Artículo de método

Montaje rápido, escalable y la carga de proteínas bioactivas y los inmunoestimulantes en diversos Nanocarriers sintético vía Flash Nanoprecipitation

DOI:

10.3791/57793

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11 de agosto de 2018

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1Interdisciplinary Biological Sciences, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University

En este artículo

Resumen

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Nanomateriales ofrecen versátiles mecanismos de entrega terapéutica controlada para aplicaciones aplicadas y ciencia básica, pero su fabricación a menudo requiere conocimientos que no está disponible en laboratorios biomédicos más. Aquí, presentamos protocolos de fabricación escalable y carga terapéutica de diversos nanocarriers uno mismo-montado usando flash nanoprecipitation.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanomateriales presentan una amplia gama de opciones para personalizar la entrega controlada de cargas moleculares individuales y combinados para aplicaciones terapéuticas y proyección de imagen. Esta especificidad creciente puede tener importantes implicaciones clínicas, incluyendo la disminución de efectos secundarios y dosis más bajas con mayor potencia. Además, el en situ dirigidos a modulación controlada de subconjuntos específicos de la célula puede mejorar las investigaciones in vitro e in vivo de fenómenos biológicos básicos y sonda en función de la célula. Por desgracia, los conocimientos requeridos en ciencia de la nanoescala, la química y la ingeniería a menudo prohíben laboratorios sin experiencia en estos campos de fabricación y personalización de nanomateriales como herramientas para sus investigaciones o vehículos para su estrategias terapéuticas. Aquí, le ofrecemos protocolos para la síntesis y ensamblaje escalable de un sistema de copolímero de bloque no tóxico versátil susceptible a la fácil formación y carga de los vehículos de escala nanométrica para aplicaciones biomédicas. Nanoprecipitation flash se presenta como una metodología para la fabricación rápida de diversas nanocarriers de poly(ethylene glycol) -bl-copolímeros de poli (sulfuro de propileno). Estos protocolos permitirá laboratorios con una amplia gama de conocimientos y recursos para fácil y reproducible fabricar nanocarrier avanzados sistemas para sus aplicaciones. Procesan de diseño y construcción de un instrumento automatizado que emplea una bomba de jeringa de alta velocidad para facilitar el nanoprecipitation flash y para permitir mayor control sobre la homogeneidad, tamaño, morfología y carga de nanocarriers de polymersome es se describe.

Introducción

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Nanocarriers permiten la liberación controlada de carga pequeña y macromolecular, incluya entidades activas, que si no encapsulado, sería altamente degradable o demasiado hidrofóbico para administración en vivo. De las morfologías nanocarrier regularmente fabricadas, vesículas poliméricas análogas a liposomas (también llamados polymersomes) ofrecen la posibilidad de cargar simultáneamente hidrofílicos e hidrofóbicos carga1,2. A pesar de sus ventajas prometedoras polymersomes son todavía raros en aplicaciones clínicas debido, en parte, a varios retos en su fabricación. Para uso clínico, polymersome formulaciones deben ser en lotes a gran escala, estériles y consistentes.

Un número de técnicas puede utilizarse para forma polymersomes de un copolímero del diblock, tales como poly(ethylene glycol) -bloque-poli (sulfuro de propileno) (PEG -bl- PPS), que incluyen dispersión solvente3, película delgada rehidratación1 , 4, 5,de microfluídica6e hidratación directa7. Solvente dispersión implica tiempos de incubación en presencia de solventes orgánicos, que puedan desnaturalizar algunas cargas bioactivos, como las proteínas. Rehidratación de película delgada no ofrece control sobre la polidispersidad de la polymersomes formado, a menudo requiere técnicas de extrusión costoso y desperdiciador de tiempo para lograr monodispersity aceptable. Además, microfluids e hidratación directa son difíciles de escala para grandes volúmenes de producción. De los métodos de fabricación diferentes nanocarrier, flash nanoprecipitation (FNP) ofrece la posibilidad de hacer formulaciones a gran escala y reproducible8,9,10. Mientras que la FNP estaba reservado previamente para la formulación de nanopartículas de núcleo macizo, nuestro laboratorio ha ampliado recientemente el uso de FNP para incluir la formación constante de diversos PEG -bl- PPS nanoestructura morfologías11, 12, incluyendo polymersomes11 y bicontinuas nanoesferas12. Se encontró que la FNP fue capaz de formar monodispersa formulaciones de polymersomes sin necesidad de extrusión, resultando en valores de índice de polidispersidad superior comparados con no sacó polymersomes formado por dispersión de rehidratación y solvente de película delgada 11. bicontinuas nanoesferas, con sus grandes dominios hidrofóbicos, no fueron capaces de formar por rehidratación de película delgada, a pesar de formar un número de condiciones solvente con FNP12.

