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Artículo de método

Una pantalla de 2 híbrido de levadura en lote para comparar las interacciones proteína

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DOI:

10.3791/57801

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6 de junio de 2018

 ,  , 
1Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa

En este artículo

Resumen

Procesamiento por lotes de pantallas 2-híbrido de levadura permite la comparación directa de los perfiles de la interacción de múltiples proteínas de cebo con un sistema altamente complejo presa de proteínas de fusión. Aquí, describimos métodos de refinado, nuevos reactivos y cómo implementar su uso para esas pantallas.

Resumen

Detección de interacciones proteína-proteína usando el análisis de 2 híbrido de levadura ha sido una herramienta eficaz, pero su uso en gran parte se ha limitado al descubrimiento de interactianos de alta afinidad que se enriquecen altamente en la biblioteca de los candidatos interactúan. En un formato tradicional, el ensayo de 2-híbrido de la levadura puede producir también muchas colonias a analizar cuando se llevó a cabo en baja estrigencia donde podrían hallarse los interactianos de baja afinidad. Por otra parte, sin un interrogatorio amplio y completo de la misma biblioteca contra cebos diferentes plásmidos, no se puede lograr un análisis comparativo. Aunque algunos de estos problemas pueden abordarse utilizando bibliotecas de vestida de presa, el costo y la infraestructura necesaria para el funcionamiento de estas pantallas pueden ser prohibitivos. Como alternativa, hemos adaptado el ensayo 2-híbrido de levadura para descubrir al mismo tiempo decenas de transitorios y las interacciones de proteínas estáticas dentro de una sola pantalla utilizando una estrategia denominada DEEPN (enriquecimiento dinámico para la evaluación de redes de proteínas), que incorpora la secuencia de la DNA de alto rendimiento y cálculo para seguir la evolución de una población de plásmidos que codifican a socios interactúan. Aquí, describimos modificado para requisitos particulares los reactivos y protocolos que permiten una pantalla DEEPN para ejecutar fácil y rentable.

Introducción

Una comprensión completa de los procesos biológicos de la célula se basa en la búsqueda de las redes de interacción de proteínas que subyacen sus mecanismos moleculares. Un enfoque para identificar las interacciones entre proteínas es la levadura 2-híbrido (Y2H), que trabaja montando un factor de transcripción quimérica de funcionamiento una vez que dos dominios de la proteína de interés unen unos a otros1. Una típica pantalla de Y2H se realiza mediante la creación de una población de levaduras que alberga tanto una biblioteca de plásmidos que codifican las proteínas interactúan con fusible para un activador transcripcional (ej., proteína de la fusión de presas) y un plásmido determinado 'cebo' compuesta por la proteína de interés fusionado a un dominio de unión a ADN (por ejemplo, el dominio de Gal4 DNA-que atan que se une a la secuencia de activación Gal4-upstream). Una de las principales ventajas del enfoque Y2H es que es relativamente fácil y barato para llevar a cabo en un laboratorio típico equipado para trabajo biológico molecular de rutina2. Sin embargo, cuando tradicionalmente se realiza, un usuario muestras de colonias individuales que surgen en la selección para una interacción positiva de Y2H. Seriamente, esto limita el número de clones 'presa' de biblioteca que puede ser examinado. Este problema se agrava cuando la abundancia de una presa particular de interacción es muy alta en relación con los demás, disminuyendo la posibilidad de detectar la interacción de plásmidos de presas de baja abundancia.

Una solución para usar el principio de Y2H en cobertura del proteoma es el uso de un enfoque con formato de matriz en una matriz que contiene plásmidos conocido presa individual puede ser interrogada digitalmente. Sin embargo, este enfoque requiere una infraestructura que no es fácilmente accesible o rentable a investigadores individuales que estén interesados en definir el interactoma de un pequeño número de proteínas o dominios3. Además, bibliotecas de presa muy complejo que pueden codificar múltiples fragmentos de proteínas interactuantes ampliaría el tamaño de tales matrices matriz tamaño práctico. Una alternativa es realizar ensayos con complejo bibliotecas en lotes y evaluar la presencia de clones interactúan mediante secuenciación masiva en paralelo alto rendimiento4. Esto puede aplicarse para analizar la presencia de plásmidos de presas que se presentan en varias colonias con un típico Y2H formato enfoque en cual levadura las células vivienda un par de interacción de proteínas de fusión pueden crecer en una placa de5,6. Esta idea general se puede acentuarse para aumentar la consulta de ambos múltiples cebo y presa de componentes en el mismo tiempo7,8.

Sin embargo, muchas investigaciones requieren que un más fácil todavía centra más esfuerzo en pocos proteína 'cebos' y pueden beneficiarse más de una consulta exhaustiva y semi-cuantitativa de una sola presa complejo biblioteca. Hemos desarrollado y validado un método para llevar a cabo estudios de interacción de proteínas de gran escala usando un principio Y2H en lote formato4. Esto utiliza la tasa de expansión de un plásmido determinado presa como un proxy para la fuerza relativa de Y2H interacción9. Profundo secuenciación de los plásmidos dentro de una población sometida a un crecimiento normal o las condiciones de crecimiento selectivo produce un mapa completo de clones que producen interacciones de Y2H fuertes y débiles. El repertorio de interactianos puede ser obtenido y comparado directamente a través de múltiples plásmidos de cebo. El flujo resultante denominado DEEPN (enriquecimiento dinámico para la evaluación de redes de proteínas) así puede utilizarse para identificar interactomes diferencial de las mismas bibliotecas de presa para identificar proteínas, permitiendo la comparación entre una proteína y otra.

