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Artículo de método

Purificación y reconstitución de TRPV1 para análisis espectroscópico

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DOI:

10.3791/57796

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3 de julio de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, 3CuriRX, Inc.

En este artículo

Resumen

Este artículo describe métodos específicos para obtener cantidades bioquímicas de detergente solubilizado TRPV1 para análisis espectroscópico. Los protocolos combinados proporcionan herramientas bioquímicas y biofísicas que se pueden adaptar para facilitar los estudios estructurales y funcionales de canales del ion mamíferos en un ambiente controlado por membrana.

Resumen

Canales del ion del polimodal transducen múltiples estímulos de diversa índole en cambios alostéricos; Estas conformaciones dinámicas son desafiantes para determinar y siguen siendo en gran parte desconocidos. Con los avances recientes en vertiendo luz de solo-partícula cryo-Electrón microscopia (cryo-EM) en las características estructurales de los sitios de unión del agonista y el mecanismo de activación de varios canales del ion, el escenario está preparado para un análisis profundo de la dinámico de su gating mecanismos mediante métodos espectroscópicos. Técnicas espectroscópicas como resonancia paramagnética electrónica (EPR) y la resonancia doble electrón-electrón (ciervos) se han limitado principalmente al estudio de los canales iónicos procariotas que pueden ser purificados en grandes cantidades. La necesidad de grandes cantidades de proteínas de membrana funcional y estable ha dificultado el estudio de los canales del ion mamíferos utilizando estos enfoques. EPR y los ciervos ofrecen muchas ventajas, incluyendo la determinación de la estructura y los cambios dinámicos de las regiones de la proteína móvil, aunque a baja resolución, que podría ser difícil de obtener por cristalografía de rayos x o cryo-EM, y monitoreo que bloquean reversible transición (es decir, cerrado, abierto, sensibilizados y desensibilizar). Aquí, le ofrecemos protocolos para obtener miligramos de receptor transitorio detergente solubilizado funcional potencial catión subfamilia V miembro del canal 1 (TRPV1) que pueden ser etiquetados para espectroscopia EPR y ciervos.

Introducción

Con los recientes avances en microscopia del cryo-electrón de solo-partícula (cryo-EM), estructuras de canal del ion mamíferos han sido obtenidas a un ritmo extraordinario. Particularmente, los estudios estructurales de los canales iónicos de Polimodal, como los vaniloides potencial transitorio del receptor 1 (TRPV1), han proporcionado mayor comprensión de su activación mecanismos1,2,3, 4 , 5. sin embargo, información dinámica sobre canales del ion encajado en un ambiente de membrana se requiere para entender sus mecanismos Polimodal bloquea y atascamiento de la droga.

Resonancia paramagnética electrónica (EPR) y espectroscopías de resonancia (ciervos) doble electrón-electrón han proporcionado algunos de los modelos mecanicistas más definitivos para ion canales6,7,8,9 , 10 , 11 , 12 , 13. estos enfoques se han limitado principalmente a la examinación de procariotas y ion archeal canales que producen una gran cantidad de proteínas purificadas de detergente cuando overexpressed en bacterias. Con el desarrollo de la producción de proteínas de membrana eucariota en insectos y células de mamíferos para la caracterización funcional y estructural14,15,16, ahora es posible obtener bioquímico cantidades de proteínas purificadas de detergente para estudios espectroscópicos.

Las señales de EPR y ciervos surgen de una etiqueta de paramagneticspin (SL) (es decir, methanethiosulfonate) unida a un residuo de cisteína solo en la proteína. Las etiquetas de vuelta informan tres tipos de información estructural: movimiento, accesibilidad y distancias. Esta información permite determinar si los residuos se entierran dentro de la proteína o se exponen a la membrana o ambiente acuoso en la apo y Estados de la ligand-limite13,17,18,19. En el contexto de una estructura de alta resolución (cuando esté disponible), el EPR y los ciervos los datos proporcionan una colección de restricciones para derivar modelos dinámicos en su medio natural manteniéndose en transición bloquea reversible (es decir, cerrado, abierto, sensibilizados y desensibilizar). Por otra parte, las regiones flexibles que podrían ser difíciles de determinar por cristalografía de rayos x o cryo-EM podían obtenerse mediante el uso de estos conjuntos de datos ambientales para asignar estructuras secundarias, así como la ubicación dentro de la proteína20. Estructuras de Cryo-EM obtenidas en nanodiscs de lípidos proporcionan información valiosa sobre la compuerta del ion de canales3,21,22,23,24, 25; sin embargo, métodos espectroscópicos podrían proporcionar información dinámica de Estados conformacionales (p. ej., cambios térmicos) que podría ser difícil de determinar utilizando cryo-EM.