Aquí, ofrecemos una descripción detallada para la síntesis de la PEG - copolímero de diblockbl- PPS usado en la formación de polymersome, el mezclador de jets (CIJ) de choque confinado utilizado para la FNP, el FNP protocolo sí mismo y la implementación de un sistema automatizado para reducir la variabilidad del usuario. Información sobre cómo esterilizar el sistema lo suficiente como para producir formulaciones libres de endotoxinas para uso en vivoy datos representativos acerca de la caracterización de polymersomes formado por FNP está incluida. Con esta información, los lectores con interés en utilizar polymersomes para trabajo in vitro e in vivo podrán fabricar sus propias formulaciones monodispersa estéril. Lectores con experiencia en formulaciones nanocarrier y con conocimientos de síntesis del polímero será capaces de probar rápidamente sus propios sistemas de polímero mediante FNP como una alternativa posible a sus actuales técnicas de formulación. Además, los protocolos descritos pueden utilizarse como herramientas educativas para la formulación de nanocarriers en los cursos de laboratorio de nanotecnología.

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Protocolo

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1. síntesis de Poly(ethylene glycol) -bloque-poli (sulfuro de propileno)-tiol

  1. Sintetizar el mesilato de metoxi-poly(ethylene glycol) (Mn: 750) (MeO-PEG17-Ms, ).
    1. Disolver 10 g de MeO-PEG17-OH en 200 mL de tolueno de 100% dentro de un matraz de fondo redondo cuello 3 (RBF) bajo agitación magnética a 600 rpm.
    2. Conecte el RBF 3-cuello con un aparato de Dean-Stark, sí mismo unido a un condensador, mantener todo el sistema bajo gas inerte, nitrógeno o argón.
    3. Coloque el cuello 3 RBF en baño de aceite, calor a 165 ° C mientras que revuelve a 600 rpm.
    4. Quitar agua del rastro y 100 mL de tolueno usando destilación azeotrópica.
    5. Quitar el RBF 3-cuello del aceite, desconecte el aparato de Dean-Stark manteniendo condiciones de gas inerte y deje que se enfríe a temperatura ambiente.
    6. Agregar 5,6 mL de trietilamina 100% (3 EC. molar) y 300 mL de tolueno anhidro de 100% a MeO-PEG17-OH solución removiendo a 600 rpm.
    7. Mover el RBF 3-cuello a un baño de hielo, mantener la agitación en 600 rpm y condiciones de gas inerte.
    8. Diluir 3,1 mL de cloruro de metanosulfonilo 100% (3 EC. molar) en 30 mL de tolueno de 100%, añadir lentamente el RBF 3-cuello a través de un embudo de adición mientras que revuelve a 600 rpm.
    9. Revolver durante la noche a 600 rpm a temperatura ambiente bajo condiciones inertes.
    10. Solución de filtrado a través de un embudo de Buchner lleno con tierra de diatomeas (véase Tabla de materiales) para eliminar las sales.
    11. Eliminar tolueno mediante un rotavapor con el baño de agua a 40 º C, giro a 120 rpm y presión entre 50-100 milibar.
    12. Volver a disolver el producto en 200 mL de diclorometano (DCM) de 100% y filtrar con un embudo Buchner con tierra de diatomeas (véase Tabla de materiales).
    13. Quitar DCM mediante un rotavapor con el baño de agua a 40 º C, giro a 120 rpm y presión entre 450-600 milibares.
    14. Escasamente re-disolver producto en 100% DCM y precipitar lentamente producto añadiendo gota a gota (a través de una pipeta de Pasteur) a 500 mL de helado 100% dietil éter. Mantener la agitación 300 RPM.
    15. Decantar o aspirar para eliminar el éter dietílico de producto precipitado, MeO-PEG17- mesilato y tienda durante la noche en desecador de vacío se seque por completo.
    16. Inmediatamente el uso del producto o tienda bajo gas inerte a-20 ° C durante varios meses.
  2. Sintetizar thioacetate metoxi-poly(ethylene glycol) (MeO-PEG17-TA, II).
    1. Disolver 5 g de MeO-PEG17-Ms (I) en 200 mL de 100% anhidro dimetilformamida (DMF) en un RBF 3-cuello, revuelva a 600 rpm a temperatura ambiente bajo gas inerte.
    2. Agregar 2,5 g de carbonato de potasio 100% (3 EC. molar) para agitación de la solución.
      Nota: carbonato de potasio no totalmente disolverá en la solución.
    3. Diluir 1,3 mL de ácido thioacetic de 100% (3 EC. molar) en 100 mL de 100% DMF anhidra y añadir gota a gota a la solución mediante un embudo de adición.
      Nota: El ácido Thioacetic tiene un olor fuerte y desagradable. Debe tener cuidado de mantener todos los objetos sucios dentro de la campana química durante la noche antes de la eliminación o limpieza.
    4. Revuelva vigorosamente (rpm 600 o más) durante la noche a temperatura ambiente.
      Nota: Formación de sal puede alterar fácilmente la agitación de la solución. Debe tenerse cuidado para mantener la agitación durante la noche.
    5. Solución de filtrado a través de un embudo de Buchner lleno con tierra de diatomeas (véase Tabla de materiales).
    6. Quitar DMF a través de un rotavapor con el baño de agua a 60 ° C, rotación a 120 rpm y presión entre 5-15 milibar.
    7. Disolver el producto en 100 mL de tetrahidrofurano (THF) de 100% y añadir a una columna de alúmina neutra para eliminar impurezas coloreadas de rojo/naranja.
    8. Quitar THF mediante un rotavapor con el baño de agua a 40 º C, giro a 120 rpm y presión entre 200 y 300 milibares.
    9. Escasamente re-disolver producto en DCM de 100%. Si forma un precipitado de la sal, solución de filtrado a través de 6 μm poro tamaño filtro de papel con un embudo de Buchner.
    10. Lentamente precipitado producto añadiendo gota a gota mediante pipeta Pasteur al 500 mL de helado 100% éter dietílico, revolviendo a 300 rpm. Éter dietílico puede necesitar más deben enfriarse a-20 ° C en un congelador a prueba de explosiones durante varias horas si no desplome precipitado fuera de solución a 4 ° C.
    11. Decantar o aspirar para eliminar el éter dietílico de producto precipitado, MeO-PEG17-Thioacetate. Almacenar el producto durante la noche en un desecador de vacío y posteriormente bajo gas inerte a-20 ° C.
  3. Sintetizar diblock copolímero poly(ethylene glycol) -bloque -poly(propylene sulfide)-tiol (PEG17-bl- PPS35-SH, III).
    1. MeO-PEG17-TA (II) se disuelven en 10 mL de 100% DMF anhidra dentro de un matraz Schlenk bajo argón, agitación a 400 rpm en un baño de agua temperatura ambiente.
    2. Añadir 1,1 eq molar del methoxide del sodio (solución al de 0,5 M en metanol), permite remover a 400 rpm por 5 minutos.
    3. Añadir 35 eq molar de sulfuro de propileno 100%, rápidamente, a la solución. Permiten remover a 400 rpm por 10 minutos.
    4. Añadir eq 10 molar de ácido acético glacial al 100%, permiten remover a 400 rpm por 5 minutos.
    5. Quitar DMF a través de un rotavapor con el baño de agua a 60 ° C, rotación a 120 rpm y presión entre 5-15 milibar.
    6. Volver a disolver el producto con moderación en DCM 100%, precipitan en 80 mL de metanol al 100%, dividido entre dos tubos de centrífuga cónico de 50 mL.
    7. Tubos cónicos de centrífuga a 7500 x g durante 5 minutos a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante lejos.
    8. Almacene el producto, PEG17-bl- PPS35-SH, durante la noche en un desecador de vacío y posteriormente bajo gas inerte a-20 ° C.