Aquí, demostramos DEEPN e introducir mejoras en los métodos de laboratorio que facilitan su uso, que se detallan en la figura 1. Las mejoras significativas incluyen:

Generación de las poblaciones de levadura presas. Uno de los requisitos clave de DEEPN está generando poblaciones de levaduras con cebo diferentes plásmidos que tienen la misma distribución de las bibliotecas de la presa de plásmido. Poblaciones de referencia equivalente de la biblioteca de plásmido de presa son esenciales para hacer comparaciones exactas entre los interactomes de diferentes cebos. Esto se logra mejor cuando un plásmido de biblioteca ya se encuentra en una población de levadura haploide y mover un plásmido determinado cebo en que la población se consigue por el apareamiento para producir un diploide. Aquí, ofrecemos a una guía clara de cómo hacer estas poblaciones usando librerías comerciales ubicados en levadura haploide. Aunque hemos encontrado métodos que generan un alto número de diploides, la eficiencia global de apareamiento de estas cepas de levadura que contiene la biblioteca comercial fue baja. Por lo tanto, construimos una nueva cepa que puede albergar bibliotecas presa que cede más diploides por reacción de acoplamiento.

Nuevo sistema de plásmidos de cebo. Muchos plásmidos actuales que expresan proteínas de la fusión de la 'carnada' compuestas de la proteína de interés y un dominio DNA-que atan son 2µ, lo que les permite ampliar su número de copia. Este número de la copia puede ser muy variable en la población y conducir a la variabilidad en la respuesta transcripcional de Y2H. Esto a su vez podría sesgar la capacidad para medir la fuerza de una interacción de proteína determinada basada en la respuesta de crecimiento de células en la selección. Esto puede ser en parte dirección mediante el uso de un plásmido de copia baja, algunos de los cuales se han descrito previamente como el pDEST32 disponible en el mercado10. Construimos un nuevo plásmido de cebo (pTEF-GBD) que produce proteínas de fusión Gal4-Unión al ADN dominio dentro de un plásmido de copia baja basada en el centrómero de TRP1 portadores del gen de resistencia Kanr que también facilita la clonación de fragmentos de cebo tanto aguas arriba y aguas abajo del dominio de unión al ADN de Gal4.

Biblioteca de fragmento de nueva alta densidad Y2H. Había construido un nuevo plásmido a las bibliotecas de casa Y2H presa y usado para construir una biblioteca de Y2H altamente compleja hecha de esquilado al azar fragmentos de la DNA genomic de Saccharomyces cerevisiae. Análisis de la secuencia demostró que esta biblioteca tenía sobre 1 millón de diferentes elementos, mucho más complejos que descrita levadura genómica Y2H plásmido bibliotecas11. Con esta nueva biblioteca, hemos sido capaces de demostrar que el flujo de trabajo DEEPN es lo suficientemente robusto como para dar cabida a las bibliotecas del complejo con muchos plásmidos diferentes en una manera fiable y reproducible.

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Protocolo

1. preparación de medios de comunicación y placas

Nota: Todas las placas deben ser mínimamente 2 días antes de comenzar el protocolo. Los medios de comunicación se pueden hacer en cualquier momento. Sin embargo, la adenina de dextrosa de peptona de extracto de levadura protegido (bYPDA) debe hacerse el día que se utilizará. Algunos medios de comunicación se realiza mediante una combinación de suplemento que contiene un nivel de adenina que es más grande que lo que se suele utilizar. Más suplementos de medios mínimos especifican adenina 10 mg/L. Suplementos con la etiqueta '+ 40Ade' especificar un total de adenina 40 mg/L.

