Este estudio utiliza una técnica de microscopía (LSFM) de hoja de luz fluorescencia iluminación doble cara combinada con la compensación óptica para estudiar el corazón murino.
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Artículo de método
Hoja de luz fluorescencia microscopía para el estudio del corazón murino
En este artículo
Resumen
Resumen
Microscopía de fluorescencia de la hoja de luz ha sido ampliamente utilizado para la adquisición rápida de la imagen con una resolución axial de micrómetro a escala milimétrica. Técnicas tradicionales de la hoja de luz incluyen el uso de un haz de iluminación único dirigido ortogonalmente en el tejido de muestra. Imágenes de muestras grandes que se producen con un rayo de iluminación solo contienen rayas o artefactos y sufren una resolución reducida debido a la dispersión y la absorción de luz por el tejido. Este estudio utiliza un haz de iluminación de doble cara y una simplificada claridad óptica compensación técnica al corazón murino. Estas técnicas permiten la proyección de imagen profunda mediante la eliminación de lípidos desde el corazón y producen un gran campo de imágenes, superior a 10 x 10 x 10 mm3. Como resultado, esta estrategia nos permite cuantificar las dimensiones ventriculares, rastrear el linaje cardiaco y localizar la distribución espacial de proteínas cardiacas específicas y canales iónicos de la post-natal a corazones de ratón adulto con suficiente contraste y resolución.
Introducción
Microscopía de fluorescencia de luz-hoja técnica desarrollado en 1903 y se utiliza hoy como un método para el estudio de expresión génica y también para producir modelos 3D o 4D de las muestras de tejido1,2,3. Este método de imagen utiliza una hoja fina de la luz para iluminar un solo plano de una muestra para que sólo ese plano es capturado por el detector. La muestra entonces puede mover en la dirección axial para capturar cada capa, una sección a la vez y renderizar un modelo 3-d después de post-procesamiento de las imágenes adquiridas4. Sin embargo....
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Protocolo
Todos los procedimientos que implican el uso de animales han sido aprobados por los comités de revisión institucional (IACUC) en la Universidad de California, Los Ángeles, California.
1. proyección de imagen de configuración del sistema
Nota: Ver figura 1 y figura 2.
- Recuperar láser onda continua (CW) con 3 longitudes de onda: 405 nm, 473 nm y 532 nm. Poner 2 espejos (M1 y M2) 150 mm aparte y alinearlos con sus planos del espejo a 45° a la viga.
Nota: Este paso se realiza para dirigir el láser a la instalación de iluminación de doble cara. E....
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Resultados
La técnica descrita aquí utiliza un haz de iluminación de doble cara, combinado con una compensación óptica de las muestras de tejido de corazón de ratón para lograr una profundidad de imagen más profunda y mayor volumen de imágenes con suficiente resolución de imagen (figura 1). Para calibrar el sistema, perlas fluorescentes fueron colocados dentro del tubo de vidrio y dentro del sistema de proyección de imagen. Los granos fueron luego reflejados y visualiza.......
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Discusión
El sistema de LSFM y técnica descrita aquí utiliza un haz de iluminación de doble cara, combinado con una compensación óptica a imagen del corazón de ratón en etapas de su desarrollo postnatales y adulto. Un haz de iluminación única tradicional sufre de dispersión del fotón y la absorción a través de las muestras de tejido más grueso y más grande de1,3. Las vigas de doble cara ofrecen una iluminación más uniforme de la muestra, reduciendo así el efecto de rayas y.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Thao Nguyen y Atsushi Nakano de UCLA para proporcionar la muestra de ratones a la imagen. Este estudio fue apoyado por subvenciones NIH HL118650 (a Tzung K. Hsiai), HL083015 (a Tzung K. Hsiai), HD069305 (y N. C. Chi Tzung K. Hsiai.), HL111437 (a Tzung K. Hsiai y N. C. Chi), HL129727 (a Tzung K. Hsiai), sistema universitario de Texas estrellas financiación (Juhyun Lee).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitación de fluoróforos Filtro de |
| densidad neutra | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controla la cantidad de luz que entra en el sistema |
| Expansor de haz acromático | Thorlabs | GBE05-A | Expande el haz de luz |
| Ranura mecánica | Thorlabs | VA100C | Controla la anchura del haz |
| Divisor de haz | Thorlabs | BS013 | Formas haz de doble iluminación |
| Microscopio estereoscópico con lente de objetivo 1X | Olympus | MVX10 | Se utiliza para la observación de muestras |
| ORCA-Flash4.0 LT Cámara sCMOS | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Se utiliza para capturar imágenes |
| Acrilonitrilo butadieno estireno (ABS) | Stratasys | uPrint | Material utilizado para imprimir en 3D un portamuestras |
| Perlas de poliestireno fluorescente | Spherotech Inc | PP-05-10 | Se utiliza para la calibración del sistema de imágenes |
| Tubo de vidrio de borosilicato | Corning | Pyrex 7740 | Tubo para la inclusión de muestras |
| Glicerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Relleno para cámara de muestras |
| Salina tamponada con fosfato | Fisher Scientific | BP39920 Solución de enjuague para corazones de ratón | |
| Paraformaldehído | Ciencias de la microscopía electrónica | RT-15700 | Primera solución de incubación |
| Acrilamida | Wako Chemicals | AAL-107 | Mezclado con diclorhidrato de 2,2'-Azobis para la segunda solución de incubación para corazones |
| de ratón 2,2'-Clorhidrato de Azobis | Wako Chemicals | VA-044 | Mezclado con acrilamida para la segunda solución de incubación para corazones |
| de ratónDodecil sulfato de sodio | Sigma Aldrich | 71725 | Mezclado con ácido bórico para la tercera solución de incubación para corazones de ratón |
| Ácido bórico | Fischer Scientific | A74-1 | Mezclado con dodecil sulfato de sodio para la tercera solución de incubación para corazones de ratón |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Mezclado con PB, Tween-20 y azida de sodio como solución de coincidencia de índice de refracción |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Mezclado con Sigma D2158, PB y azida de sodio como solución de coincidencia de índice de refracción |
| Azida de sodio | Sigma Aldrich | S2002 | Mezclado con Sigma D2158, PB y Tween-20 como solución de coincidencia de índice de refracción |
| Vector de virus adenoasociado 9 con un promotor de troponina T específico del corazón marcado con GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Expresa GFP cuando se une al |
| actuador de servomotor de CC | ROMK Thorlabs | Z825B | Se utiliza para el movimiento de la muestra en dirección axial dentro de la lámina de luz |
| K-Cube Controlador de servomotor de CC cepillado | Thorlabs | KDC101 | Se conecta al actuador del motor y controla el movimiento del actuador |
| Software AMIRA | FEI | N/A | Software de visualización para la producción de imágenes 2D y 3D |
Referencias
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Huisken, J., Swo....
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Reimpresiones y permisos
Etiquetas
Iluminación de doble caraimágenes del corazón murinoaclaramiento óptico CLARITYcuantificación de las dimensiones ventricularesseguimiento del linaje cardíacolocalización de canales iónicos proteicosimágenes con cámara sCMOSplatina de traslación motorizada 3Dsolución de igualación del índice de refracción