2. Monte PEG -bl -PPS Nanocarriers via Hand-Powered Flash Nanoprecipitation

  1. (Opcional) Esterilizar el mezclador de jets (CIJ) de choque confinado.
    1. Dentro de un gabinete de seguridad biológica (BSC), sumerja el mezclador con todas las piezas desmontadas dentro de 0,1 M NaOH durante la noche.
    2. Vuelva a montar el mezclador de la CIJ y fluir a través de agua libre de endotoxinas mediante jeringas luer-lock.
    3. El pH del agua de prueba y continúa fluyendo agua a través de hasta registros de pH como neutral.
  2. Disolver PEG17-bl- PPS35-SH polímeros y cargas hidrofóbico en THF (solución 1 de choque).
    1. Pesan 20 mg de PEG17-bl- PPS35-SH en un tubo de 1,5 mL.
    2. Añadir tintes hidrofóbicos (por ejemplo,DiI, ICG), medicamentos (por ejemplo,la rapamicina) y otra carga.
      Nota: La carga puede ser seco o disuelto en un solvente miscible con agua, preferiblemente de THF. Si el cargo es insoluble en THF o DMF, otro solvente miscible con agua puede usarse, pero con moderación, ya que el polímero es poco probable que sea soluble. La cantidad de carga que se puede cargar depende de las propiedades de la carga sí mismo (por ejemplo, el peso molecular, la hidrofobicidad, consideraciones estérico) y debe ser explorado en una base caso-por-caso11,12.
    3. Añadir 500 μl del 100% THF al polímero y carga, vortex vigorosamente para disolver.
  3. Disuelve hidrofílica carga en buffer acuoso (solución 2 de choque). Para ello, disolver carga hidrofílico para ser cargado dentro de las vesículas de polímero en 500 μl de un buffer acuoso (por ejemplo, tampón fosfato salina agua, pura, etc.) según sea necesario.
  4. Agregar buffer a depósito.
    1. Añadir 2,5 mL de un tampón acuoso de elección (por ejemplo, 1 x de tampón fosfato salino) a un depósito convenientemente tamaño (por ejemplo, un vial de centelleo de vidrio de 20 mL). Coloque el depósito bajo mezclador CIJ tal que la salida del mezclador entra directamente en el depósito.
  5. Cargar soluciones de choque plástico jeringas desechables 1 mL separadas.
  6. Afectar las soluciones cara a cara al mismo tiempo formar nanoestructuras y cargar con la carga útil.
    1. Inserte las jeringas adaptadores Luer-lock en la parte superior de la mezcladora de la CIJ.
    2. En un movimiento único, suave y rápido, Presione ambas jeringas simultáneamente y con igual fuerza.
      Nota: En caso de vulneración secuenciales múltiples, recoger primero la salida en un depósito vacío.
    3. (Opcional) Realizar múltiples vulneración. Solución de nanoestructura naciente dividida entre dos jeringas y repita los pasos 2.6.1-2.6.2 hasta 4 veces más.
    4. Recoge la salida en el depósito lleno de tampón acuoso preparado en 2.4.1 y revuelva suavemente para asegurar una mezcla.
  7. Retire carga descargada y solvente orgánico.
    1. (Opción 1) Dializan nanocarrier formulación en el mismo buffer acuoso utilizado para el choque y en el embalse, utilizando tubería de un adecuado corte de MW durante al menos 24 horas con al menos 2 cambios de tampón. Esto puede realizarse a temperatura ambiente.
      Nota: Nanocarriers se mantendrá por la tubería con un atajo de MW < 100.000 kDa y potencialmente puede conservarse por más atajos así. Esta opción mantiene esterilidad cuando se realiza en un BSC utilizando tampón estéril.
    2. (Opción 2) Filtro de formulación a través de una exclusión de tamaño o columna de intercambio de la desalación en solución tampón (por ejemplo, sefarosa 6B columna) usando 1 x PBS buffer acuoso.
      Nota: Esta opción mantiene esterilidad cuando se realiza en un BSC con una columna que ha sido bien esterilizado.
    3. (Opción 3) Quite el solvente orgánico volátil mediante desecación vacío durante la noche.
    4. (Opción 4) Filtro de formulación utilizando un sistema de filtración de flujo tangencial usando un filtro de 50-100 kDa con un caudal de 20-60 mL/min durante 15 minutos a 1 hora, dependiendo del peso molecular de la carga unencapsulated ser purificada a (la más grande carga tardará más).
  8. (Opcional) Concentrar la formulación nanocarrier.
    1. (Opción 1) Concentrado usando un sistema concentrador de vuelta (por ejemplo, giro columna con MW corte > 100.000), utilizados según lo descrito por el fabricante.
      Nota: Nanocarriers puede necesitar ser suspendidas entre giros y puede requerir un número de tiradas para concentrarse hasta el volumen deseado. Concentración de spin puede reducir la esterilidad de nanocarrier formulaciones.
    2. (Opción 2) Reducir el volumen mediante desecación vacío.
      Nota: Cambio de volumen es difícil de controlar bajo estas condiciones, y debe tenerse cuidado para mantener la osmolaridad antes y después de la concentración.
  9. Almacenar nanocarriers a 4 ° C durante semanas a meses. Antes de usarlo después de almacenaje, brevemente las formulaciones nanocarrier vortex.