  1. Preparar la solución de glucosa (50% w/v). Para 1 L, disolver 500 g de D-(+)-glucosa en 800 mL de agua destilada en un vaso de precipitados de 1.000 mL. Ajustar el volumen a 1.000 mL de usando un cilindro graduado y un filtro a través de un filtro estéril de 0.2 μm en una botella de almacenamiento de medios estériles 1.000 mL.
  2. Preparar Extracto de levadura peptona dextrosa (YPD) platos. Para 1 L, disolver 20 g de peptona y 10 g de extracto de levadura en 800 mL de agua destilada en un vaso de precipitados de 1.000 mL. Verter en una probeta graduada, llenan hasta 960 mL de agua destilada. Vierte en un erlenmeyer de 2.000 mL y añadir 15 g de agar. Autoclave y enfriar en baño de agua de 37 ° C hasta que se enfríe la temperatura del baño de agua a aproximadamente 42-50 ° C. Utilice una pipeta para añadir 40 mL de glucosa 50%. Mezclar bien agitando.
    1. Vierte una serie de placas de 100 mm con 20 mL de medio con la pipeta.
  3. Preparar media mínima sintética completa (CSM)-placas de Trp. Para 1 L, 6,7 g de nitrógeno Base de levadura sin aminoácidos se disuelven en 800 mL de agua destilada en un vaso de precipitados de 1.000 mL. Verter en una probeta graduada, llenan hasta 960 mL de agua destilada. Vierta en un 2.000 mL del matraz Erlenmeyer y añadir 0,7 g de - Trp-se reunió con mezcla de abandono, 20 mg de metionina y 15 g de agar. Autoclave y enfriar en baño de agua de 37 ° C hasta que se enfríe la temperatura del baño de agua a aproximadamente 42-50 ° C. Utilice una pipeta para añadir 40 mL de glucosa 50%. Mezclar bien agitando.
    1. Vierte una serie de placas de 100 mm con 20 mL de medio con la pipeta.
  4. Preparar platos para CSM-Leu-Met. Para 1 L, 10,05 g de nitrógeno Base de levadura sin aminoácidos se disuelven en 800 mL de agua destilada en un vaso de precipitados de 1.000 mL. Vierte en un cilindro graduado y llenan a 940 mL de agua destilada. Vierta en un 2.000 mL del matraz Erlenmeyer y añadir 1,005 g de - Leu-se reunió con mezcla de abandono y 15 g de agar. Autoclave y enfriar en baño de agua de 37 ° C hasta que se enfríe la temperatura del baño de agua a aproximadamente 42-50 ° C. Utilice una pipeta para añadir 60 mL de glucosa 50%. Mezclar bien agitando.
    1. Vierte una serie de placas de 100 mm con 20 mL de medio con la pipeta.
  5. Preparar platos para CSM-Leu-Trp. Para 1 L, 10,05 g de nitrógeno Base de levadura sin aminoácidos se disuelven en 800 mL de agua destilada en un vaso de precipitados de 1.000 mL. Verter en una probeta graduada, llenan a 940 mL de agua destilada. Vierta en un 2.000 mL del matraz Erlenmeyer y añadir 1,005 g de - Trp-Leu + mezcla de abandono 40Ade, 240 mg de adenina y 15 g de agar. Autoclave y enfriar en baño de agua de 37 ° C hasta que se enfríe la temperatura del baño de agua a aproximadamente 42-50 ° C. Utilice una pipeta para añadir 60 mL de glucosa 50%. Mezclar bien agitando.
    1. Vierte una serie de placas de 100 mm con 20 mL de medio con la pipeta.
  6. Preparar platos para CSM-Leu-Trp-su. Para 1 L, 10,05 g de nitrógeno Base de levadura sin aminoácidos se disuelven en 800 mL de agua destilada en un vaso de precipitados de 1.000 mL. Verter en una probeta graduada, llenan a 940 mL de agua destilada. Vierta en un 2.000 mL del matraz Erlenmeyer y añadir 0,975 g de - Trp-Leu-su + mezcla de abandono 40Ade, 240 mg de adenina y 15 g de agar. Autoclave y enfriar en baño de agua de 37 ° C hasta que se enfríe la temperatura del baño de agua a aproximadamente 42-50 ° C. Utilice una pipeta para añadir 60 mL de glucosa 50%. Mezclar bien agitando.
    1. Vierte una serie de placas de 100 mm con 20 mL de medio con la pipeta.
  7. Preparar platos para CSM-Leu-Trp-su-3AT. Para 1 L, 10,05 g de nitrógeno Base de levadura sin aminoácidos se disuelven en 800 mL de agua destilada en un vaso de precipitados de 1.000 mL. Verter en una probeta graduada, llenan a 940 mL de agua destilada. Vierta en un 2.000 mL del matraz Erlenmeyer y añadir 0,975 g de - Trp-Leu-su + mezcla de abandono 40Ade, 240 mg de adenina y 15 g de agar. Autoclave y enfriar en baño de agua de 37 ° C hasta que se enfríe la temperatura del baño de agua a aproximadamente 42-50 ° C. Utilice una pipeta para añadir 60 mL de glucosa 50%. Agitando la mezcla en 100 μl de un caldo estéril de 1 M de 3-amino-1,2,4 triazol (3AT).
    1. Vierte una serie de placas de 100 mm con 20 mL de medio con la pipeta.
  8. Preparar platos para Kanr LB. Para 1 L, disolver 10 g de triptona, 5 g de levadura extracto y 10 g de NaCl en 800 mL de agua destilada en un vaso de precipitados de 1.000 mL. Verter en una probeta graduada, completar hasta 1.000 mL de agua destilada. Vierte en un 2.000 mL del matraz Erlenmeyer y añadir 15 g de agar. Autoclave y enfriar en baño de agua de 37 ° C hasta que se enfríe la temperatura del baño de agua a aproximadamente 42-50 ° C. Añadir 50 mg kanamicina y mezclar agitando.
    1. Vierte una serie de placas de 100 mm con 20 mL de medio con la pipeta.
  9. Preparar medios YPD, CSM-Leu-Met, CSM-Trp, CSM-Leu-Trp y CSM-Leu-Trp-su. Utilice el procedimiento arriba para las placas excepto en lugar de verter en un matraz de Erlenmeyer, vierta en una botella de almacenamiento de información de los medios de comunicación y omitir el agar.
  10. Preparar bYPDA (con YPDA). Medios YPD estériles y añadir adenina de 200 mg/L en agua destilada estéril. Ajustar el pH a 3,7 con HCl. filtro a través de un filtro estéril de 0.2 μm en un frasco estéril.
  11. Preparar el tampón de transformación: 2 M sorbitol, dihidrato de acetato de litio de 1 M, 10 mM Tris, pH 7,6, 0,5 mM de EDTA, cloruro de calcio 0.2 mM en agua destilada. Filtrar con un filtro de 0.2 μm estéril en una botella estéril.
  12. Preparar la solución de PEG: 70% p/v polietilenglicol 3350 en agua destilada. Esterilizar por autoclave.
  13. Preparar el molinete: 8 M urea, 4% p/v SDS, 50 mM Tris pH 6.8, 10% v/v de glicerol, 0.02% w/v bromofenol azul en estéril agua destilada.
  14. Preparar sTE (fuerte TE): 50 mM Tris, 20 mM EDTA, pH 8,0 en agua destilada. Filtrar con un filtro de 0.2 μm estéril en una botella estéril.
  15. Preparar la solución Zymolase: 10 mg/mL Zymolase 100T en 50 mM potasio Fosfato dibásico, pH 7.5, 50% v/v glicerol memoria estéril destilada agua (almacenado a-20 ° C).

