Method Article

Desplegable base de biotina de ensayo a validar mRNA miRNAs objetivos de celular

DOI:

10.3791/57786

⸱

June 12th, 2018

 ,  ,  , 
1School of Biotechnology, Kalinga Institute of Industrial Technology University, 21. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology, Meharry Medical College, 3Kalinga Institute of Industrial Technology University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este informe describe un método rápido y confiable para la validación de blancos del mRNA de miRNAs celular. Los usos del método biotinilado sintético basado en la LNA de ácido nucleico bloqueado miRNA imita para capturar objetivo mRNA. Posteriormente, se emplean bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina para telecine blanco mRNA para la cuantificación por reacción en cadena de polimerasa qPCR.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs (miRNAs) son una clase de pequeños RNAs noncoding que regulan la expresión génica celular post-transcriptionally. MiRNAs atar a la región 3' no traducida (UTR) de blanco mRNA para inhibir la traducción de la proteína o en algunos casos causar degradación del mRNA. La Unión de lo miRNA a los 3' UTR del mRNA es mediada por una secuencia de semilla de 2 – 8 nucleótidos en el extremo 5' de miRNA blanco. Mientras que el papel de miRNAs como moléculas reguladoras celulares está bien establecido, la identificación de los mRNAs de destino con relevancia funcional sigue siendo un desafío. Herramientas bioinformáticas han sido empleados para predecir las secuencias dentro de los 3' UTR de los mRNAs como blancos potenciales para el atascamiento de miRNA. Estas herramientas también se han utilizado para determinar la conservación evolutiva de estas secuencias entre especies relacionadas en un intento de predecir el papel funcional. Sin embargo, estos métodos a menudo generan resultados falsos positivos y se limitan a predecir la interacción canónica entre miRNA y mRNA. Por lo tanto, los procedimientos experimentales que miden la Unión directa de miRNA a su objetivo de mRNA son necesarios establecer interacción funcional. En este informe, describimos un método sensible para la validación de interacción directa entre el celular miRNA miR-125b y 3' UTR de PARP-1 mRNA. Elaboramos un protocolo en el que fueron transfectados imitadores sintéticos biotinilado-miRNA en células de mamíferos y el complejo de miRNA-mRNA en el lisado celular fue derribado con bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina. Por último, el objetivo de que mRNA en el ácido nucleico de tiró-abajo complejo se cuantificó usando una estrategia basada en qPCR.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs (miRNAs) son pequeños no-codificación RNAs que regulan negativamente la expresión de proteína1. Precursores de miRNA residen en racimos a través de muchas regiones del genoma, más frecuentemente en las regiones intergénicas e intrones de genes proteína-codificación2,3. Biogénesis de miRNAs implican la transcripción de los pri-miRNAs de codificación miRNA genes4. Los pri-miRNAs son sometidos a procesamiento secuencial, primero en el núcleo y luego en el citoplasma para generar miRNAs maduros trenzado solo4,5. Posteriormente, los miRNAs maduros se incorporan en el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC): un complejo de ARN-proteína multimérica que incluye un miembro de la familia de Argonaute proteínas objetivo reconocimiento4,5, 6,7. MiRNAs maduros en el complejo RISC predominante se unen a los 3' UTR de destino mRNAs8,9,10 pero de vez en cuando también puede enlazar en la codificación y la región 5' UTR del mRNA10,11 . La Unión de miRNA en el mRNA secuencias resultados en traslacional silenciamiento12,13,14 y en algunos casos mRNA desestabilización15. Puesto que un único miRNA puede apuntar muchos mRNAs, estas moléculas reguladoras están involucradas en casi todos los procesos celulares y han sido implicadas en varias enfermedades condiciones16,17,18.