Hay que superar muchas dificultades para implementar EPR y los ciervos, como la falta de función de la proteína al quitar todos los residuos de cisteína (especialmente abundantes en mamíferos canales), rendimiento de proteína baja, inestabilidad de la proteína durante la purificación y después centrifugado etiquetado y la agregación de la proteína en detergente o liposomas. Aquí, hemos diseñado protocolos para superar estas barreras críticas y han obtenido información de ciervos y EPR espectros para un receptor sensorial mamífero. El objetivo aquí es describir metodologías para construyen la expresión, la purificación, el etiquetado y la reconstitución de una rata menos cisteína mínimo funcional TRPV1 (eTRPV1) para análisis espectroscópico. Esta metodología es apropiada para las proteínas de la membrana que mantienen su función a pesar de la eliminación de residuos de cisteína o que contienen cisteína formando enlaces disulfuro. Esta colección de protocolos podría adaptarse para el análisis espectroscópico de los otros canales iónicos mamíferos.

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Protocolo

1. TRPV1 mutagénesis

Nota: Una mínima construcción de TRPV1 para análisis espectroscópico26 fue construida desde el largometraje cisteína-menos canal TRPV127 usando el método de reacción en cadena (PCR) polimerasa (figura 1). Esta construcción mínima de TRPV1 cisteína-menos (denominada eTRPV1 en adelante) consiste en residuos 110-603-627-764. eTRPV1 fue clonado en pMO (un vector basado en pcDNA3.1) para el análisis funcional y en un donante recombinante vectores28 que contiene 8 x histidina maltosa proteína-(MBP)-tabaco etch virus (TEV) para la expresión y purificación (figura 2A). eTRPV1 cisteína solo–se generaron mutantes mediante mutagénesis sitio-dirigida. Secuencias del vector y el canal se especifican en el archivo complementario 1: métodos suplementarios.

  1. Diseño de cartillas de mutagénesis con herramientas en línea29.
  2. Mezclar en un tubo 0.2 mL: 5 μL de 10 x buffer de reacción, 1 μL de dNTP mix (100 mM), 1 μL de 10 oligonucleótidos de avance y retroceso de μM, 1 μL de la plantilla de eTRPV1 de 100 ng/μL de ADN26, 1,5 μL de DMSO, 1 μL de enzima de mutagénesis y 38.5 μL de agua desionizada. Girar la mezcla antes de colocar los tubos en el termociclador.
  3. Realizar mutagénesis PCR.
    1. Realizar una desnaturalización a 95 ° C por 2 min, b desnaturalización a 95 ° C por 20 s, (c) recocido a 60 ° C durante 10 s y (d) alargamiento a 68 ° C durante 4 min (30 s por 1 kb). Repita los pasos b a d de 18 ciclos, luego realizar elongación a 68 ° C por 5 min y mantener la reacción a 4 ° C hasta su uso posterior.
  4. Añadir 2 μL de DpnI enzima a la reacción; mezclar y luego incubar a 37 ° C durante 30 minutos.
  5. Realizar la transformación
    1. Descongelar las células competentes de e. coli en hielo.
    2. A un tubo estéril previamente enfriado de 14mL, añadir 75 μL de células competentes y 10 μL de la mezcla PCR-traté de Dpn. Mezclar suavemente.
    3. Incubar la reacción en hielo por 30 minutos, mantenga el tubo a 42 ° C por 45 s y luego inmediatamente en hielo durante 2 minutos la placa la mezcla en el caldo de Luria (LB)-placa de agar que contiene carbenicilina (0,2 mg/mL). Incube la placa durante la noche a 37 ° C.
    4. Cosecha por lo menos tres colonias individuales de la placa y sembrar cada una en 4 mL de LB con carbenicilina (0,2 mg/mL) mediante un tubo estéril de 14 mL. Incubar los cultivos durante la noche a 37 ° C y agitar a 250 rpm.
    5. Desactivación de las culturas durante la noche a 8.000 x g por 10 min y extraer ADN siguiendo las instrucciones de los kits de preparación mini disponible en el mercado.
    6. Verificar la presencia de cisteína solo mutantes por la secuencia de ADN automatizada estándar (véase Tabla de materiales).