2. clonación y verificación de plásmidos de cebo

Nota: Construcción del dominio de unión a DNA-Gal4 plásmidos. Actualmente, hay una variedad de sistemas de Y2H comercialmente disponibles y académica disponibles. DEEPN puede alojar muchos de éstos siempre que el plásmido de cebo expresando la proteína de interés unida a un dominio de unión al ADN en un TRP1-que contiene el plásmido. Otros requisitos posteriores que son la secuencia inmediatamente aguas arriba de la biblioteca presa insertar es conocido y que una interacción positiva de Y2H puede ser marcada por la producción de His3 para selección en medios que carecen de histidina. Aquí describiremos el uso de un nuevo plásmido de cebo Y2H (pTEF-DGB, figura 2), sin embargo, pueden utilizarse también otros plásmidos de cebo Y2H incluyendo pGBKT7. Para la construcción y evaluación de plásmidos de cebo, describimos el uso de pTEF-GBD. Como Nota general, recomendamos síntesis de genes para producir un marco de lectura abierto que se adhiere a la parcialidad de codón de levadura para ayudar a asegurar la buena expresión y la facilidad con la clonación. Asegúrese de que el esquema de clonación permite el cebo en el marco de la del dominio de unión al ADN de Gal4 y que cuando la clonación en el sitio 3', un codón de parada sigue la región de codificación de cebo.

  1. Preparar el vector plásmido. Plásmido pTEF-GBD permite la clonación de un fragmento de codificación de la proteína de interés 5' o 3' de la región de codificación del dominio Gal4 ADN usando un método de rapidez de montaje. Para insertar en el 5' sitio de digerir 3 μg de pTEF-GBD con NarI y EcoRI o para la inserción en el sitio 3', digestión con BamHI y XhoI para 2-4 h. Electrophorese muestra en agarosa de ADN 1% gel que contiene 0.2 - bromuro de etidio 0.5 μg/mL (EtBr) en 100 V. suprimir la corte 5.630 bp TEF-GBD y purificar mediante un kit de extracción de gel de DNA de acuerdo a las instrucciones del fabricante y cuantificar ADN por absorbancia a 260 nm en espectrofotómetro12.
    Nota: Generación de insertos de codificación de cebo. Fragmentos de ADN codificación de proteínas o fragmentos de la proteína de interés pueden ser hecho mediante síntesis de genes y disponible como fragmentos uncloned. Es aconsejable que codones están optimizados para su expresión en Saccharomyces cerevisiae y herramientas online para optimización de codón son incluidos en la lista de materiales.
  2. Para inserción de 5', flanquean el fragmento de ADN que codifican un codón de inicio ATG por 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 'y 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3', respectivamente. 3' inserción en marco con el dominio de unión a DNA de Gal4, flanquean el fragmento codificación por 5'-ctgcatatggccatggaggccgaa-3 'y 5'-tagtaactagcataaccccttggggcc-3'.
  3. Para la construcción del plásmido, utilice el método de rapidez de montaje según se especifica en las instrucciones del fabricante para la clonación de fragmentos en corte pTEF-GBD.
    1. Placa todo transformada de e. coli en placas de LB Kanr e incube por 16-20 h a 37 ° C. Colonias de vivienda pTEF-GBD con el relleno deseado pueden ser identificadas por amplificación por PCR con los oligonucleótidos: 5'-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3 ' y 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' para insertar 5' y 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3' y 5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3' por 3' insertar. Estos oligonucleótidos pueden servir también como iniciadores para la secuenciación del inserto.
    2. Plan en la preparación de > 10 μg de cada derivado de pTEF-GBD y pTEF-GBD para proporcionar material para las transformaciones de la secuencia y la levadura.
    3. Utilice las siguientes condiciones PCR: 3 minutos a 98 º C, seguido de 25 ciclos de 30 s a 98 ° C, 30 s a 55 ° C y 2 min a 72 ° C, seguido de 5 min a 72 ° C utilizando un tampón que contiene 2,5 mM MgCl2 , U/100 de 0.5 μl ADN polimerasa y búfer de propiedad.

