Aquí, discutimos una serie de protocolos para la inducción y validación de senescencia celular en células cultivadas. Nos enfocamos en diferentes estímulos de inducción de senescencia y describir la cuantificación de los marcadores comunes asociados a senescencia. Proporcionamos detalles técnicos utilizando fibroblastos como modelo, pero los protocolos se adaptan a varios modelos de celulares.
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Artículo de método
Inducción y validación de senescencia celular en las células humanas primarias
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Resumen
Resumen
Senescencia celular es un estado de detención permanente ciclo celular activado en respuesta a diversos estímulos nocivos. Activación de la senescencia celular es una de varias condiciones fisiopatológicas, incluyendo supresión tumoral, remodelación y el envejecimiento del tejido. Los inductores de la senescencia celular en vivo se caracterizan todavía mal. Sin embargo, un número de estímulos puede utilizarse para promover la senescencia celular ex vivo. Entre ellos, inductores de senescencia más comunes son agotamiento replicativa, ionizantes y no ionizantes, drogas genotóxicas, estrés oxidativo y desmetilantes y acetylating agentes. Aquí, daremos instrucciones detalladas sobre cómo usar estos estímulos para inducir a los fibroblastos en senescencia. Este protocolo puede ser fácilmente adaptado para diferentes tipos de líneas celulares, incluyendo las células cancerosas y células primarias. También se describen diferentes métodos para la validación de la inducción de senescencia. En particular, nos centramos en la medida de la actividad de la enzima lisosomal asociada a la senescencia de β-galactosidasa (SA-β-gal), la tasa de síntesis de ADN usando 5-ethynyl-2'-desoxiuridina (EdU) incorporación análisis, los niveles de expresión del ciclo celular inhibidores de la p16 y p21 y la expresión y secreción de los miembros del fenotipo secretor Senescence-Associated (spas). Por último, proporcionamos resultados de ejemplo y discutir otras aplicaciones de estos protocolos.
Introducción
En 1961 Hayflick y Moorhead informaron que primaria fibroblastos en cultivo pierden su potencial proliferativo después de pasajes sucesivos1. Este proceso es causado por la reducción secuencial de telómeros después de cada división celular. Cuando los telómeros alcanzan una longitud crítica corta, son reconocidos por la respuesta al daño del ADN (DDR) que activa una detención irreversible de la proliferación, también denominado senescencia replicativa. Senescencia replicativa es actualmente uno de los muchos estímulos que son conocidos por inducir un estado de detención permanente ciclo celular que hace que las células insensibles a los mitógen....
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Protocolo
1. general preparación
- Preparar medio de D10. Suplemento medio-Glutamax DMEM con 10% de SBF y el 1% de penicilina/estreptomicina (concentración Final: 100 U/mL).
- Preparación de PBS estéril. Disolver las tabletas en agua según las instrucciones del fabricante. Esterilizar por autoclave.
- Preparar tripsina x 1. Diluir 5 mL de tripsina-Versene EDTA/10 x 1:10 en 45 mL de PBS estéril.
Nota: En el protocolo, usamos las condiciones de cultivo de células que están más cercanos las fisiológicas condiciones para fibroblastos primarios. Esto significa que nos Incube las células a 37 ° C y 5% CO2 como es normalmente hecho pero con....
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Resultados
Enriquecimiento de tinción SA-β-gal en fibroblastos senescentes
Β-galactosidasa (β-gal) es una enzima lisosomal que se expresa en todas las células y que tiene un pH óptimo de 4.025,26. Sin embargo, durante la senescencia, lisosomas aumentan de tamaño y, en consecuencia, las células senescentes acumulan a β-gal. La mayor cantidad de esta enzima hace posible detectar su acti.......