2. funcional análisis de eTRPV1 y solo-cisteína mutantes

  1. Transfección de línea celular HEK293 30
    1. Cultura las células HEK293 6 - placas de pozos en 2 mL de medio de glucosa alta (DMEM) por pozo (37 ° C, 5% CO2, 95% humedad). Preparar células HEK293 70 \u2012 80% confluente.
    2. Preparar la mezcla de transfección en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL separados.
      1. Para la reacción A, Añadir 0,5 μg eTRPV1 o cisteína que contiene mutante de pMO a 250 μl de medio mínimo esencial (por ejemplo, Opti-MEM). Para la reacción B, agregar 3 μl de reactivo de transfección a 250 μl de medio mínimo esencial. Incubar cada reacción por 5 min a temperatura ambiente (RT).
      2. Mezcle las reacciones A y B con una pipeta de 1 mL. Incubar la mezcla por 45 min a TA.
    3. Retire 500 μl de medio de cultivo de la confluencia del 70-80% bien y agregar 500 μl de la mezcla de reacción. Almacenar las placas durante la noche para el Ca2 + proyección de imagen (37 ° C, 5% CO2y 95% de humedad).
  2. CA2 + proyección de imagen en células HEK293 30
    1. Limpiar cubreobjetos de vidrio de 12 mm de diámetro con etanol y agua y colocarlos en una placa de 24 pozos.
    2. Añadir 75 μl de la polivinílico-l-lisina en el centro de cada cubreobjetos y guardar la placa durante 45 min (37 ° C, 5% CO2, 95% de humedad).
    3. Quite el cubreobjetos exceso de poli-l-lisina y lavar tres veces con tampón fosfato salino (PBS) para eliminar cualquier resto.
    4. Una vez que el cubreobjetos estén listos, proceder a separar las células de la placa de la pozo 6.
    5. Retire los medios de comunicación y agregar 500 μl de PBS caliente (37 ° C) para el lavado.
    6. Quitar PBS, agregar 500 μl de tripsina e Incube por 1 minuto.
    7. Agregar 500 μl de medios de cultivo caliente (37 ° C) para detener la reacción de digestión y mezclar con la pipeta; evitar la formación de burbujas. Si es necesario, ajustar la concentración de células diluir esta resuspensión con más medios de cultivo.
    8. Semilla de 250 μl de células HEK293 transfected (70% confluente) más 250 μl de medio de cultivo (500 μl volumen final por pozo) en el cubreobjetos previamente tratado y dejarlos reposar (accesorio) para 1-2 h en la incubadora (37 ° C, 5% CO2, 95% de humedad).
    9. Mientras tanto, preparar una solución de carga mediante la adición de ácido de pluronic de 0.02% y 1 μm Fluo-4-AM al búfer de un timbre. Mezcle bien la solución.
    10. Retire los medios de cultivo HEK293 del pozo y agregar 500 μl de la solución de carga. Incube las células para 1 h (37 ° C, 5% CO2, 95% de humedad). Lavar las células Fluo-4 cargó dos veces con tampón de cálido timbre.
    11. Coloque un cubreobjetos con las células de carga en un plato de Petri de 10 mm en una platina del microscopio (usando un 10 X objetivo; 494 de nm de excitación y emisión de nm 506) para realizar mediciones de Ca2 + intracelulares.
    12. Medir los cambios en la intensidad de la fluorescencia después perfundiendo respectivos ligandos (por ejemplo, la capsaicina μM 10) utilizando el software disponible en el mercado (véase Tabla de materiales).
  3. mRNA y preparación de ovocitos de Xenopus laevis 30
    1. Alinear eTRPV1 y solo-cisteína que contiene mutantes pMO con Pmepara 1 h a 37 ° C. Limpiar siguiendo las instrucciones de los kits disponibles en el mercado de la purificación de ADN.
    2. El uso lineal y limpia ADN para sintetizar ARN capsulado con un kit disponible en el mercado compatible con T7 ARN polimerasa.
    3. Limpie con RNAs según kits disponibles en el mercado de la purificación. Cuantificar la cantidad de RNA midiendo la absorbancia a longitud de onda de 260 nm.
    4. Transferencia 5 \u2012 10 mL de X. laevis ovocitos (disponibles comercialmente) en un tubo cónico de 50 mL que contenga 20 mL de solución ND96 (96 mM NaCl, KCl, 5 mM HEPES, de 2 mM 1 mM MgCl2, pH 7,4) con colagenasa 1 mg/mL y nutate por 50 min a TA.
    5. Enjuague los ovocitos en ND96 hasta que la solución es clara; Añadir colagenasa fresco y agitar durante 30 min a TA. examinar los óvulos bajo un microscopio estéreo y detener la digestión cuando la capa folicular externa (capa brillante con vasos rojos de la sangre) está ausente en los oocitos de la mayoría (90%). Enjuague los ovocitos en ND96 hasta que la solución es clara.
    6. Transferencia de ovocitos a un tubo de poliestireno de 50 mL con ND96 plus 1 mM CaCl2 y agitar durante ovocitos bajo digerido de 1 h. se adhieren al tubo de poliestireno.
    7. Lavado de ovocitos con ND96 plus 1 mM CaCl2 y suplemento de solución con 50 μg/mL de gentamicina y 50 μg/mL de la tetraciclina.
      Nota: Proteger las soluciones que contienen tetraciclina de exposición a la luz.
    8. Seleccionar ovocitos grandes sin las membranas dañadas y mostrando una clara separación entre los polos de vegetales y animal. Que ovocitos recuperar durante 4 horas antes de la microinyección en 16 ° C.
    9. Utilizar pipetas de vidrio (D.E.: 1,11 mm, ID: 0,5 y la longitud 8.8 centímetros) para inyectar 1-5 ng de mRNA de mutantes eTRPV1 y solo-cisteína ovocitos utilizando un sistema nanoliter-inyector (46 nL/s) y un microscopio estéreo (2 aumentos). Almacenar ovocitos a 16 ° C en ND96 complementado con CaCl2 y antibióticos (gentamicina/tetraciclina 1 x).
    10. Después de 72 h, medir corriente macroscópica utilizando un sistema de adquisición de dos electrodos de pinza de voltaje (TEVC)31.
    11. Tire de pipetas de vidrio de borosilicato (0,3 MΩ) y llenarlos con 3 M KCl.
    12. Coloque el ovocito en la sala de grabación con una pipeta de transferencia y perfusión de la solución de baño (120 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM solución de MgCl2, 1 mM EGTA y 10 mM HEPES, pH 7,4) a baja velocidad.
    13. Sumergir dos electrodos en la solución del baño para ajustar sus desplazamientos de la pipeta. Empuje suavemente los electrodos de la pipeta (pipetas de vidrio de borosilicato; Diámetro exterior: 1,5 mm, ID: 1.10 y longitud 10 cm) en el oocito hasta una muesca pequeña se observa bajo un microscopio estéreo (2 aumentos), así como un cambio en el potencial de membrana.
    14. Cambie la configuración de amplificador a modo y medida las corrientes macroscópicas de grabación mientras se aplica una rampa de voltaje-abrazadera de -80 a + 80 mV para carga s. 1 el sistema de perfusión con la solución utilizada en paso 2.3.12 en pH 7,4 (como control) y en pH 5 para comprobar la actividad eTRPV1.