3. expresión de proteínas de fusión dominio Gal4-DNA-obligatorio

  1. Hacer levadura competente.
    1. Racha PJ69-4A levadura sobre una placa de YPD tomando un aplicador de madera estéril, raspar 1 mm3 de-80 º C congelados stock y frotando suavemente en toda la placa YPD. Mueva el aplicador de madera hacia abajo de la placa para que cada paso va en una parte intacta de la superficie de los medios de comunicación. Incube la placa YPD a 30 ° C durante 2 días o hasta que las colonias solo son visibles. Hacer el caldo congelado de levadura de PJ69-4A por suspensión de levadura en el agua o el crecimiento de los medios de comunicación, que complementa con DMSO al 7% y almacenamiento a-80 ° C.
    2. Inocular una colonia solo en 5 mL de cultivo de YPD en un tubo de cultivo 20 x 150 mm con un aplicador de madera estéril y crecer durante la noche a 30 ° C en un incubador de agitación a 200 rpm.
    3. Sembrar 50 mL de YPD de 250 mL del matraz Erlenmeyer estéril con 4 mL de la cultura durante la noche de la cepa de levadura de PJ69-4A. Crecer en un incubador de agitación a 30 ° C, 200 rpm a una densidad óptica (OD600) de aproximadamente 1.2, según lo determinado por espectrofotometría con una trayectoria de la luz estándar de 1 cm. Crecimiento toma generalmente 5-7 h.
    4. Aislar la levadura por sedimentación en 50 mL de tubo cónico a 4.696 x g durante 5 min a temperatura ambiente en una centrífuga de sobremesa. Eliminar el sobrenadante por el dumping en residuos líquidos. Usando una pipeta, Resuspender el precipitado en 5 mL de tampón de transformación y transferencia a 15 mL de tubo cónico. Resediment y descartar el sobrenadante, Resuspender la levadura en 1 mL de volumen final de solución tampón de transformación con una pipeta de 1000 μl.
    5. Incube las células de levadura durante 60 min a 30 ° C y agitación a 200 rpm y coloque en hielo durante 30-90 minutos.
  2. Transformación del plásmido de levadura.
    1. En 1,5 mL de tubo de microcentrífuga estéril, añadir 1 μg de plásmido pTEF basados en GBD y 5 μl de portador de esperma de salmón de 10 mg/mL solución de ADN. También incluyen un tubo que contiene sólo el esperma de salmón portador ADN como control negativo de la transformación. Añada 100 μl de la suspensión de células de levadura helada a cada tubo con una pipeta. Añada 100 μl del 70% de solución de PEG con una pipeta de 1000 μl y mezcla suavemente por sacudiendo el tubo de 5 - 10 veces (no agitar con vortex).
    2. Incubar a 30 ° C, en un incubador de agitación a 200 rpm durante 45 minutos.
    3. Choque térmico a 42 ° C durante 15 minutos.
    4. Sedimento en una microcentrífuga a 845 x g durante 3 min a temperatura ambiente, pipeta de descartar el sobrenadante, Resuspender el precipitado en 150 μL de agua estéril mediante pipeteo arriba y abajo y extender por la superficie de una placa de CSM-Trp.
    5. Coloque las placas de la derecha arriba en incubadora de 30 ° C e incubar durante 2-3 días hasta que las colonias sean visibles. Las placas pueden ser al revés para evitar la condensación en la superficie de la placa después de incubación a 30 ° C durante 6-12 h.
    6. Tomar 2-3 colonias por transformación y raya como un parche en un plato de CSM-Trp usando un palillo de dientes estéril. Permiten para crecer durante 24 h a 30 ° C.
  3. Asegúrese de lisados de expresión de la proteína.
    1. Inocular 3 mL de medio líquido CSM-Trp con un partido--tamaño de la cabeza de la levadura del parche y crecer durante la noche a 30 ° C en un tubo de cultivo 20 x 150 mm, mientras que la agitación a 200 rpm. Hacer dos culturas durante la noche por vector vacío pTEF-DGB y el cebo.
    2. Añadir 1 mL de YPD a cada 3 mL de cultura noche CSM-Trp. Crecer por 1 h a 30 ° C, agitando a 200 rpm. Compruebe el OD de las células por el espectrofotómetro.
    3. Sedimento un número equivalente de células, normalizar según el OD. Utilizar 1,5 mL estéril de los tubos de microcentrífuga con un giro de 5 min a 2.348 x g a temperatura ambiente en una microcentrífuga. Utilice una pipeta para descartar el sobrenadante. La acción final corresponde a un mínimo de 2,1 OD.
      Nota: Al calcular el número equivalente de células, puede ocurrir que diferentes volúmenes puede requeridos de cada cultura durante la noche para lograr la mínima do 2.1.
    4. Resuspender el precipitado en 450 μl de 0.2 M NaOH por pipeteo arriba y abajo. Incubar por 5 min a temperatura ambiente. Centrifugar las células por 2 min a 2.348 x g a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante con una pipeta.
    5. Resuspender el precipitado con 50 μl de tampón de molinete mediante pipeteo arriba y abajo con cuidado para no hacer burbujas. Muestra de calor durante 5 minutos a 70 ° C.
  4. Si hay expresión de proteínas por SDS-PAGE.
    1. Uso un gel del gradiente de 4-20% para una amplia gama de pesos moleculares se puede resolver. Cantidad equivalente de carga (mismo OD) de muestras en un SDS-PAGE gel y asegúrese de incluir por lo menos una muestra que contiene el pTEF-GBD sin modificar vector13,14,15.
    2. Después de la separación electroforética, transferir el gel a nitrocelulosa y immunoblot usando anticuerpos monoclonales o policlonales anti-myc y la solución de detección ECL (figura 3).