3. caracterizar las formulaciones Nanocarrier

  1. Medir la eficiencia de carga
    1. Si la carga es fluorescente o absorbe fuertemente a una determinada longitud de onda fuera de 260-450 nm, medir fluorescencia/absorbancia con un espectrofotómetro de Fluorímetro.
      Nota: PEG -bl- PPS absorbe fuertemente de 260-310 nm y formulaciones polymersome absorben de 310-450 nm, que puede complicar la cuantificación de la carga que absorbe a una longitud de onda similar.
    2. Si carga absorbe dentro de la gama de 260-450 nm y es hidrofílica, interrumpir PEG -bl- PPS nanoestructuras añadiendo 25 μL de la formulación a un volumen igual de 1% H2O2 o 1% Tritón X-100 y posteriormente separar y distinguir carga de absorción del polímero mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) utilizando una columna de exclusión de tamaño compatible con acuosa tampones (por ejemplo, una columna de sefarosa 6B) 11.
    3. Si carga absorbe dentro de la gama de 260-450 nm y es soluble en THF o DMF, liofilizar la formulación por congelación 100 μL en un tubo de plástico de 1,5 mL a-80 ° C durante la noche. Luego coloque el tubo en un recipiente vacío de vidrio y colóquelo en un liofilizador. Deje transcurrir 24 horas para la liofilización se producen y posteriormente volver a disolver en 50 μL de DMF o THF antes de la separación y detección por HPLC.
  2. Medida nanocarrier tamaño y morfología
    1. Utilice dispersión ligera dinámica (DLS)11 o nanopartículas análisis13 de seguimiento para medir tamaño nanocarrier.
      Nota: Nanocarriers formado de PEG17-bl- PPS35-SH se espera que tenga un diámetro promedio entre 100 y 200 nm, con una polidispersidad índice < 0.3.
    2. Determinar morfología nanocarrier utilizando transmisión criogénico microscopia electrónica (cryoTEM)14.
      Nota: Nanocarriers formado de PEG17-bl- PPS35-SH se espera que sean las vesículas del polímero (polymersomes) con una membrana polimérica claramente discernible y forma principalmente esférica.
  3. (Opcional) Formulaciones de la prueba de endotoxinas
    1. (Opción 1) Utilizar un análisis basado en la célula por la presencia de endotoxinas, por ejemplo, las células azul crudo o las células de HEK azul TLR4 (véase Tabla de materiales), según lo descrito por el fabricante, en un análisis cuantitativo o cualitativo de lipopolisacáridos (LPS)13 .
    2. (Opción 2) Utilice un kit de ensayo de15 de amebocitos de Limulus Lysate (LAL), descrito por el fabricante.