3. generación de la Bacmid recombinante y Baculovirus para la expresión de la proteína

  1. Bacmid
    1. Transformar 100 μL de células competentes de e. coli de DH10Bac con 7.5 ng del vector recombinante donante que contiene eTRPV1 o solo-cisteína mutantes.
    2. Agregar 900 μL de medio SOC (triptona, 5 mg/mL de 20 mg/mL levadura extracto, 2,5 mM KCl, 10 mM de MgCl2, 10 mM MgSO4y 20 mM de glucosa) e incubar de 6-7 h a 37 ° C y 225 rpm.
    3. 100 μl de la mezcla y de diluciones seriadas de la semilla (1/10 y 1/100), en placas de LB-agar con 100 μg/mL X-gal, 40 μg/mL IPTG, 7 μg/mL gentamicina, tetraciclina μg/mL 10 y kanamicina 50 μg/mL. Incubar las placas durante al menos 48 h a 37 ° C.
    4. Seleccione colonias blancas que son de 2 mm de diámetro, azul colonias carecen del inserto de interés. Utilice un microscopio estéreo para verificar que colonias blancas no contienen ninguna manchas azules.
    5. Cosechar por lo menos tres colonias individuales y transferirlos a un tubo estéril de 14 mL con 4 mL de medio LB suplementado con gentamicina μg/mL 7, 10 de μg/mL tetraciclina y kanamicina 50 de μg/mL. Incube las células durante la noche (~ 16 h) a 37 ° C y 250 rpm.
    6. Tomar 1,5 mL de los cultivos durante la noche y aislante bacmid recombinante ADN (consulte el archivo complementario 1 para protocolo detallado). Almacenar bacmid a 4 ° C hasta por dos meses.
      Nota: Preparar las existencias de glicerol de DH10Bac e. coli que contiene el ADN de bacmid. 300 μL de la cultura y añadir 200 μL de glicerol al 50% (concentración final de glicerol del 20%). Almacenar la alícuota a-80 ° C hasta su uso posterior.
    7. Verificar la presencia de eTRPV1 en la bacmid recombinante mediante PCR (consulte 1 archivo complementario para protocolo detallado).
  2. Baculovirus
    Nota: Para este procedimiento, transfectar células Sf9 de los insectos en un formato 6-bien. Todas las cantidades y volúmenes se dan sobre una base por-bien. Evite el uso de antibióticos.
    1. Placa de 1 x 106 Sf9 células en 2 mL de medio de células de insecto. Permite adjuntar por lo menos 45 min de las células.
    2. Diluir 1 μg de bacmid recombinante ADN en 100 μL de medios de comunicación de células de insecto. Mezclar suavemente.
    3. Diluir 100 μL de media celda insectos 6 μL de reactivo de transfección (TR). Mezclar suavemente.
    4. Combinar las soluciones de ADN y TR (de pasos 3.2.2 y 3.2.3, respectivamente). Mezclar suavemente e incubar 30 min a TA.
    5. Agregar 0,8 mL de medio de células de insecto a la mezcla de ADN/TR; mezclar suavemente.
    6. Quitar los medios de comunicación de insectos de la célula de las células Sf9 y lavar una vez con 1 mL de medio fresco.
    7. Retire el medio de lavado y agregue la mezcla de ADN/TR (3.2.2 \u2012 3.2.5) a las células. Incube las células a 27 ° C durante 5 h (sin agitación).
    8. Retire la mezcla de transfección y reemplazar con 2 mL de medio de insectos de la célula que contiene 0,5% de suero bovino fetal (FBS). Incube las células a 27 ° C durante cinco días.
      PRECAUCIÓN: Evitar la evaporación de los medios de comunicación celular llenando los pozos vacíos de los medios de comunicación y que cubre la placa de la pozo de 6 con dos capas de película de parafina.
    9. Transferencia de los medios de cultivo de células en un tubo de centrífuga de 15 mL. Aislar el primer paso (P1) de la acción viral haciendo girar el tubo a 8.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga de 15 mL limpia y almacenarse inmediatamente a 4 ° C.
      Nota: Proteja el virus de exposición a la luz que cubre el tubo con papel de aluminio.
    10. Para la segunda generación (P2) de la acción viral, poner una cultura 25 mL suspensión de medios de comunicación de células de insecto a 1 x 106 Sf9 células/mL que contiene 2% FBS en un matraz de 125 mL (fondo llano y ventilación). Añadir 25 μL del virus P1 a la cultura de 25 mL.
    11. Incubar el cultivo a 27 º C durante 72 h.
    12. Para cosechar la acción viral de P2, la cultura de la transferencia a un nuevo tubo de 50 mL y centrifugar a 8.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
    13. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 mL y almacenarse inmediatamente a 4 ° C.
      Nota: Proteja el virus de exposición a la luz que cubre el tubo con papel de aluminio. Realizar un experimento en pequeña escala para valorar la relación de virus/Sf9 P2 para la óptima expresión de TRPV1 (consulte 1 archivo complementario para un protocolo detallado, sección 4 titulado "Experimento en pequeña escala para virus P2.")
    14. Para la expresión de proteínas a gran escala, establecer un cultivo de suspensión celular de 1-L Sf9 2 x 106 células/ml en medios celulares insectos suplementados con 0.5% FBS en un matraz de vidrio de borosilicato de 2,8 L.
    15. Añadir 1 mL de caldo de virus P2 en la cultura L 1 e incubar a 27 ° C durante 72 h.
      Nota: En el tercer día, densidad celular debe ser en aproximadamente 1.5 a 2.5 x 106 células/mL.

