vez y renderizar un modelo 3-d después de post-procesamiento de las imágenes adquiridas4. Sin embargo, debido a la absorción y dispersión de fotones, LSFM se ha limitado a las muestras que son ópticamente transparente1o sea unos pocos micrones de espesor.

Las limitaciones de LSFM han conducido a estudios de organismos que tienen los tejidos que son ópticamente transparentes, como el pez cebra. Que implica la diferenciación y desarrollo cardíaco son a menudo estudios en pez cebra ya que hay genes conservados entre los seres humanos y de pez cebra5,6. Aunque estos estudios han llevado a avances en la investigación cardiaca miocardiopatías6,7, todavía hay una necesidad para llevar a cabo investigaciones similares en organismos superiores como los mamíferos.

Tejido cardiaco mamífero presenta un desafío debido al grosor y opacidad de los tejidos, la absorción debido a la hemoglobina en los glóbulos rojos y las bandas que se produce debido a la iluminación de un solo lado de la muestra bajo tradicional LSFM métodos1 , 8. para compensar estas limitaciones, nos propone utilizar iluminación de doble cara y una versión simplificada de la claridad técnica9 combinado con un índice de refracción que solución (bordes). Por lo tanto, este sistema permite la proyección de imagen de una muestra que es mayor que 10 x 10 x 10 mm3 , mientras que mantener una buena calidad de resolución axial y lateral planos8.

Este sistema primero se calibró usando perlas fluorescentes dispuestas en diferentes configuraciones dentro de los tubos de vidrio. Entonces, el sistema fue utilizado para corazones murinos postnatales y adulto de la imagen. En primer lugar, el corazón postnatal del ratón era reflejado en 7 días (P7) a la cavidad ventricular, el espesor de la pared ventricular, las estructuras de la válvula y la presencia de trabeculación. En segundo lugar, se realizó un estudio para identificar las células que se diferencian en cardiomiocitos usando un corazón de ratón después del parto en 1 día (P1) con cardiomiocitos Cre-etiquetados y proteína fluorescente amarilla (YFP). Finalmente, fueron imágenes de ratones adultos a los 7,5 meses para observar la presencia de potasio medular externo renal canales (ROMK) después de la terapia de gene8.

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Protocolo

Todos los procedimientos que implican el uso de animales han sido aprobados por los comités de revisión institucional (IACUC) en la Universidad de California, Los Ángeles, California.

1. proyección de imagen de configuración del sistema

Nota: Ver figura 1 y figura 2.