4. fabricación de una bomba de jeringa de alta velocidad para la FNP

  1. Fabricar componentes de instrumento personalizado.
    Nota: materiales complementarios disponen de modelos 3D para trabajar a máquina todas las piezas de encargo.
    1. Chasis del instrumento varias capas de ¾" las hojas de acrílico de la máquina y montar (ver Archivos complementarios 1-5).
      Nota: Acrílico tiene mala resistencia química. Si el instrumento debe ser utilizado con solventes agresivos, la base de un metal que se considere conveniente para el uso de la máquina.
    2. Impresión 3D de las partes con impresión con plástico polylactide (PLA).
      1. El aparato de 2 partes de expulsión (SE) jeringa de impresión: SE parte 1 - bloque FNP posterior con carro (figura 5F, parte gris; Archivo complementario 6) y SE parte 2 - Guía de expulsión frontal (figura 5F, parte negra; Archivo suplementario 7). Ver 2 archivo complementario para esquemas.
      2. Imprimir las llaves de sensor de infrarrojos (figura 5I, cajas negras; Archivos complementarios 8 y 9).
      3. (Opcional) Imprimir el soporte de émbolo de la jeringa dual.
  2. Fijar las capas de instrumentos chasis con pernos hexagonales M5 y añadir pies de goma a la base.
  3. Configurar una computadora single-board con Raspbian GNU/Linux 8.0 (Jessie) sistema operativo (basado en Linux Debian).
    Nota: Software para el funcionamiento del instrumento está disponible a petición. Instrumento software código fuente disponible bajo petición. Al recibir el archivo comprimido, descargar todas las dependencias especificadas en el archivo README. Este software incluye una interfaz gráfica sencilla que permite control sobre la operación del equipo, incluyendo los parámetros básicos de funcionamiento (velocidad del motor, dirección, etc.). Animamos a los usuarios ampliar el código fuente existente y módulos personalizados de programa a medida para usan en sus propios experimentos. Todo el software fue escrito usando Python 2.7.12 y no es actualmente compatible con Python 3. RPi, PicoBorgRev, kivy y módulos de multiprocesamiento se utilizan. El archivo Léame contiene información detallada acerca de la licencia de distribución de software.
  4. Instale un 24 V cepillado motor de corriente continua (figura 5A) y la diapositiva de precisión (4.5"(114,3 mm) carrera; tornillo 1,27 mm plomo) (figura 5).
    Nota: El motor de 24 V DC utilizado aquí tiene un RPMmáximo, lomáximoy par de plena carga de 4.252 RPM, 4.83 A y ~0.2 N * m, respectivamente.
    1. (Opcional) Coloque el relleno por debajo del motor para amortiguar la vibración durante el funcionamiento.
      Nota: Se recomienda que se corte una almohadilla gruesa de 2-3 mm para adaptarse a las dimensiones del carro motor de la base del instrumento.
    2. Monte la corredera de precisión para la base del instrumento.
      1. Retire temporalmente la varilla roscada.
      2. Diapositiva de montaje usando dos tornillos de máquina plana #8-32.
    3. Agujerea el motor de la C.C. de Monte a la diapositiva de precisión usando tornillo viga acoplamiento (1-1/4" de longitud) que contiene 6/16" y 1/4" de diámetro.
      Nota: Dependiendo del grosor del acrílico utilizado para las capas base de instrumento de la máquina, puede usar cu_as para nivelar los ejes del motor y de la precisión de la diapositiva.
  5. Montar la plataforma de expulsión de las placas de metal y abrazaderas de las esquinas en forma de L (figura 5). Metal base de plataforma a plataforma deslizante (conectado a la varilla roscada) de montaje usando los tornillos #6-32. Ver esquema de diapositivas de precisión proporcionada por el fabricante para obtener detalles sobre las restricciones de montaje.
  6. Montar la jeringa expulsión configuración del sistema.
    1. Coloque bloques de almohadilla de movimiento lineal (plataformas de montaje + rodamiento de movimiento lineal) sobre M8 cromado rieles de acero inoxidable (los carriles de acero paralelos pueden ser fácilmente observados en la figura 5).
    2. Carriles a través de carriles de guía y soporte y bloqueo eje lineal del hilo de rosca. Utilizar a tres guías por el carril. Piezas de montaje SE 1 y 2 sobre los bloques de almohadilla con tornillos de máquina M4.
    3. Libremente unir SE partes 1 y 2 con tornillos hexagonales M8. Configurar el espacio entre SE parte 1 y 2 con helicoidales compresión resortes que cubre cada perno que se fijan entre dos hacia adentro casquillos de nylon revestimiento (ver figura 5F). Monte los casquillos en el exterior de la SE parte 1 y parte SE 2.
  7. Circuito de alambre (ver figura 6 para el esquema de base)
    1. Conectar el controlador motor a I2C/SDA, 3,3 V, y GND de los pernos la sola computadora de tablero.
    2. Conecte los terminales motor DC al M - y M + bloques de la tarjeta controladora del motor. Conectar 24 V, 2.5 suministro eléctrico (figura 5B) a los bloques de V + y GND del motor controlador (el controlador está encerrado en una caja electrónica simple en el diseño final, ver figura 5 H).
    3. Conectar las patillas 3V3 y 5V de la placa de control del motor con los pernos respectivos de la sola computadora de tablero. Conectar pines SDA y SCL del controlador motor a los pines 3 y 5 de la sola computadora de tablero, respectivamente.
      Nota: Comandos se emiten para el motor de la C.C. de la sola computadora de tablero a través de un controlador de motor. Velocidad del motor se controla mediante la regulación de la tensión en los bornes del motor mediante la modulación de anchura de pulso. En esta configuración, la máxima corriente pasando por el motor de 24 V DC (amperaje a carga plena: 4.83 A) se limita a 2,5 A por la fuente de alimentación de 24 V. Se recomienda que el circuito del motor está conectado a través de una normalmente cerrado (NC) parada de emergencia (figura 5J). Esto proporciona un medio para interrumpir el circuito del motor para permitir una operación de desconexión de emergencia básica.
    4. Conectar delantero y trasero proximidad infrarrojo sensores (sensores de distancia digital, figura 5I) a los pines GPIO RPi 24 y 23, respectivamente.
      1. Cableado del sensor de la ruta a través de conductos en la base del instrumento.
        Nota: Los sensores IR son sensores de movimiento sin contacto break-beam con un rango de detección de 2 a 10 cm.
      2. 4.7.4.2 ajustar los sensores IR por cable en las abrazaderas para sensor infrarrojo 3D impreso (figura 5I, cajas negras) y montar en la base del instrumento. Cuando se establece correctamente en el soporte, la cara del sensor debe sobresalir hacia el exterior de 14 mm x 7 mm abertura de la abrazadera rectangular.
        Nota: estas llaves de sensor pueden temporalmente montarse utilizando un adhesivo o Velcro (montaje temporal es útil para ajustar y optimizar la colocación de sensor de IR adecuadamente). Por otra parte, permanentemente Monte guía pequeños agujeros en la base del instrumento y asegurar las abrazaderas con tornillos de M2.
    5. Conectar una pantalla táctil LCD de 7" a 5V, GND y mostrar pines de interfaz en serie (DSI) de la sola computadora de tablero. El 7" RPi y montaje de la exhibición del LCD se muestra en la figura 5.