Comprensión detallada de cómo miRNAs regulan vías celulares requiere la identificación de los mRNAs de destino. Múltiples plataformas de Bioinformática están disponibles para predecir miRNA:mRNA supuesta interacciones19,20. Estas predicciones se basan en Watson-Crick base maridaje perfecto entre la secuencia de semilla de 2 – 8 nucleótidos de la miRNA y una secuencia complementaria dentro de la meta ARNm4,21. Además, estas herramientas generan estructura secundaria del miRNA:mRNA duplex, calcular parámetros termodinámicos de esta interacción molecular y mostrar la conservación de los sitios de unión a través de especies para mejorar la relevancia funcional de la meta predicción. Lamentablemente, estas herramientas también tienen la limitación de la predicción de falsos objetivos positivos a una tasa muy alta (~ 27 – 70%)15,22. Lo más importante, estas plataformas en silico incapaces de reconocer las interacciones no-canónico de miRNAs con sus objetivos23. Por lo tanto, tales análisis predictivos son a menudo combinados con métodos experimentales para validar objetivos funcionalmente relevantes.

Varios enfoques se han desarrollado para validar experimentalmente la interacción miRNA:mRNA. Experimentos genéticos con miRNA imitadores, esponjas e inhibidores que alteren los niveles de miRNAs en la célula proporcionan pistas por su efecto regulador sobre el objetivo gene expresión24,25,26. Además, reportero basado en análisis mediante la transfección de un clon que contiene la región 3' UTR de los imitadores de mRNA y miRNA blanco o inhibidores en las células proporcionan pruebas de la función reguladora de miRNAs26. Mientras que estos métodos son cruciales para el estudio de la regulación postranscripcional de la expresión génica por miRNAs, transfección eficiencia y pleotropic efectos de las alteraciones en los niveles de miRNA de celular son principales limitaciones de estos enfoques genéticos23, 26. Por lo tanto, se emplean métodos bioquímicos complementarios que probe una interacción directa entre miRNA y su objetivo para entender mejor la función celular de miRNAs.

Un método ampliamente utilizado para el estudio de la interacción directa entre miRNA y su objetivo es la inmunoprecipitación de lo complejo RISC seguido por la detección de objetivo de mRNA en el complejo27,28,29,30 . Recientemente, un método mejorado de la trampa RISC también fue utilizado para identificar objetivos de miRNA; parejas estabilización de objetivos dentro de los intermedios de RISC-miRNA-mRNA con la purificación de las blancos del mRNA. Sin embargo, estos methodsface los desafíos inherentes de interacciones no específicas entre proteínas RNA y RNA-que ata que generalmente están separadas en compartimentos celulares31,32. Además, estos ensayos son dependientes en la presencia de antes2 proteínas por inmunoprecipitación de los complejos RISC33. Dado que antes2 no es el único argonaute para mediar las interacciones miRNA:mRNA eficiente, exclusión de otras argonautes podría conducir a resultados sesgados34. Por lo tanto, se necesitan estrategias alternativos para estudiar la Unión directa de miRNA al mRNA.

En este informe, elaboramos un enfoque de un solo paso para sondear la interacción directa entre un miRNA y su objetivo de mRNA. En primer lugar, 3' ácidos nucleicos (LNA) biotinilado bloqueado miRNA imitadores son transfectados en células de mamíferos. Entonces, el miRNA:mRNA en el lisado celular es capturado mediante bolas magnéticas recubierta de estreptavidina. El objetivo de ARNm a su complementaria miRNA se cuantifica mediante qPCR.

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Protocol

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1. transfección de 3'-biotinilado miRNA

Nota: Realice los siguientes pasos dentro de una campana de flujo laminar estéril.