4. uno mismo-activación prueba

  1. Raya la levadura de MATalpha de los valores de-80 ° C correspondiente a la tensión de la vivienda la biblioteca presa de interés sobre una placa de YPD tomando un aplicador de madera estéril, raspar una pequeña cantidad de levadura en el frasco y rayones en la placa YPD. Incube la placa YPD a 30 ° C durante 2 días o hasta que las colonias solo son visibles. Parche un par solo colonias en una placa de YPD e incubar durante una noche a 30 ° C.
    Nota: La nueva cepa se convirtió aquí a la biblioteca de casa presa es PLY5725 mientras que algunas bibliotecas compatibles de Y2H comercialmente disponibles se encuentran en Y187.
  2. Siga los procedimientos en 3.3.1 - 3.3.4 PLY5725 con LEU2de transformar-basado en el plásmido utilizado para albergar la biblioteca de la presa deseada. Para las bibliotecas se convirtió aquí, el plásmido correspondiente es pGal4AD (pPL6343). Recuperar levaduras transformantes, placa placas CSM-Leu-Met. Después de las colonias se presentan, racha como parches en un plato CSM-Leu-Met e incubar durante 24 h a 30 ° C.
  3. Seguir el protocolo en 3.4 para confirmar la expresión de pPL6343 vector vacío utilizando-HA anticuerpos monoclonales o policlonales y la solución de detección ECL.
  4. Raya de la levadura de PJ69-4A transformada en un patrón cruzado con PLY5725 construye en una placa YPD que fue confirmada a expresar la proteína en protocolo sección 3.4 y 4.3 e incubar a 30 ° C durante la noche. Tomar 1 mm3 de las células donde las dos cepas han crecido juntos y parche en separar CSM-Leu-Met, CSM-Trp y placas CSM-Trp-Leu y crecer 24 h.
    Nota: Diploides deseadas crecerá en las placas de CSM-Trp-Leu. En CSM-Leu-Met y Trp CSM placas sirven como control positivo para el crecimiento de la levadura.
  5. Crecer diploides en 1 mL de medio de Leu-Trp-CSM durante la noche a 30 ° C. Las células de 500 μl de sedimento de 1,5 mL de microcentrífuga tubo a 2.348 x g, 3 min a temperatura ambiente en una microcentrífuga. Descartar el sobrenadante con una pipeta. Resuspender las células en 1 mL de agua estéril y repetir la sedimentación y resuspensión. Compruebe el OD600 de las células.
  6. Realizar una serie de 1:10 diluciones seriadas de cada suspensión celular utilizando agua estéril con la puesta en marcha más concentrada la solución de cada uno a un OD de 0.5. Punto 5 μl de cada dilución en una placa de CSM-Leu-Trp, un CSM-Leu-Trp-su plato y un CSM-Leu-Trp-su + placa 3AT. Incubar a 30 ° C y examinar para el crecimiento diario durante 3 días (figura 4).
    Nota: para la 1:10 dilución seriada, Pipetear 10 μl del tubo que contiene un OD 0.5 en 90 μl de agua y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo. Continuar haciendo 1:10 diluciones seriadas hasta que hay un total de seis diferentes concentraciones a punto.

5. crear poblaciones de levaduras con cebo y presa biblioteca

Nota: La cepa Y187 que contiene plásmidos de biblioteca comercial de la presa no mate bien. Por lo tanto, las siguientes condiciones optimizadas están obligadas a mantener la complejidad de la biblioteca. La PLY5725 cepa que contiene Y2H presa bibliotecas compañeros mejor y el mismo procedimiento de acoplamiento puede utilizarse con esta cepa (figura 5).