5. fabricar Polymersomes mediante FNP usando la bomba de jeringa de alta velocidad a medida

  1. (Opción 1) Utilice el modo de funcionamiento del automóvil.
    1. Seleccione Auto Run en el menú principal. El sistema solicitará a los usuarios que permita que el motor automáticamente Coloque la plataforma de expulsión de la jeringa al principio de la diapositiva de precisión. Asegúrese de que el camino por delante y por detrás de la placa metálica es claro antes de proceder.
    2. Cargar las jeringas de plástico 1 mL como se describe en la sección 2.5 y jeringas de montaje sobre los conectores Luer hembra del mezclador de la CIJ. Cargar mezclador CIJ (con jeringas adjuntadas) en la abertura rectangular del carro posterior de expulsión (ver figura 5E).
    3. Seleccione la velocidad deseada del motor (unidades: rpm) usando el control deslizante en el GUI (ver nota a continuación para consideraciones importantes). La velocidad óptima del motor dependerá de la bomba específica y setup pero debe asegurar un caudal de al menos 1 mL/s para las dimensiones de canal de mezclador CIJ que aquí.
      Nota: Considere lo siguiente mientras que la tasa de flujo de valor. En la configuración vertical de FNP para manuales, reactivos son expulsados de las jeringas a una velocidad de ~ 1 mL/s, pero puede ser muy variable cuando guiadas a mano. Esto es simplemente la velocidad de flujo a través del barril de la jeringa, que es controlada por la tasa a la que el usuario avanza el émbolo de la jeringa. Tenga en cuenta que la velocidad de 1 mL/s es no referirse a la tasa de flujo de salida de la boquilla de diámetro más pequeño. En el anterior especifica dimensiones del canal, ~ 1 mL/s debe mantenerse para asegurar el número de Reynold de una apropiada mezcla turbulenta10. Las tasas de flujo diferentes pueden utilizarse siempre y cuando el diámetro del canal se ajusta en consecuencia para mantener el número de Reynold que soporta condiciones turbulentas. Los émbolos son avanzados por una placa metálica perpendicular, que se mueve a lo largo de una lámina de aluminio de alta precisión junto a 24 V DC motor cepillado. En esta configuración, el cañón máximo caudal está influenciado por varios factores, incluyendo (1) la velocidad máxima del motor (rpm 4.252) y el plomo del tornillo de la precisión diapositiva (1,27 mm) que está acoplada al motor del eje (2) el esfuerzo de torsión del motor (~0.2 N * m de l completo OAD de torsión), que es necesario vencer la resistencia para fluir (3) contribuciones de la presión de entrada del fluido en y salir de la mezcladora de la CIJ y (4) la fuerza de las jeringas que utilizan (los usuarios deben ser consciente de las fuerzas que actúan sobre las jeringas y usar jeringas de fuerza apropiada). En cuanto al punto (2), al aumentar el flujo de par suficiente tasa es necesaria para evitar el atascamiento del motor manteniendo constante expulsión bajo una creciente presión. Tasa de caudal cañón – para ilustrar el flujo de barril que dicho sistema puede alcanzar, considere el caso donde la FNP se realiza utilizando el reactivo cargado en dos jeringas de un mililitro. Para lograr un flujo mL/s 1 tarifa a través del cañón, el motor debe avanzar la placa metálica la distancia definida por la longitud del émbolo (~ 68 mm para una jeringa típica 1 mL) en un segundo. Siempre y cuando el plomo 1,27 mm del tornillo de la corredera de precisión, se deduce que un motor de C.C. en 4.252 rpm es capaz de avanzar hasta la plataforma ~ 90 mm/s (rev/s 71 * 1.27 mm/rev). Esto corresponde a un caudal de barril de ~1.3 mL/s, superior a 1 mL/s velocidad de la blanco.
    4. Antes de ejecutar el instrumento, compruebe el sistema para asegurarse de que el camino de la plataforma esté libre de obstrucciones, y que los detectores de proximidad de infrarrojos delanteros y traseros son libres de obstrucciones (los sensores IR son las pequeñas cajas negras cerca de la corredera de precisión terminales; Ver figura 5I). También asegúrese de que la salida de la tubería capilar de la mezcladora de la CIJ se encamina en un recipiente apropiado (ex: de vidrio vaso de precipitados, etc.).
    5. Para expulsar los reactivos de las jeringuillas y en el mezclador CIJ, presione el botón Ejecutar en la interfaz del software.
  2. (Opción 2) Usar el modo manual run. Consulte las instrucciones del Modo de funcionamiento anteriores y nota el cambio siguiente para paso 5.1.5: Presione el botón de avance presiona continuamente a través de la realización de la carrera (es decir, la plataforma avanza en respuesta a un evento en la prensa y el motor detendremos en respuesta a un evento de lanzamiento).
  3. (Opción 3) Manual plataforma posicionamiento modo; este modo permite a los usuarios colocar la plataforma ejecutando el motor a baja velocidad (20% de potencia) en respuesta a los botones adelante y atrás en la interfaz del software.

