Aquí, presentamos un protocolo para permitir la cuantificación exacta de la metilación de la DNA (mtDNA) mitocondrial. En este protocolo, describimos una digestión enzimática del ADN con BamHI juntada con una tubería de análisis bioinformáticos que se puede utilizar para evitar la sobreestimación de los niveles de metilación de mtDNA causada por la estructura secundaria del ADNmt.
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Artículo de método
Metodología para la detección exacta de la metilación del ADN mitocondrial
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Resumen
Resumen
Cuantificación de la metilación del ADN puede lograrse utilizando secuenciación de bisulfito, que aprovecha la propiedad de bisulfito de sodio para convertir unmethylated citosina en uracilo, en un contexto de ADN monocatenario. Secuenciación de bisulfito puede ser dirigida (mediante PCR) o en todo el genoma y proporciona la cuantificación absoluta de la metilación de la citosina en la sola base-resolución. Dada la naturaleza distinta del ADN nuclear y mitocondrial, en particular en la estructura secundaria, deben realizarse adaptaciones de métodos de secuenciación de bisulfito para la investigación de metilación de citosina en el ADNmt. Estructura secundaria y terciaria del mtDNA puede de hecho conducir a bisulfito de secuenciación artefactos llevando a falsos positivos debido a la deficiente acceso desnaturalización incompleta de bisulfito a ADN monocatenario. Aquí, describimos un protocolo con una digestión enzimática del ADN BamHI juntada con tubería de análisis bioinformáticos para permitir la cuantificación exacta de la citosina niveles de metilación en el ADNmt. Además, proporcionamos las pautas para el diseño de los cebadores de secuencia de bisulfito específicos de mtDNA, para evitar dirigidos a segmentos NUclear mitocondrial indeseables (NUMTs) insertan en el genoma nuclear.
Introducción
El genoma mitocondrial es una estructura circular, doble cadena de aproximadamente 16,5 kilos base (kb), lo que constituye de un pesado y un filamento de la luz. El genoma mitocondrial está presente en múltiples copias en cada célula, maternal heredado y codifica componentes esenciales de la cadena respiratoria complejos1. Similar a los genomas bacterianos y a diferencia del genoma nuclear, el genoma mitocondrial se organiza en numerosas estructuras secundarias y terciarias, como en las estructuras en espiral y superenrollado2, que puede hacer que acceso difícil durante la secuencia experimentos3.....
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Protocolo
1. tratamiento enzimático de la restricción
- Alinear el mtDNA por tratar el DNA humana total con la enzima de restricción BamHI, que corta en la posición 14258 en el ADN mitocondrial humano.
Nota: Para ADN de ratón, utilice la enzima de restricción BglII en condiciones idénticas como abajo. - Para cada muestra donde metilación del mtDNA es evaluarse, preparar un tubo de reacción de 0.2 mL y añadir el siguiente mezcla: 3 μg ADN genómico (cuantificado por fluorometría), 15 μL tampón 3, 3 μL BamHI y agua hasta de 150 μL
- Colocar los tubos en un termociclador durante 4 h a 37 ° C.
2. bisulfito conversión
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Resultados
Dos pasos en este protocolo son cruciales al investigar metilación del mtDNA. 1) la apertura de la estructura secundaria y 2) el diseño de iniciadores específicos de ADN mitocondriales.
Por digerir el ADN genómico humano con la enzima de restricción BamHI (figura 1), se reducirá la estructura del ADN mitocondrial en la posición del nucleótido 14.258 y se abrirá la estructura secundaria.
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Discusión
Presentamos un protocolo de secuenciación del bisulfito que está específicamente diseñado para interrogar a metilación del mtDNA. Las diferencias con la secuenciación del bisulfito de protocolos utilizados para la extracción de ADN genómico se encuentra en la utilización de un paso de digestión de la enzima de la restricción anterior y un análisis Bioinformático predominante hacia fuera falso positivo derivados NUMT secuencias.
Proporcionamos un protocolo para evitar artefactos de secuenciació.......
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Divulgaciones
Los autores tienen intereses financieros que compiten para declarar.
Agradecimientos
Novo Nordisk Fundación Centro para la investigación metabólica básica es un centro independiente de investigación en la Universidad de Copenhague, parcialmente financiado por una donación sin restricciones de la Fundación de Novo Nordisk.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| Kit de metilación de rayos de ADN EZ | Zymo Research | # D5030 | |
| Ensayo Qubit ssDNA | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Tubos de ensayo Qubit | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq más kit de ADN polimerasa | Qiagen | # 203603 | |
| Kit de extracción de gel QIAquick | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit para Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligos para Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| Chip de ADN de alta sensibilidad | Agilent | # 5067-4626 | |
| Ensayo de dsDNA de alta sensibilidad Qubit | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| Kit de reactivos MiSeq v2 300 ciclos | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Hidróxido de sodio | Sigma | # S5881 | |
| Termociclador C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Sistema de detección PCR en tiempo real | Biorad | #1855195 | |
| Fluorómetro Qubit | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| Instrumento MiSeq | Illumina | # SY-410-1003 |
Referencias
- Falkenberg, M., Larsson, N. -G., Gustafsson, C. M. DNA replication and transcription in mammalian mitochondria. Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).
- Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -H., Kaufman, B. A.
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Reimpresiones y permisos