4. eTRPV1 y solo-cisteína mutante purificación

  1. Las membranas aislamiento28
    1. Cosecha de la cultura de suspensión de células de insectos 1-L por spinning x 4.500 g, 4 º C, durante 20 min pesa el precipitado de células (se espera que alrededor de 6-9 g).
    2. Resuspender el precipitado de células en 25 mL de tampón de helada A (sacarosa 36,5 mM, 2 mM tris(2-carboxyethyl) fosfina (TCEP) y 50 mM Tris; pH 7,4) en presencia de inhibidores de la proteasa (1 mM phenylmethyl sulfonil fluoruro (PMSF), 3 μg/mL leupeptin, 3 μg/mL aprotinina y 1 pepstatin μg/mL). Desagregación de los grupos de células para obtener una suspensión homogénea y gire a 4 ° C por 20 min.
    3. Romper las células mediante un manual (dounce amoladora de tejido) o un homogeneizador de alta presión. Eliminar los restos celulares por centrifugación a 8.000 x g por 20 min a 4 ° C.
      Nota: Mantenga las células sometidas a lisis y tubos en hielo durante todo el proceso.
    4. Recoger sobrenadante y centrifugar a 100.000 x g durante 30 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de la membrana en un volumen total de 20 mL de helado Buffer B (150 mM NaCl, 10% glicerol, 2 mM TCEP, 50 mM HEPES, pH 7,4), suplementado con los inhibidores de la proteasa (como en el paso 4.1.2).
    5. Alícuota 20 mL de la suspensión de la membrana en tubos de 50 mL y flash-congelación en nitrógeno líquido. Almacenar las muestras a-80 ° C hasta su uso posterior.
  2. Proteína purificación26,28
    1. Descongelar las alícuotas de membrana en el hielo y añadir 3 mL de n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) por el tubo (acción de 200 mM). Gire el tubo durante 2 h a 4 ° C.
    2. Centrifugar la muestra a 100.000 x g durante 30 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante y agregar 1 mL de resina de amilosa mojado limpio. Gire la mezcla por 2 h a 4 ° C. La mezcla de proteína/amilosa en columnas de cromatografía de flujo de gravedad de la carga.
      PRECAUCIÓN: No permita que la resina se seque durante el lavado.
    3. Lavar la resina unida a las proteínas amilosa con 10 veces las cama volúmenes de helada C Buffer (150 mM NaCl, 10% glicerol, 50 mM HEPES, DDM, 0,1 μg/mL asolectin, TCEP de 0,5 mM de 0.5 mM, pH 7,4). Lavar con 10 volúmenes de cama de helado D Buffer (150 mM NaCl, 10% glicerol, 50 mM HEPES, 0.5 mM DDM, 0,1 μg/mL asolectin, pH 7,4).
      Nota: Antes de lavar, degas Buffer D sin detergentes o los lípidos, purga con nitrógeno. Después de la desgasificación, añadir DDM y asolectin.
    4. Eluir la proteína eTRPV1 con fracciones de 0,5 mL, hasta 5 mL, de helada desgasificado Buffer D, complementado con maltosa 20 mM. Si es posible, realizar el lavado y elución a 4 ° C.
    5. Cuantificar la cantidad de proteína mediante la medición de la absorbancia a longitud de onda de 280 nm.
      Nota: Este protocolo da 0.5 a 1.0 mg de proteína por litro de cultivo. Rendimiento de proteína puede variar para cada mutante de solo-cisteína eTRPV1. Para los experimentos de EPR y ciervos, crecer 4 \u2012 6 L de la cultura.