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Discusión
Los protocolos explicados aquí fueron optimizados para fibroblastos primarios humanos, particularmente las células BJ y WI-38. Los protocolos para la senescencia replicativa, radiaciones ionizantes y doxorrubicina, se han aplicado con éxito a otros tipos de fibroblastos (HCA2 y IMR90) y en otros tipos celulares (es decir neonatales melanocitos y queratinocitos o cardiomiocitos derivados de iPSC) en nuestro laboratorio. Sin embargo, las adaptaciones de los tipos de células adicionales pueden optimizarse ajustando algunos .......
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Agradecimientos
Agradecemos a los miembros del laboratorio Demaria para discusiones fructíferas y Thijmen van Vliet para compartir datos y protocolo en la senescencia inducida por UV.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM Media - GlutaMAX | Gibco | 31966-047 | |
| Hiclona | de suero bovino fetal | SV30160.03 | |
| Penicilina-estreptomicina (P/S; 10,000 U/ml) | Lonza | DE17-602E | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | SC-202581 | |
| Agua libre de nucleasas (no tratada con DEPC) | Ambion | AM9937 | |
| Matraz T75 | Sarstedt | 833911002 | |
| Solución de Tripsina/EDTA Lonza | CC-5012 | ||
| PBS comprimidos | Gibco | 18912-014 | |
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | ||
| Corning Tubos de centrífuga de 15 mL | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| placa de 6 pocillos | Sarstedt | 83.3920 | |
| Placa de 24 pocillos | Sarstedt | 83.3922 | |
| cubreobjetos redondos de 13 mm | Sarstedt | 83.1840.002 | |
| Steriflip | Merck Chemicals | SCGP00525 | |
| Cesio137 fuente | IBL 637 Cesio-137γ-máquina de rayos | ||
| UV cámara | Opsytec, Dr. Gö bel BS-02 | ||
| Dihidrocloruro de doxorrubicina | BioAustralis Fine Chemicals | BIA-D1202-1 | |
| Solución de peróxido de hidrógeno | Sigma-Aldrich | 7722-84-1 | |
| 5-aza-2'-desoxicitidina | Sigma-Aldrich | A3656 | |
| SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 | |
| Butirato de sodio | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| X-gal (5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido) | Fisher Scientific | 7240-90-6 | |
| Ácido cítrico monohidratado | Sigma-Aldrich | 5949-29-1 | |
| Fosfato dibásico de sodio | Acros organics | 7782-85-6 | |
| Ferrocianuro de potasio | Fisher Scientific | 14459-95-1 | |
| Ferricianuro de potasio | Fisher Scientific | 13746-66-2 | |
| Cloruro de sodio | Merck Millipore | 7647-14-5 | |
| Cloruro de magnesio | Fisher Chemicals | 7791-18-6 | |
| 25% de glutaraldehído | Fisher Scientific | 111-30-8,7732-18-5 | |
| 16% de formaldehído (p/v) | Thermo-Fisher Scientific | 28908 | |
| EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina) | Lumiprobe | 10540 | |
| Sulfo-Cyanine3 azida (Sulfo-Cy3-Azide) | Lumiprobe | D1330 | |
| Ascorbato de sodio | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sulfato de cobre (II) pentahidratado (Cu(II)SO4.5H2O) | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Triton X-100 | Acros orgánicos | 215682500 | |
| TRIS base | Roche | 11814273001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 384, blanco | Lámina | ||
| Lightcycler 480 | Kit Roche | 4729757001 | |
| Sensifast Probe Lo-ROX | Bioline | BIO-84020 | |
| Biblioteca de sondas UPL | Sigma-Aldrich | Varios | |
| humanos IL-6 DuoSet ELISA | R& D | D6050 | |
| Bio-Rad TC20 | Bio-Rad | ||
| Portaobjetos de recuento | Bio-Rad | 145-0017 | |
| Incubadora seca | Thermo-Fisher Scientific | Heratherm | |
| Dimetilformamida | Merck Millipore | 1.10983 | |
| Parafilm 'M' película de laboratorio | Bemis | ||
| Pinzas | |||
| Agujas |
Referencias
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
- Sharpless, N. E., Sherr, C. J.
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Reimpresiones y permisos