  1. Inocular 3 mL de las culturas de cada uno de los transformantes PJ69-4A llevar los diversos TRP1-que contiene el plásmido de cebo de pTEF-GBD en medios CSM-Trp en un tubo de cultivo. Son dos culturas distintas que contienen el plásmido vector de pTEF-GBD para servir como controles de procedimiento. Incubar los cultivos a 30 º C, 200 rpm por 6 h y luego diluir en 25 mL de cultivo en un matraz de Erlenmeyer estéril para el crecimiento durante la noche.
  2. Descongelar un vial de congelados (-80 ° C) de las células de MATalpha que contiene el LEU2-llevar "presa" biblioteca a temperatura ambiente. Inocular una 125 mL de medio de CSM-Leu-Met en un erlenmeyer estéril con el frasco completamente descongelado. Crecen todas las culturas durante la noche a 30 ° C con agitación a 200 rpm.
    Nota: OD600 de las culturas durante la noche debe oscilar entre 1.0 a 1.5 antes de proceder a los pasos a seguir.
  3. De centrífuga 21 OD equivalentes a cada una de las culturas de la planta de PJ69-4A con una vuelta de 5 min a 4.696 x g a temperatura ambiente. Por cada 10 reacciones de acoplamiento deseado, pellets 39 OD600 equivalentes de la cepa de MATalpha con la plásmidos de biblioteca en separado 50 mL de tubos cónicos.
    1. Resuspender las células en 10 mL de agua estéril y volver a la pelotilla en nuevo 50 mL de tubo cónico 4.696 x g 5 min a temperatura ambiente en una centrífuga de sobremesa. Usando una pipeta, quite con cuidado el sobrenadante sin alterar las células alimentos peleteadas.
    2. Resuspender el pellet de células PJ69-4A en 4 mL de y PLY5725 células en 10 mL de bYPDA (pH 3,7).
  4. Al ajuste del acoplamiento de reacciones, añadir 1 mL de PJ69-4A transformado células, 1 mL de células que contiene la biblioteca de MATalpha y 1 mL de bYPDA pH 3,7 a nuevo 50 mL de tubo cónico. Incubar a 30 ° C con agitación orbital suave (100-130 rpm) durante 90 minutos.
    1. Centrifugar las células durante 5 min a 4.696 x g, a temperatura ambiente en una centrífuga de sobremesa. Quite el sobrenadante con una pipeta y resuspender el precipitado en 2 mL de 1:1 bYPDA:YPD. Todos a 2 mL de en un plato YPD 100 mm de la placa con una pipeta e incubar a 30 ° C por aproximadamente 20 h.
  5. Cosechar las células de las placas YPD usando un raspador celular para desalojar a las células en 2-3 mL de medio de CSM-Leu-Trp. Pipetear las células desalojadas en 50 mL de tubo cónico. Enjuague las placas de 4 - 5 veces con 2-3 mL de medio de CSM-Leu-Trp por pipeteo hasta los medios de comunicación utilizando un 1000 μl de pipeta y expulsar suavemente los medios de comunicación a través de la superficie de la placa YPD.
    1. Centrifugar las células durante 5 min a 4.696 x g a temperatura ambiente en una centrífuga de sobremesa. Descartar el sobrenadante con una pipeta y resuspender las células en 40 mL de medio de CSM-Leu-Trp mediante pipeteo arriba y abajo (do no agitar con vortex).
  6. Para estimar el número de células diploides formadas, diluir 4 μL de la mezcla diploide en medios de CSM-Trp-Leu de 2000 μl y 200 μl. Placa de 200 μL de cada dilución en una placa de CSM-Leu-Trp.
    Nota: Las dos placas representan un 1: 10,000 y 1: 100.000 veces la dilución de las acciones de diploides cosechadas y rendimiento un esperado ~ 9.000-27.000 colonias en la placa de la dilución de 1: 10,000 después de incubación a 30 ° C para h. 36-40 placas de verificación después de paso 5.7. Un número mínimo de 200 colonias en la placa de la dilución de 1: 10,000 es necesaria para proceder al paso 5.8
  7. Inmediatamente tome el resto de cada 40 mL de resuspensión de células e inocular 1.000 mL del matraz Erlenmeyer de 500 mL de medio de CSM-Leu-Trp. Tomar una de OD inicial600. Incube los frascos a 30 ° C con agitación a 180 rpm hasta llegar a saturación (~2.0 OD/mL). Esto normalmente toma aproximadamente 36-40 h. crecimiento de Monitor en 24 h entonces otra vez en 36 h por OD600.
  8. Mediante una pipeta, retire 20 mL de alícuotas de cada uno de lo 500 mL saturado de culturas y de inocular 2.000 mL de matraces de Erlenmeyer, uno que contiene 750 mL de medio CSM-Leu-Trp y lo 750 mL que contienen segunda de CSM-Leu-Trp-su con el nivel más bajo de 3Por que elimina el fondo (previamente determinada en la sección 4.5). Las nuevas culturas (770 mL) agitando bien la mezcla y tome una de OD inicial600.
  9. Incubar los cultivos a 30 º C agitando a 180 rpm hasta llegar a la saturación, que normalmente ocurre dentro de 24 h para la cultura de CSM-Leu-Trp no seleccionada y puede tomar más de 70 h de las culturas en la selección para las interacciones Y2H.
  10. Una vez que las culturas han llegado a saturación (OD ~ 2.0), quitar 11 mL de la pipeta, sedimento las células con una vuelta de 5 min a 4.696 x g a temperatura ambiente, descartar el sobrenadante con una pipeta y congelar a-20 ° C o continuar por la extracción de ADN. Las muestras seleccionadas y no seleccionadas tanto se utilizará para secuenciación profunda.