5. eTRPV1 solo-cisteína Mutant Site-Directed Spin etiquetado

  1. Concentrar las fracciones que contienen la eTRPV1 utilizando una unidad de filtro centrífugo (corte = 100 kDa) \u2012 2 hasta 2.5 mg/mL para el etiquetado (ciclos de 7.000 x g durante 2 min a 4 ° C).
  2. Agregar un exceso molar 10 veces (3 veces, cada 30 minutos) de la etiqueta de vuelta (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrrolidin-3-yl) metil methanethiosulfonate (MTSSL) de una solución stock de 100 mM en DMSO a la proteína concentrada (monómero de eTRPV1: MTSSL en 1:10 cociente molar) 17. mantener la reacción en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 h 30 minutos, seguido por la incubación durante la noche a 4 ° C.
    Nota: En este paso, MBP podría eliminarse mediante la adición de proteasa TEV durante la incubación de etiquetado de vuelta durante la noche.
  3. ETRPV1 vuelta-etiqueta de carga en una columna de cromatografía de exclusión de tamaño equilibrado en búfer (150 mM NaCl, 20 mM HEPES, DDM de 0,5 mM, pH 7,4), controlado por un sistema de proteína rápida (FPLC) de la cromatografía líquida. Recoger fracciones que contiene eTRPV1 tetrámero.
    Nota: No incluyen 10% de glicerol en este paso, ya que reduce la eficacia de la reconstitución.
  4. Cuantificar la cantidad de proteína mediante la medición de la absorbancia a longitud de onda de 280 nm.
  5. Evaluar la pureza de la muestra mediante la ejecución de un gel de SDS-PAGE (gel libre de manchas, 4 \u2012 20%). La muestra está lista para las mediciones espectroscópicas en solución o en proteoliposomes.

6. eTRPV1 marca Spin solo mutante de cisteína reconstitución

  1. Seco 10 mg de asolectin utilizando un evaporador rotatorio bajo vacío (≤ 100 mbar) por 1 h a 40 ° C. Asolectin liposomas, añadir 1 mL de tampón (200 mM NaCl, fregonas de 5 mM, pH 7,4) y someter a ultrasonidos la mezcla por 15 minutos o hasta que la muestra es homogénea.
  2. Desestabilizar los liposomas añadiendo DDM a una concentración final de 2 mM e incubar 30 min a TA.
  3. La proteína marcada se concentran en 2 mg/mL y añadir a los liposomas con una proporción proteína/lípidos de 1:5 (masa: masa).
    PRECAUCIÓN: Es importante mantener las concentraciones de proteínas mencionadas, puesto que vuelta de etiquetado de eficiencia disminuye a bajas concentraciones y en alta que puede precipitar la proteína.
  4. Añadir el tampón de F para ajustar la mezcla de proteína/liposomas a la concentración micelar crítica de DDM (CMC) e incubar durante la noche a 4 ° C con agitación suave.
  5. Doble del volumen de la mezcla de proteína/liposomas con F de tampón y detergente eliminar añadiendo secuencialmente tres alícuotas de granos del adsorbente poliestireno no polares (30 mg, 50 mg y 80 mg) en intervalos de 1 h con agitación suave a TA.
  6. Coloque la mezcla en un filtro de columna (columna de cromatografía de flujo de gravedad) para quitar los granos y transferir la mezcla proteoliposomes a un tubo de ultracentrífuga. Centrifugar las muestras a 100.000 x g durante 1 h a 4 ° C. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en 30 μL de tampón f el.
    Nota: Las muestras están listas para análisis espectroscópico e inyección en oocytes del Xenopus . Si las muestras no pueden usarse el mismo día, flash-freeze les en nitrógeno líquido y conservar a-80 ° C.
  7. Proteoliposomes -Xenopus ovocitos electrofisiología del26,32
    1. Inyectar 50 nL de diferentes diluciones de proteoliposomes vuelta-etiqueta en oocytes del Xenopus como se describe en la sección 2.2.
    2. Realizar mediciones de TEVC después de 12 h de la inyección como se describe en la sección 2.3.10.
  8. Proceder a realizar las mediciones espectroscópicas y análisis (sección 7).