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Resultados

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Aquí, hemos presentado un protocolo simple para la formulación de nanocarriers capaz de cargar carga hidrofílico e hidrofóbico que son seguros para el en vivo de ratón y primates no humanos administración11,13. También hemos incluido un protocolo detallado para la síntesis del polímero utilizado en nuestros resultados representativos, junto con una descripción para la fabricación de un instrumento personalizado para el ch...

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Discusión

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Hemos incluido instrucciones detalladas para la fabricación rápida de polymersomes usando PEG17-bl- PPS35-SH como el copolímero del diblock. Polymersomes vesiculares son la morfología total primaria montada en esta relación de PEG hidrofílica e hidrofóbico PPS bloque molecular peso. Cuando afectado varias veces, tienen un diámetro y polidispersidad que polymersomes sacada a través de una membrana nm 200 después de ser formado por hidratación de película delgada. Este protocolo elim...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

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Reconocemos instrumentación y personal de apoyan de la instalación de biología estructural en la Universidad de Northwestern. Se reconoce el apoyo de la derecha Lurie integral cáncer centro de la Universidad Northwestern y la instalaciones de la Universidad noroeste de biología estructural. El detector de electrones directo de Gatan K2 fue comprado con fondos proporcionados por el consorcio biomédico de Chicago con el apoyo de los fondos de Searle en el Chicago Community Trust. También agradecemos a las siguientes instalaciones en Universidad del noroeste: el centro de ciencia de superficie interdisciplinario Keck, la instalación de biología estructural, la instalación de la proyección de imagen biológica, centro de imagen Molecular avanzada y el análisis Bionanomedicina equipo núcleo. Esta investigación fue apoyada por la beca de la Fundación Nacional de Ciencias 1453576, Director de los institutos de salud nacional Premio innovador nuevo 1DP2HL132390-01, centro para la concesión de catalizador de nanomedicina regenerativa y el 2014 McCormick catalizador premio. SDA fue apoyado en parte por NIH predoctoral biotecnología formación Grant T32GM008449.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit - Edición de 32 GBCanaKitUPC 682710991511
Plataforma de Rodamiento Lineal (Pequeña) - 8 mm de diámetroAdafruit1179
Movimiento lineal Eje de 8 mm, 330 mm de longitud, cromado, cementado, métricoVXBkit11868
Guía/soporte de eje de riel lineal - 8 mm de diámetroAdafruit1182
Corredera de precisión de posición manual Carrera de 4.5", capacidad de carga de 15 lbMcMaster-Carr5236A16
MTPM-P10-1JK43 Motor de CC IronHorse Iron HorseMTPM-P10-1JK43
Pantalla LCD con pantalla táctil oficial de 7" de Raspberry PiRaspberry PiB0153R2A9I (ASIN)
PicoBorg Reverse - Control de motor avanzado para Raspberry PiPiBorgBURN-0011
Portador Pololu con sensor de distancia digital de GP2Y0D810Z0F agudo de 10 cmPololu1134
Ruland PSR16-5-4-A Acoplamiento de viga de tornillo de fijación, aluminio pulido, pulgada, diámetro de 5/16" A, diámetro de diámetro B de 1/4", diámetro exterior de 1/4", longitud de 1-1/4", par nominal de 44 lb-inRulandPSR16-5-4-A
Éter monometílico de polietilenglicolSigma Aldrich202495
Cloruro de metanosulfoniloSigma Aldrich471259
ToluenoSigma Aldrich179418
Tolueno, anhidroSigma Aldrich244511
TrietilaminaSigma AldrichT0886
Celite 545 (Tierra de diatomeas)Sigma Aldrich419931
DiclorometanoSigma Aldrich
Éter dietílicoSigma Aldrich296082
N,N-dimetilformamida, anhidroSigma Aldrich227056
Carbonato de potasioSigma Aldrich791776
Ácido tioacéticoSigma AldrichT30805
TetrahidrofuranoSigma Aldrich360589
Aluminio óxido, neutro, activado, Brockmann ISigma Aldrich199974
Solución de metóxido de sodio, 0,5 M en metanolSigma Aldrich403067
Sulfuro de propilenoSigma AldrichP53209
