Optogenetics identificación de un tipo Neuronal con un vidrio Optrode en ratones despiertos

Resumen

Este trabajo presenta un método para realizar un optogenetic de una sola unidad grabación fiable desde un ratón despierto utilizando un optrode de cristal a medida.

Resumen

Es una preocupación importante en Neurociencia cómo diferente tipos de neuronas funcionan en circuitos neurales. Los avances recientes en optogenetics han permitido la identificación del tipo neuronal en vivo experimentos electrofisiológicos en regiones amplias del cerebro. En experimentos de optogenetics, es fundamental para entregar la luz en el sitio de grabación. Sin embargo, a menudo es difícil entregar la luz del estímulo a las regiones profundas del cerebro de la superficie del cerebro. Sobre todo, es difícil para la luz de estimulación llegar a las regiones profundas del cerebro cuando la transparencia óptica de la superficie del cerebro es baja, como sucede a menudo con grabaciones de animales despiertos. Aquí, describimos un método para registrar respuestas de espiga a la luz de un ratón despierto utilizando un optrode de cristal a medida. En este método, la luz se proporciona mediante el electrodo de cristal de la grabación para que sea posible estimular confiablemente la neurona grabada con luz en las regiones profundas del cerebro. Este sistema de optrode por encargo consiste en materiales accesibles y de bajo costo y es fácil de montar.

Introducción

El sistema nervioso central consta de varios tipos de neuronas, que tienen diferentes funciones. Cómo funcionan estos tipos de neuronas dentro del circuito neural es una de las preocupaciones principales de la neurociencia. Sin embargo, en muchas regiones del cerebro, ha sido imposible distinguir los tipos neuronales en grabaciones en vivo de actividades eléctricas porque no hay clara diferencia en la señal de punto eléctrico, con algunas excepciones. Los avances recientes en optogenetics han hecho un gran avance^1,2. Uso de animales transgénicos que sensibles a la luz opsina (p. ej., channelr....

Protocolo

Todos los procedimientos se realizan con arreglo a los principios rectores de la sociedad fisiológica de Japón y con la aprobación de la Animal cuidado Comité de Kanazawa Universidad médica.

1. construcción del vidrio Optrode titular

Nota: Para construir un soporte de optrode de vidrio, se utiliza un soporte de electrodo comercial (figura 1A).

1. Extraiga con cuidado el tubo de acero para control de la presión del barril del titular.
2. Por perforación, ampliar el agujero del lado del asiento de pin en el cañón del titular. Hacer el agujero 3 mm de diámetro y 12 mm de p....

Resultados

En la figura 2, se analizaron los efectos del tamaño de la punta y la longitud de las pipetas de vidrio en la potencia de luz en la punta de las pipetas (figura 2A-B). La potencia de luz fue medida por un medidor de potencia óptica a 1 mm de la punta. La longitud total se estableció en 50 ± 2 mm cuando el tamaño de la punta varía, mientras que el tamaño de la punta fue a 2.5 μm cuando la longitud total varió. El .......

Discusión

Optogenetics se ha convertido en una herramienta poderosa en la neurociencia. Se ha utilizado para identificar tipos específicos neuronas en vivo así como manipular las actividades de vías neuronales específicas. La clarificación de las actividades neuronales de diferentes tipos neuronales promueve la comprensión del mecanismo de los circuitos neuronales. Aquí, hemos demostrado un método para proporcionar la luz en el sitio de grabación a través de un electrodo de vidrio en el IC de despiertas ratones VGAT ChR2........

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Portaelectrodos	Molecular Device	1-HL-U	Soporte de pipeta para amplificador de microelectrodos
Manguito de acoplamiento dividido cerámico	Férula Thorlabs	ADAF1	f2.5 mm
Espaciador de placa de circuito	Teishin Denki	SPA-320	f8.0 mm, 20.0 mm de largo
Marco estereotáxico para ratones	Narishige	SR-6M-HT	Instrumentos estereotáxicos para ratones
Manipulador	Narishige	NA	Manipulador manual
Superbond	Sun Medical	M: 204610557	Adhesivo dental cemento de resina
Form2	Impresora 3D	Formlabs	NA
Kwik-Sil	WPI	KWIK-SIL	Adhesivo de silicona de baja toxicidad
Capilares de vidrio de borosilicato	Narishige	GD-1.5	OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm de largo
Latiguillo de fibra óptica	Lentes Doric	MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5	Latiguillo monofibra óptica, diámetro exterior, 2,5 mm, núcleo = 960 mm, revestimiento = 1000 mm, NA = 0,63
Lentes dóricas	LED conectadas	LEDC-1B_FC Longitud de	onda central = 465 nm, potencia de salida = 45 mW (Core 960 mm 0,63 NA )
Controlador LED	Lentes Doric LEDRV_1CH_1000		1 canal Controlador LED, salida máxima = 1000 mA
Extractor de electrodos	Narishige	PB-7	Extractor de micropipetas de vidrio de doble etapa
Capilar de vidrio de borosilicato	Narishige	GD-1.5	Capilar de vidrio de bolosilicato, OD, 1,5 mm, ID, 0,9 mm, 90,0 mm de largo
GENTACIN	MSD CO., Ltd	185711173	Pomada antibiótica
Terramycin®-LA	Zoetis	G 333	Oxytetraciclina
Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J	Jackson Labs	#14548	VGAT-ChR2 ratones
Multiclamp 700B	Molecular Devices	2500-0157	Amplificador de microelectrodo