7. ciervo y espectroscopías EPR

  1. Doble electrón-Electrón Espectroscopia de la resonancia (el ciervo).
    1. Realizar mediciones de ciervos en un espectrómetro EPR pulsado operando a frecuencia de la banda Q (34 GHz) y equipado con un amplificador de 10 W con la secuencia de cuatro pulsos libre de tiempo muerto en 83° utilizando el software proporcionado por el fabricante33.
    2. Suplemento de 50 μm de mutantes de cisteína spin-labeled purificada de detergente eTRPV1 en tampón (paso 5.5) con 30% (v/v) de glicerol para la cryo-protección.
    3. Cargar la muestra en un tubo capilar de cuarzo sellado y vuelta a la parte inferior del tubo de centrifugación a baja velocidad breve (100 x g).
    4. Coloque el tubo capilar en nitrógeno líquido para congelar la muestra. Las muestras pueden almacenarse en este punto a-80 ° C para la medición posterior.
    5. Colocar la muestra directamente en el resonador de microondas y deje que se vuelva a equilibrar en-83° de \u2012 10 20 min.
    6. Medir la muestra usando un protocolo estándar de venado de cuatro pulsos, mw1 (π/2) – τ1 – mw1 (π) – τ1 – (π) mw2 – τ2 – (π) mw1, τ2 – eco34. Las longitudes de pulso para mw1 (π/2) y (π) mw1 son ns 10 y 20, respectivamente y 40 ns para mw2 (π). Establecer la separación en frecuencia a 63 MHz.
      Nota: Datos de caries primaria ciervos pueden ser analizados con un hogar construido software (por ejemplo, en Matlab) que supone una suma de distribuciones Gaussianas para describir las distancias entre spin etiquetas19,35.
  2. Espectroscopia EPR (CW) onda continua
    1. Realizar experimentos de CW EPR en RT en un espectrómetro de banda X (9,6 GHz) mediante el software del fabricante.
    2. Activar el instrumento girando el enfriador de agua, la consola y la fuente de alimentación del imán. Conectarse el instrumento con el software, coloque el instrumento en sintonía y esperar al menos 30 min para el instrumento se caliente.
    3. 20 μl de la muestra de la carga del paso 5.5 en un tubo capilar de vidrio 25 μl mediante acción capilar y sellar el extremo del tubo con sellador.
    4. El tubo capilar la carga en la cavidad del microondas y crítico par el resonador ya sea manualmente o automáticamente mediante la función de sintonización automática del software.
    5. Recoger los primeros espectros derivados bajo condiciones normalizadas: modulación de microondas de 100 kHz, modulación del campo magnético de 1.6 G y potencia de microondas de 10 mW.
    6. Análisis de datos y presentación, corregir los espectros contra el fondo y normalizar dividiendo los espectros por el valor de pico a pico de la integral doble.
    7. Determinar la movilidad de vuelta-etiqueta mediante la medición de la inversa de la anchura de la línea central del primer derivado espectros de absorción (ΔHo-1)36.

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Resultados

Caracterización funcional de mínimo menos cisteína TRPV1 construir (eTRPV1) los mutantes solo-cisteína

El primer paso para estudios espectroscópicos es Ingeniero y caracterizar construcciones cisteína-menos proteína (figura 2A) que son funcionales y rendimiento bioquímicos cantidades de proteínas. eTRPV1 es funcional determinado por la proyección de imagen de Ca2 + y TEVC (

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Discusión

Las tecnologías actuales para la expresión y purificación de proteínas de membrana mamíferos han hecho posible obtener una cantidad suficiente de proteína para estudios espectroscópicos14,15,16,42. Aquí, hemos adaptado estas tecnologías para expresar, purificar, reconstituir y realizar análisis espectroscópico en el TRPV1.

