Seguimiento de la expresión génica mediante la detección de actividad de β-galactosidasa en embriones de ratón todo

María José Blanco; Ana I.R. Learte; Miguel A. Marchena; Emma Muñoz-Sáez; María Antonia Cid; Iván Rodríguez-Martín; Cristina Sánchez-Camacho

doi:10.3791/57785

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Artículo de método

Seguimiento de la expresión génica mediante la detección de actividad de β-galactosidasa en embriones de ratón todo

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DOI:

10.3791/57785

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26 de junio de 2018

María José Blanco^*¹ , Ana I.R. Learte^*¹ , Miguel A. Marchena¹ , Emma Muñoz-Sáez¹ , María Antonia Cid¹ , Iván Rodríguez-Martín¹ , Cristina Sánchez-Camacho²^,³

¹Faculty of Biomedical and Health Sciences, Universidad Europea de Madrid, ²Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), ³School of Doctoral Studies and Research, Universidad Europea de Madrid

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí describimos el protocolo estándar para la detección de actividad de β-galactosidasa en embriones de ratón todo principios y el método de parafina de seccionamiento y contratinción. Este es un procedimiento fácil y rápido para controlar la expresión génica durante el desarrollo que puede aplicarse también a las secciones de tejido, órganos o células cultivadas.

Resumen

La Escherichia coli LacZ codificación del gene, β-galactosidasa, se utiliza en gran parte como reportera de expresión génica y como trazador en estudios de linaje celular. La reacción histoquímica clásica se basa en la hidrólisis del sustrato X-gal en combinación con los iones férricos y ferrosos, que produce un precipitado insoluble de azul que es fácil de visualizar. Por lo tanto, actividad β-galactosidasa sirve como marcador para el patrón de expresión del gen de interés, medida que avanza el desarrollo. Aquí describimos el protocolo estándar para la detección de actividad de β-galactosidasa en embriones de ratón todo temprano y el posterior método de parafina de seccionamiento y contratinción. Además, se proporciona un procedimiento para clarificar todo embriones para visualizar mejor coloración en regiones más profundas del embrión de X-gal. Resultados se obtienen mediante la realización de este procedimiento, aunque optimización de condiciones de la reacción es necesaria para minimizar la actividad de fondo. Limitaciones en el análisis se deben también considerar, particularmente con respecto al tamaño del embrión en el Monte toda la coloración. Nuestro protocolo proporciona un sensible y un método confiable para la detección de β-galactosidasa durante el desarrollo del ratón que puede ser aún más aplicado a las secciones de criostato como órganos enteros. Así, los patrones de expresión dinámica gene a lo largo del desarrollo se pueden analizar fácilmente mediante el uso de este protocolo en embriones de todo, pero también expresión detallada a nivel celular puede ser evaluada después de parafina secciones.

Introducción

Para describir los patrones de expresión del gen específico, el uso de genes como marcadores del reportero ha sido primordial de Drosophila a mamíferos. En experimentos con animales transgénicos y knockout, el gen bacteriano de la β-galactosidasa (LacZ) de Escherichia coli (e. coli) es uno de los más utilizados¹^,²^,³^, ⁴. β-galactosidasa (β-gal) cataliza la hidrólisis de β-galactósidos (como la lactosa) en sus monosacáridos (glucosa y galactosa)⁵. Su sustrato más utilizado es X-gal (5....