  1. Semilla 4 x 105-5 x 105 HEK-293T células por pocillo en 2 mL de completan modificado Eagle Medium (DMEM de Dulbecco) [DMEM suplementado con 10% de suero Fetal bovino (FBS) y 1 x antibiótico Pen-strep]. Las células en una incubadora a 37 ° C, 5% CO2 durante la noche de la cultura.
  2. Al día siguiente, Compruebe la salud y la adherencia de las células plateadas bajo un microscopio de luz.
    Nota: Asegúrese de que las células tienen adheridos y logró morfología apropiada antes de proceder al siguiente paso. Las células HEK-293T están normalmente preparadas para transfección 18 – 24 h post chapado.
  3. En un tubo de microcentrífuga estéril de 1,7 mL, diluir 75 picomoles de miRNA biotinilado en 200 μL de medio esencial mínimo. Transferir esta mezcla a otro 1,7 mL microcentrífuga tubo que contiene liposomas basado en la transfección reactivo (8 μL/pocillo) diluido en 200 μL de medio esencial mínimo. Mezclar muy bien, pero suavemente, transfiriendo e incubar durante 20-25 min a temperatura ambiente para permitir la formación de los complejos de transfección.
  4. Quitar los viejos medios de comunicación de la placa de cultivo bien 6 mediante pipeteo suave y llenar cada pozo con 1.6 mL de DMEM completo recién preparado (sin 1 x antibióticos Pen-strep).
  5. Añadir los complejos de transfección (de 1,3) mediante goteo a las células en la placa de 6 pozos con una pipeta bien calibrada. Agitar la placa suavemente añadiendo los complejos para asegurar su distribución uniforme en toda la placa.
    Nota: Este paso es muy importante para lograr alta eficiencia transfección y debe realizarse con cuidado y paciencia.
  6. Las células a 37 ° C y 5% de CO2 durante al menos 36 h de cultivo.

2. preparación de Streptavidin recubierto de granos magnéticos —

  1. Resuspender las bolas magnéticas de estreptavidina completamente por Vortex. Transferencia 30 μl de la suspensión de grano (por ejemplo) a un tubo de microcentrífuga libre de nucleasa de 2 mL.
  2. Coloque el tubo que contiene la suspensión de grano en el stand de separador magnético del grano ("imán" de ahora en adelante) por 2 min. Después de asegurarse que los granos son atraídos hacia el lado del tubo en contacto con el imán, retire con cuidado el sobrenadante usando una micropipeta.
  3. Añadir 100 μl de tampón de lavado del grano (10 mM Tris-Cl de pH 7.5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl) a los granos. Retire el tubo del imán. Vortex por 15 s a temperatura ambiente para lavar los granos.
  4. Coloque el tubo que contiene granos en el imán por 2 min y cuidadosamente retire y descarte el sobrenadante.
  5. Repita los pasos 2.3 y 2.4 para un total de tres lavados. Después del paso del último lavado, retire el tubo del imán.
  6. Añada 100 μl de Rnasa liberación de solución (0,1 M NaOH, 0.05 M NaCl) a los granos, mezclar bien todo con un vórtex durante 15 s, incubar a temperatura ambiente por 5 minutos Coloque el tubo que contiene granos en el imán por 2 min y cuidadosamente retire y descarte el sobrenadante.
  7. Repita el paso 2.6 para un total de tres veces.
  8. Añadir solución de resuspensión de grano (0.5 M NaCl) a los granos, agitarlos durante 15 s e incubar a temperatura ambiente 5 minutos colocar los granos resuspendidos en el imán por 2 min y retire con cuidado el sobrenadante.
  9. Añadir 200 μL de bolas bloqueando (1 μg/μl de BSA, tRNA de la levadura de 2 μg/μl) de solución para los granos. Mezclar con un vórtex suave de 15 s a temperatura ambiente. Incubar a 4 ° C durante 16 h (noche) en un agitador de tubo múltiples.