Ácido acéticoSigma AldrichA6283
MetanolSigma Aldrich320390
Solución de hidróxido de sodio 1,0 NSigma AldrichS2770
Agua libre de endotoxinasGE Healthcare Life SciencesSH30529.01
Tiras de papelpH Fisher Scientific13-640-508
Libre de endotoxinas Dulbecco's PBSSigma AldrichTMS-012
centelleo de vidrio de borosilicatoFisher Scientific03-337-4
1 mL jeringa totalmente de plásticoThermo ScientificS75101
Sepharose CL-6BSigma AldrichCL6B200
Columna de cromatografía líquidaSigmaAldrich C4169
Mezclador CIJ, HDPECustom
Triton X-100Sigma AldrichX100
Solución de peróxido de hidrógenoSigma Aldrich216763
HEK-Blue hTLR4InvivoGenhkb-htlr4
RAW-Blue CellsInvivoGenraw-sp
QUANTI-BlueInvivoGenrep-qb1
PYROGENT Gel Clot LAL AssaysLonzaN183-125
Foundation 320269Viales de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stano, A., Scott, E. A., Dane, K. Y., Swartz, M. A., Hubbell, J. A. Tunable T cell immunity towards a protein antigen using polymersomes vs. solid-core nanoparticles. Biomaterials. 34 (17), 4339-4346 (2013).
  2. Discher, B. M., et al. Polymersomes: tough vesicles made from diblock copolymers. Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).
  3. Vasdekis, A. E., Scott, E. A., O'Neil, C. P., Psaltis, D., Hubbell, J. A. Precision intracellular delivery based on optofluidic polymersome rupture. ACS Nano. 6 (9), 7850-7857 (2012).
  4. Yi, S., et al. Tailoring Nanostructure Morphology for Enhanced Targeting of Dendritic Cells in Atherosclerosis. ACS Nano. 10 (12), 11290-11303 (2016).
  5. Shum, H. C., Kim, J. W., Weitz, D. A. Microfluidic fabrication of monodisperse biocompatible and biodegradable polymersomes with controlled permeability. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9543-9549 (2008).
  6. Pessi, J., et al. Microfluidics-assisted engineering of polymeric microcapsules with high encapsulation efficiency for protein drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 472 (1-2), 82-87 (2014).
  7. O'Neil, C. P., Suzuki, T., Demurtas, D., Finka, A., Hubbell, J. A. A novel method for the encapsulation of biomolecules into polymersomes via direct hydration. Langmuir. 25 (16), 9025-9029 (2009).
  8. Saad, W. S., Prud'homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
  9. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles. Physical Review Letters. 91 (11), 118302(2003).
  10. Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
  11. Allen, S., Osorio, O., Liu, Y. G., Scott, E. Facile assembly and loading of theranostic polymersomes via multi-impingement flash nanoprecipitation. Journal of Controlled Release. 262, 91-103 (2017).
  12. Bobbala, S., Allen, S. D., Scott, E. A. Flash nanoprecipitation permits versatile assembly and loading of polymeric bicontinuous cubic nanospheres. Nanoscale. 10 (11), 5078-5088 (2018).
  13. Allen, S. D., et al. Polymersomes scalably fabricated via flash nanoprecipitation are non-toxic in non-human primates and associate with leukocytes in the spleen and kidney following intravenous administration. Nano Research. , (2018).
  14. Karabin, N. B., et al. Sustained micellar delivery via inducible transitions in nanostructure morphology. Nature Communications. 9 (1), 624(2018).
  15. Mascoli, C. C., Weary, M. E. Limulus amebocyte lysate (LAL) test for detecting pyrogens in parenteral injectable products and medical devices: advantages to manufacturers and regulatory officials. Journal of the Parenteral Drug Association. 33 (2), 81-95 (1979).
  16. Pustulka, K. M., et al. Flash nanoprecipitation: particle structure and stability. Molecular Pharmaceutics. 10 (11), 4367-4377 (2013).
  17. Tang, C., Amin, D., Messersmith, P. B., Anthony, J. E., Prud'homme, R. K. Polymer directed self-assembly of pH-responsive antioxidant nanoparticles. Langmuir. 31 (12), 3612-3620 (2015).
  18. Gindy, M. E., Panagiotopoulos, A. Z., Prud'homme, R. K. Composite block copolymer stabilized nanoparticles: simultaneous encapsulation of organic actives and inorganic nanostructures. Langmuir. 24 (1), 83-90 (2008).

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