  1. Recuperar láser onda continua (CW) con 3 longitudes de onda: 405 nm, 473 nm y 532 nm. Poner 2 espejos (M1 y M2) 150 mm aparte y alinearlos con sus planos del espejo a 45° a la viga.
    Nota: Este paso se realiza para dirigir el láser a la instalación de iluminación de doble cara. El haz resultante estará en la misma dirección que el rayo inicial.
  2. Pasar el rayo a través de un diámetro de 25 mm diafragma iris/agujero de alfiler (PH), un filtro de densidad neutra de 50 mm de diámetro (FDN) con un rango de densidad óptica de 0 - 4.0, un expansor de haz (BE), una raja de 30 mm (S) con la anchura de ~ 0 - 6 mm y un espejo (M3) , todo colocado 150 mm unos de otros. Coloque el espejo con su plano de espejo a 45° a la viga.
  3. Pasar el rayo a través de un divisor de viga de 50: 50 a 150 mm de M3. Coloque un espejo (M6) 150 mm desde el divisor de viga y alinearlo para que sea su plano de espejo a 45° para la viga que se emite en la dirección de avance. Utilizar la viga reflejada para formar un lado de la hoja de luz de doble iluminación.
  4. Coloque un espejo (M4) 150 mm desde el divisor de viga y alinearlo para que sea su plano de espejo a 45° para la viga que fue emitida en un ángulo de 90° desde el divisor de viga. Coloque un segundo espejo (M5) 150 mm del M4 y alinearlo para que sea su plano de espejo a 45° a la viga reflejada de M6. Utilizar la viga emitida de M5 para formar el segundo lado de la hoja de luz de doble iluminación.
  5. Configurar el sistema de iluminación de doble cara de forma simétrica (ver figura 1). Coloque una lente cilíndrica (CL1) [diámetro (d) = 1; longitud focal (f) = 50 mm] 150 mm en línea con el haz emitido desde M5 a un lado y otra idéntica lente cilíndrica (CL2) 150 mm en la viga emitida por M6 en el otro lado de la doble iluminación setu p. Coloque 2 espejos (M7 y M8) cada uno en consonancia con las lentes cilíndricas a distancias de 50 mm para reflejar el haz a 90 °.
  6. Forman un doblete acromático de un par de lentes. Coloque la primera lente, L1 (d = 1; f = 100 mm), 100 mm de la M7 y la segunda lente, L2 (d = 1; f = 60 mm), 160 mm de L1. Repita que esto en el otro lado de la doble iluminación con lentes idénticas (L3, L4) colocado a la misma distancia de M8.
  7. Lugar los espejos, M9 y M10, 60 mm de lentes L2 y L4, respectivamente y en consonancia con la viga. Colocar los objetivos de la iluminación, OL1 y OL2 (d = 2; f = 150 mm), 150 mm de la M9 y M10 y de acuerdo con el rayo. El haz emitido desde los objetivos forma la ficha técnica de iluminación para las muestras de la proyección de imagen.
  8. Utilice una impresora 3D para imprimir el portamuestras de acrilonitrilo butadieno estireno (ABS). Embeber un trozo de vidrio de cubierta [índice de refracción (RI) = 1.4745] a cada lado de la cámara, perpendicular a la viga de la iluminación, para minimizar la disparidad entre el índice de refracción. Colocar uniformemente la cámara entre las vigas de las lentes del objetivo.
  9. Instalar un microscopio estéreo con 1 X objetivo de aumento y una cámara de semiconductor (sCMOS) científico del óxido de metal complementario perpendicular la iluminación del plano (ver figura 2).

2. proyección de imagen de la calibración del sistema

  1. Recuperar los granos del poliestireno fluorescentes que son 0.53 μm de diámetro.
  2. Preparar la muestra de grano fluorescente diluyendo la solución de grano en una solución de correspondencia para índice de refracción (llantas) con bajo-derretir de 1% agarosa señala a 1: 150, 000. Corte un trozo de tubo de vidrio de borosilicato con un diámetro interior de 12 mm y un diámetro exterior de 18 mm a 30 mm de longitud.
    Nota: El tubo de vidrio de borosilicato se utiliza para que coincida con el índice de refracción (1,47).
  3. Mezcle la muestra diluida del grano con agarosa al 1% y pipetear la solución de agarosa/grano en el tubo de borosilicato. Permita que la agarosa se solidifique a temperatura ambiente (23 ° C).
  4. Llene la cámara ABS (de paso 1.7) con una solución de glicerol 99.5%. Coloque el tubo de vidrio borosilicato que contiene los granos dentro de la cámara. Coloque la cámara ABS en el sistema de proyección de imagen que está en el centro de la viga Gaussian creado por el sistema de iluminación dual.
  5. Coloque una etapa traslación motorizada 3-d en el tubo de vidrio borosilicato para controlar el movimiento y la orientación de la muestra dentro de la cámara ABS (ver figura 1 complementaria).
  6. Adquisición de imágenes mediante la cámara sCMOS a una velocidad de 30 fotogramas por segundo (fps). Utilizando el controlador del motor, mover la muestra de 1 mm en dirección lateral y adquirir imágenes en cada incremento de 1 mm, usando la cámara sCMOS. Continúe hasta que toda la muestra ha sido reflejada.
  7. Las imágenes adquiridas mediante un software de visualización de la pila (véase Tabla de materiales). Medir la función de punto de extensión (PSF) del sistema usando estas imágenes de grano. Utilice este PSF para la deconvolución durante el procesamiento de imágenes en pasos posteriores.