Entre los pasos críticos en el protocolo, a ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Estamos muy agradecidos al Dr. H. Mchaourab para dar acceso a los espectrómetros de EPR y los ciervos y el Dr. T. Rosenbaum para proporcionar el plásmido de TRPV1 cisteína-menos completo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Kit de mutagénesis dirigido al sitio QuikChange LightningAgilent Technologies210519-5
2-Propanol (Isopropanol)Fisher ScientificA416
Albúmina Suero bovino (BSA)GoldBio.comA-420-10
Resina de amilosaNEBE8021L
AprotininaGoldBio.comA-655-25
Asolectina de sojaSigma11145
Bac-to-Bac Sistema de expresión de baculovirusInvitrogen Life Technologies10359016
Biobeads SM-2 Adsorbentes Bio-Rad152-3920
Pipetas de vidrio de borosilicato (3.5'') (inyección de ovocitos)Drummond Scientific3-000-203 G/X
Pipetas de vidrio de borosilicato (grabaciones de ovocitos)Sutter InstrumentB150-110-10HP
CaCl2 2H2OFisher ScientificC79
Carbenicillina (disodio)GoldBio.comC-103-5
Reactivo de celfectinaInvitrogen Life Technologies10362-010
cellSensOlympus
ChloroformFisher ScientificC606SK
Colagenasa Tipo 1Worthington-BiochemLS004196
CritisealVWR18000-299
D-(+)-GlucosaSigma G8270
D-(+)-Maltosa MonohidratoFisher ScientificBP684
DDM (n-Docecil-B-D-Maltopyranoside)AnatraceD310S Medio
de alto contenido glucémico (Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio)SigmaD0572 
Columnas desalinizadoras desechables PD-10 GEHealthcare45-000-148
EGTAFisher ScientificO2783
Suero fetal bovinoInvitrogen Life Technologies10082-147
Fluo-4 AMLife TechnologiesF-14201
GenCatch Plus Mini-Prep Kit de preparación de ADN plasmídicoEpoch Life Science, Inc2160250
Kit de limpieza de PCR GenCatchEpoch Life Science, Inc2360050
Sulfato de gentamicinaLonza17-518Z
Capilar de vidrio (25 µ l)VWR53432-761
Matraz de vidrio 2800 mLPyrex USA4423-2XL
GlicerolFisher BioReactivosBP229
HEK293S GnTl-ATCCCRL-3022
HEPESSigma H4034
IPTG (isopropil-tio-B-galactósido)GoldBio.comI2481C25
Sulfato de kanamicinaFisher ScientificBP906-5
KClFisher ChemicalP217
LB Broth, MillerFisher bioReactivosBP1426
Hemisulfato de leupeptinaGoldBio.comL-010-5
Lipofectamina 2000Invitrogen Life Technologies11668-019
MgCl2 6H2OFisher ScientificBP214
MgSO4 7H2OFisher ScientificBP213
mMESSAGE mMACHINE T7 KitAmbionAM1344
MOPS Fisher bioReactivosBP2936
MTSL (1-oxil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidin-3-il) Metilo MetanetiosulfonatoToronto Research Chemicals, IncO873900
NaClFisher ChemicalS271
Opti-MEMLife Technologies31985-062
Pepstatina AGoldBio.comP-020-5
Ácido Plurónico F-127 (20%)PromoKine   CA707-59004
PMSFGoldBio.comP4170
Solución de poli-L-lisinaSigma-AldrichP4707
Rneasy Mini KitQiagen74104
Capilar selladoPedidoVitroCom
SF-900 II SFM (medio celular de insecto)Gibco, Life Technologies10902-088
Sf9 Células (adaptadas a SFM)Invitrogen Life Technologies11496-015
Extracto de lípidos polares de sojaAvanti Polar Lipids, Inc541602C
SacarosaFisher ScientificS25590
Superose 6 Increase 10/300 GLGE Healthcare29091596
TCEP HClGoldBio.comTCEP1
Fisher ScientificBP912-100
TrisBase Fisher BioReactivosBP152
TriptonaDifco0123-01
X-galGoldBio.comX4281C
Ovocitos de XenopusNasco LM00935M
XL1 - Células Competentes AzulesAgilent Technologies, Inc200249
Levadura ExtractoDifco0127-01-7
Econo-Pack columna de cromatografíaBio-Rad7321010
Mini-PROTEAN TGX Geles prefabricados sin manchasBio-Rad17000436
pFastBac1 Vector de expresiónInvitrogen Life Technologies10360-014
DH10Bac Células competentesInvitrogen Life Technologies10361-012
Sellador de tubos capilares CritisealLeica Microsystems02-676-20
ABI Modelo 3130XL Analizadores genéticosApplied Biosystems4359571
pipeta de transferenciaFishebrand13-711-9AM
Nanoject IIDrummond Scientific3-000-204
especial CLORHIDRATO de tetraciclina

Referencias

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