3. preparación de Lysates de la célula

  1. Cosechar las células HEK-293T transfected raspando suavemente con un raspador celular estéril dentro de la campana laminar, luego transferir cada muestra en un tubo de microcentrífuga estéril de 2 mL.
  2. Sedimenten las células raspadas por centrifugación a 1.500 x g por 5 min Resuspender el precipitado en 1 x estéril PBS (tampón fosfato salino), pH 7.2. Centrifugar nuevamente a 1.500 x g durante 5 min obtener un pellet de restos de medios. Inmediatamente le hunda el tubo que contiene pellets en hielo.
  3. Preparar el tampón de lisis celular completo fresco (150 mM NaCl, 25 mM Tris-Cl, pH 7.5, 5mM DTT, 0.5% IGEPAL, 60 Superase U/mL, 1 x inhibidor de la proteasa).
    Nota: Un stock de tampón de lisis de la célula falta IGEPAL, Superase y proteasa inhibidor cóctel se puede preparar con antelación y conservado a temperatura ambiente. Prepara un nuevo lote de tampón de lisis celular completa añadiendo los suplementos arriba en las concentraciones finales recomendadas para el tampón de lisis celular de stock y almacenamiento en hielo.
  4. Añadir 260 μl de tampón de lisis celular completa helada a cada muestra en el tubo de microcentrífuga (es decir, cada tubo de microcentrífuga contiene células extraídas de un pozo de la placa de 6 pozos) y resuspender el precipitado de células en una suspensión homogénea mediante pipeteo.
  5. Lyse las células utilizando el método de congelación y descongelación: incubar los tubos a-80 ° C por 10 – 15 minutos. Entonces, permita que las células se descongele el hielo.
  6. Centrifugue la célula resultante lisada a 16.000 x g por 5 min en una centrífuga de mesa refrigerada a 4 ° C.
  7. Transferencia de la célula despejada lisada a un tubo de microcentrífuga estéril 1,7 mL en hielo. Deseche los pellets.
    Nota: El volumen final de despejó lisado debe ser ~ 240 – 250 μl.
  8. Añadir 5 M NaCl a la despejada lisado a una concentración final de 1M y mantener las muestras en hielo.

4. elaboración de bolas magnéticas de estreptavidina-II

  1. Preparar fresco lavado abatible completo buffer (10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 5 mM DTT, 1 M NaCl, 0,5% IGEPAL, 60U/mL Superase y 1 x inhibidor de la proteasa cóctel)
    Nota: Una culata desplegable de tampón de lavado falta IGEPAL, Superase y proteasa inhibidor cóctel se puede preparar con antelación y conservado a temperatura ambiente. Prepara un nuevo lote de tampón de lisis celular completa añadiendo los suplementos arriba en las concentraciones finales recomendadas para el tampón de lisis celular de stock y almacenamiento en hielo.
  2. Coloque el tubo que contiene los granos preparados (en el paso 2.9) en el imán para 2 minutos cuidadosamente retiren y descarte el sobrenadante.
  3. Añadir 150 μL de tampón de lavado completo helada del desplegable a los granos. Vortex por 15 s e incubar a temperatura ambiente durante 30-60 s. lugar los tubos en el imán durante 2 min con cuidado retiren y descarte el sobrenadante.
  4. Repita el paso 4.3 para un total de 3 veces.
  5. Resuspender los granos en 300 μL de tampón de lavado completo desplegable.

5. pull-down de complejos de mRNA-miRNA blanco

  1. Transferir 300 μL de la célula lisada (de paso 3.8) para el tubo de microcentrífuga con 300 μL de granos (desde el paso 4.5).
  2. Incubar la mezcla en un mezclador oscilante por 1 h a temperatura ambiente.
  3. Coloque el tubo en el imán de 5 minutos Retire con cuidado y deseche el sobrenadante.
  4. Añadir 300 μL de tampón de lavado completo helada del desplegable a los granos. Vortex por 15 s a temperatura ambiente y lugar el tubo sobre el imán por 5 min con cuidado retire y descarte el sobrenadante.
  5. Repita el paso 5.4 dos veces más.
  6. Resuspender los granos en 100 μl de agua libre de nucleasas e incubar en hielo.

6. total extracción de ARN, síntesis de cDNA y qPCR

  1. Extraiga el ARN total de las cuentas resuspendidas (del paso 5.6) usando un método apropiado (véase Tabla de materiales). Resuspender el RNA total extraído en 25 μl de agua libre de nucleasa. Determinar la concentración de RNA y calidad utilizando un espectrofotómetro (absorbancia a 260/280). Preparar una bolsa de trabajo de ARN a 50 ng/μl.
  2. Realizar síntesis de cDNA, en triplicado, usando 50 ng de RNA total (en el paso 6.1) mediante una síntesis de cDNA correspondiente kit (véase Tabla de materiales) usando las cartillas de oligo dT en un volumen final de 20 μl (tabla 1). A continuación, carga los tubos de PCR en el instrumento de qPCR para realizar ciclos térmicos según las condiciones descritas en la tabla 2.
  3. Realizar la qPCR en el CDNA (desde el paso 6.2) usando química SYBR Green (véase tabla de materiales):
    1. Llevar a cabo todas las reacciones de la qPCR en triplicado en una placa de 96 inferior bien claro en condiciones estériles.
    2. Alícuota 9 μl de la mezcla de reacción de la qPCR master mix (ver tabla 3) en cada pocillo de la placa. Luego, añadir 1 μl de cDNA en cada pocillo para alcanzar un volumen final de 10 μl. sellar la placa PCR utilizando sellador de placas PCR resistente al calor y la carga en el instrumento de qPCR
    3. Realizar ciclos térmicos según las condiciones descritas en la tabla 4.
    4. Normalizar los niveles de expresión (valores de Ct) de cada muestra que los niveles de expresión del control revuelto. Use estos valores para calcular el doble de cambios en la expresión.