3. preparación de la muestra

  1. Diseccionar el corazón de un ratón de tipo P1 y de doble heterozigótico sarcolipin-Cre knockin ratón con el gen Rosa26 YFP (SlnCre / +; R26reportero YFP / +) en P7.
    Nota: La eutanasia fue realizada usando pentobarbital y la técnica descrita por Robbins et al. 10. la disección se realizó según la técnica descrita por el corazón nacional, pulmón y sangre Institute (NHLBI)10,11.
  2. Realizar un producto claro de los corazones de ratón como descrito por Kevin Sung et al. 12.
    Nota: Los pasos siguientes deben realizarse en una campana de humos ya que los productos químicos que se utilizan son tóxicos.
    1. Enjuague los corazones 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS) 3 x 10 min. Después de enjuagar, colocar los corazones en una solución de paraformaldehído al 4% e incubar las muestras a 4 ° C durante la noche.
    2. Coloque las muestras en una solución de acrilamida del 4% que contiene 0.5% w/v de 2, 2'-Azobis diclorhidrato de. Permita que las muestras a incubar a 4 ° C durante la noche. Después de la incubación durante la noche, retire las muestras e incubar a 37 ° C durante 2-3 h.
    3. Enjuagar las muestras con PBS y luego colocarlos en una solución de 8% w/v sodio dodecil sulfato y el ácido bórico 1.25% w/v. Incubar las muestras a 37 ° C hasta que estén claras. Esto puede tomar varias horas dependiendo del grosor de la muestra. Después de la tala, sacar las muestras y en 1 x solución salina con tampón fosfato para 1 día.
    4. Preparar un índice de refracción que solución con 40 g de medio de gradiente de densidad no iónicos (véase Tabla de materiales) en 30 mL de tampón de fosfato de 0.02 M (PB), 0,1% Tween-20 y el 0,01% de azida sódica. Llevar la solución a un pH de 7,5 con hidróxido de sodio.
  3. Coloque la muestra limpia en los bordes con un índice de refracción de 1.46 1.48 y 1% agarosa. Inserte la muestra en tubos de vidrio de borosilicato y permitir que la agarosa se solidifique a temperatura ambiente (23 ° C).
  4. Coloque una etapa traslación motorizada 3-d en el tubo de vidrio borosilicato para controlar el movimiento y orientación de la muestra dentro de la 3D impreso cámara ABS (ver figura 1 complementaria).

4. proyección de imagen de corazón adulto

  1. Inyecte 8,7 x 1012 virus de vector de virus adeno-asociado tipo 9 (AAV9) que contiene un promotor específico cardiaco troponin T (cTnT) y la proteína verde fluorescente (GFP) en un volumen de 100 μL en la vena de la cola de un ratón de tipo salvaje de 2 meses (C57BL/6).
    Nota: El AAV9 fue desarrollado según la técnica descrita por Yuan et al. 13. esto hace GFP enlazar con el canal medular externo renal del potasio (ROMK) produciendo AAV9-reposo-ROMK-GFP (véase Tabla de materiales).
  2. Diseccionar el corazón de ratón adulto a 7,5 meses de edad según la técnica descrita por el NHLBI11. Preparar las muestras siguiendo pasos 3.1-3.3.
  3. Conectar el controlador del motor al actuador de motor. Fije el actuador a la tubería de vidrio borosilicato para controlar el movimiento y orientación de la muestra dentro de la 3D impreso cámara ABS.
  4. Coloque la muestra de modo que está en el centro de la viga Gaussian creado por el sistema de iluminación dual. Adquisición de imágenes con la cámara sCMOS a una tasa de 100 fps.
  5. Utilizando el controlador del motor, mover la muestra de 1 mm en la dirección axial y adquirir imágenes en cada incremento de 1 mm con la cámara del sCMOS. Continúe hasta que toda la muestra ha sido reflejada.
    Nota: El sistema es controlado por un software de control de instrumentos desarrollados a medida.
  6. Las imágenes adquiridas mediante un software de visualización de la pila (véase Tabla de materiales). Desarrollar imágenes 3-d usando las pilas de la imagen y el software de visualización14. Deconvolve el PSF del paso 2.6 con la pila de la imagen adquirida. Defina un valor de intensidad umbral de pixel a observar los contornos del corazón pseudo-color para las imágenes basadas en esta intensidad de escala de grises.

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Resultados

La técnica descrita aquí utiliza un haz de iluminación de doble cara, combinado con una compensación óptica de las muestras de tejido de corazón de ratón para lograr una profundidad de imagen más profunda y mayor volumen de imágenes con suficiente resolución de imagen (figura 1). Para calibrar el sistema, perlas fluorescentes fueron colocados dentro del tubo de vidrio y dentro del sistema de proyección de imagen. Los granos fueron luego reflejados y visualiza...

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Discusión

El sistema de LSFM y técnica descrita aquí utiliza un haz de iluminación de doble cara, combinado con una compensación óptica a imagen del corazón de ratón en etapas de su desarrollo postnatales y adulto. Un haz de iluminación única tradicional sufre de dispersión del fotón y la absorción a través de las muestras de tejido más grueso y más grande de1,3. Las vigas de doble cara ofrecen una iluminación más uniforme de la muestra, reduciendo así el efecto de rayas y...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Thao Nguyen y Atsushi Nakano de UCLA para proporcionar la muestra de ratones a la imagen. Este estudio fue apoyado por subvenciones NIH HL118650 (a Tzung K. Hsiai), HL083015 (a Tzung K. Hsiai), HD069305 (y N. C. Chi Tzung K. Hsiai.), HL111437 (a Tzung K. Hsiai y N. C. Chi), HL129727 (a Tzung K. Hsiai), sistema universitario de Texas estrellas financiación (Juhyun Lee).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
CW LaserLaserglow TechnologiesLMM-GBV1-PF3-00300-05Excitación de fluoróforos Filtro de
densidad neutraThorlabsNDC-50C-4MControla la cantidad de luz que entra en el sistema
Expansor de haz acromáticoThorlabsGBE05-AExpande el haz de luz
Ranura mecánicaThorlabsVA100CControla la anchura del haz
Divisor de hazThorlabsBS013Formas haz de doble iluminación
Microscopio estereoscópico con lente de objetivo 1XOlympusMVX10Se utiliza para la observación de muestras
ORCA-Flash4.0 LT Cámara sCMOSHamamatsu PhotonicsC11440-42USe utiliza para capturar imágenes
Acrilonitrilo butadieno estireno (ABS)StratasysuPrintMaterial utilizado para imprimir en 3D un portamuestras
Perlas de poliestireno fluorescenteSpherotech IncPP-05-10Se utiliza para la calibración del sistema de imágenes
Tubo de vidrio de borosilicatoCorningPyrex 7740Tubo para la inclusión de muestras
GlicerolFisher ScientificBP229-4Relleno para cámara de muestras
Salina tamponada con fosfatoFisher ScientificBP39920 Solución de enjuague para corazones de ratón
ParaformaldehídoCiencias de la microscopía electrónicaRT-15700Primera solución de incubación
AcrilamidaWako ChemicalsAAL-107Mezclado con diclorhidrato de 2,2'-Azobis para la segunda solución de incubación para corazones
de ratón 2,2'-Clorhidrato de AzobisWako ChemicalsVA-044Mezclado con acrilamida para la segunda solución de incubación para corazones
de ratónDodecil sulfato de sodio Sigma Aldrich71725Mezclado con ácido bórico para la tercera solución de incubación para corazones de ratón
Ácido bóricoFischer ScientificA74-1Mezclado con dodecil sulfato de sodio para la tercera solución de incubación para corazones de ratón
Sigma D2158Sigma AldrichD2158Mezclado con PB, Tween-20 y azida de sodio como solución de coincidencia de índice de refracción
Tween-20Sigma Aldrich11332465001Mezclado con Sigma D2158, PB y azida de sodio como solución de coincidencia de índice de refracción
Azida de sodioSigma AldrichS2002Mezclado con Sigma D2158, PB y Tween-20 como solución de coincidencia de índice de refracción
Vector de virus adenoasociado 9 con un promotor de troponina T específico del corazón marcado con GFPVector BiolabsVB2045Expresa GFP cuando se une al
actuador de servomotor de CCROMK ThorlabsZ825BSe utiliza para el movimiento de la muestra en dirección axial dentro de la lámina de luz
K-Cube Controlador de servomotor de CC cepilladoThorlabsKDC101Se conecta al actuador del motor y controla el movimiento del actuador
Software AMIRAFEIN/ASoftware de visualización para la producción de imágenes 2D y 3D

Referencias

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