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Results

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MiRNAs regulan procesos celulares atando a mRNAs de destino. Por lo tanto, identificar objetivos de mRNA son una clave para entender la función de miRNA. Aquí elaboramos un método para identificar el destino de mRNA de miRNA celular. Este protocolo es una adaptación de Wani et al. 35 con la modificación de utilizar biotinilado miRNA basada en LNA imita a telecine blanco mRNA. El uso de oligonucleótidos basadas en LNA imitadores mejora la especificidad del ...

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Discussion

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Identificación de dianas de mRNA de miRNAs celular es importante para la comprensión de su función reguladora. Se emplean varias herramientas computacionales para predecir objetivos basados en la complementariedad de secuencia de semillas y la conservación del destino secuencias19,20. Aunque estas herramientas son valiosas, pueden generar altos niveles de falsos positivos y falsos negativos. Por lo tanto, estas predicciones están acompañadas con métodos experimen...

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Disclosures

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Los autores no declaran a no financieros y los intereses en competencia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue financiado en parte por donaciones de institutos nacionales de salud (NIH) DA037779 (a J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 y MD007586 (en C.D.). El trabajo fue apoyado también por el RCMI Grant G12MD007586, el Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, el centro de investigación traslacional de Meharry (MeTRC) CTSA conceder (U54 RR026140 de NCRR/NIH, el U54 Grant MD007593 de NIMHD/NIH y del centro de Tennessee para el SIDA Investigación (P30 AI110527).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Línea celular- célulasHEK293T ATCCCRL-3216
Suero fetal bovino inactivado por calor (Hi-FBS)GIBCO/Thermofisher10438-026
Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM)GIBCO/Thermofisher11995-065
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) (1x)GIBCO/Thermofisher20012-027
Tripsina-EDTA (0,25%) GIBCO/Thermofisher25200-056
Solución de penicilina-estreptomicina (100x)Cellgro/Mediatech30-002-CI
DNasa AmbionAM2238
Opti-MEM Medios de suero reducidosGIBCO/Thermofisher3198-088
Liopfectamine 2000 Reactivo de transfecciónInvitrogen/ Thermofisher11668-019
Has-miR-125b biotiniladoExiqon339178/ID-27281622
Control revuelto biotiniladoExiqon479997-671/ID-714884
IGEPALSigma-Aldrich18896
Estreptavidina Perlas magnéticasPierce88816
Levadura ARNtInvitrogen/Thermofisher15401-011
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma-AldrichA2153
Solución de cloruro de potasio (KCl)Sigma-Aldrich60142
Cloruro de magnesio (MgCl2)Sigma-AldrichM1028
Hidróxido de sodio (NaOH)Sigma-Aldrich795429
Ácido etilendiaminotetraacético, solución de sal disódica (EDTA), 0,5 M, pH 8,0Sigma-AldrichE7889
Ditiotreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815
SuperaseAmbion/ThermofisherAM2694
Cóctel de inhibidores de proteasaSigma-AldrichP8340
Agua sin ARNasa/ADNasaGIBCO/Thermofisher10977-015
RNkit de extracción fácilQiagen74104
iScript-Select kit de síntesis de ADNcBiorad170-8897
qPCR Primers Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR green supermixBiorad172-5120
DynaMag-Spin MagnetInvitrogen/Thermofisher12320D

References

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