6. preparación para secuenciación profunda DEEPN

  1. Extracción de ADN.
    1. Utilice una pipeta para resuspender gránulos celulares de protocolo sección 5.7 en 500 μl de tampón de sTE y de transferencia a 1,5 mL de tubo de microcentrífuga. Agregar 3 μl de betamercaptoethanol y 10 μl del stock de Zymolase. Mezclar bien e incubar en la incubadora de 37 ° C durante 24-36 h.
    2. Extracto de la muestra dos veces con alcohol de fenol/cloroformo/isoamílico 500 μl durante el uso de una campana de humo16.
    3. Añadir 7 μl de 4 M NaCl, 900 μl de helado 100% de etanol (ETOH), mezclar por inversión y o congelación-20 ° C o seguir al sedimento del ADN por giro a 21.130 x g por 10 min a temperatura ambiente en una microcentrífuga.
    4. Descartar el sobrenadante con una pipeta. Lavar el precipitado tres veces con 900 μl de 70% ETOH.
    5. Sedimento, pellets 21.130 x g durante 2 min y retire residual lavado ETOH pipeta. Pelotilla seca durante 7 min a 42 ° C.
    6. Resuspender el precipitado en 120 μl de 0,1 x sTE en un baño de agua de 37 ° C durante 90 minutos, los tubos para mezclar cada 30 minutos de la película.
    7. Pipetee 60 μL de ADN extraído en una estéril 1.5 mL de tubo de microcentrífuga. Añadir 120 μl de sTE, 3,5 μl del stock de Rnasa A, flick para mezclar e incubar a 37 ° C durante 1 h.
    8. Precipitado de etanol, como se ha hecho en la sección 6.1.3 - 6.1.5, pero usar 7 μl de acetato de amonio de 5 M en lugar de 4 M NaCl.
    9. Resuspender Rnasa tratados con A DNA en 55 μl de 0,1 x sTE en un baño de agua de 37 ° C durante 90 minutos, película de los tubos para mezclar cada 30 minutos cuantificar ADN por absorbancia a 260 nm en un espectrofotómetro.
  2. Insertos de cDNA PCR.
    1. Realizar dos reacciones de PCR de 50 μL por cada muestra de ADN. Cada reacción contiene 25 pmol de cada primer avance y retroceso que empareja el plásmido presa-biblioteca (ver materiales). Las reacciones también contienen 25 μl de alta fidelidad 2 x PCR Master Mix, 5 μg de muestra de ADN y agua hasta 50 μl. amplificar las reacciones para 25 ciclos con tiempos de extensión de 3 min a 72 ° C, una temperatura Recueza de 55 ° C por 30 s y desnaturalizar a 98 ° C por 10 Precede s. ciclismo por una desnaturalización s 30 a 98 ° C y seguir con una incubación de 5 min a 72 ° C.
    2. Analizar 4 μL de cada reacción de PCR por electroforesis del gel de la agarosa del ADN del 1% con la agarosa de la DNA del gel que contiene de 0.2 - 0.5 μg/mL de EtBr17. Para ver la muestra de ADN por transiluminación UV. Muestras muestra un frotis de la DNA alrededor de 1-3 kb, donde el patrón de bandas puede encontrarse muestras donde una interacción Y2H fue seleccionado (figura 6).
    3. Combinar las muestras duplicadas de PCR y purificar mediante el kit de purificación PCR de acuerdo a las instrucciones del fabricante y cuantificar ADN por absorbancia a 260 nm en un espectrofotómetro.

7. profunda secuenciación

Nota: Preparación de la muestra y la secuencia en una plataforma de secuenciación profunda está típicamente disponible en comerciales y académicas instalaciones de base de la secuencia de ADN.

  1. Corte 600 ng del producto de PCR utilizando un alto rendimiento ultra-sonicador fragmentos de una longitud media de ~ 300 bp.
  2. Generar bibliotecas de secuenciación indexadas utilizando un kit de preparación para la secuencia profunda que añade a enlazadores codificación de códigos de barras, cebado de sitios, y capturar secuencias de forma asimétrica en los extremos de los fragmentos de ADN.
  3. Realizar la preparación de la biblioteca según las instrucciones del fabricante. Piscina indexadas bibliotecas y secuencia como Lee largo extremo apareado en una plataforma de secuenciación profunda (por ejemplo, 2 x 150 bp PE lecturas). El número de lecturas para cada muestra es entre 10 y 40 millones, con más lecturas para las poblaciones no seleccionadas que son típicamente más complejas. Le recomendamos que lee por lo menos 20 millones o más para las poblaciones no seleccionadas.

8. bioinformática procesamiento y verificación

  1. Secuencia de datos en el formulario de fastq con un conjunto de software independiente programas para (1) mapa de secuencia de leer archivos en un formato universal de SAM (2) cuantificar de la DNA del proceso enriquecimiento del gene entre conjuntos de datos (3) realizar análisis estadístico de datos en orden a clasificar cuál candidato genes son positivas para Y2H interacción (4) proporcionan información en cuanto a qué regiones y qué estructura traslacional cada del cDNA presa por gene fragmentos que rendimiento Y2H positivo están compuesto por las interacciones y (5) proporcionar herramientas para reconstruir no sólo el 5' sino también el extremo 3' de los fragmentos de interacción que permiten su reconstrucción y verificación en un formato tradicional de Y2H. Operación de estos programas se detalla en el estudio de acompañamiento.

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Resultados

El ensayo de Y2H ha sido ampliamente utilizado para la búsqueda de las interacciones proteína: proteína y se han desarrollado varias adaptaciones y sistemas. En su mayor parte, las mismas consideraciones que ayudan a asegurar el éxito con estos métodos anteriores son importantes para DEEPN. Algunos de los puntos de referencia importantes son: garantizar la expresión de dominio DNA-obligatorio proteínas de fusión, asegurando un bajo fondo de falso crecimiento su + en los diploides que cont...

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Discusión

Aquí ofrecemos a una guía de cómo llevar a cabo ensayos de Y2H en lote usando métodos optimizados. Hay algunos pasos críticos en el procedimiento para garantizar que la población de levaduras que se colocaba en la selección es representante de la biblioteca de partida y que suficiente de la población a partir de la levadura se utiliza para someterse a la selección para limitar la variabilidad . Lo importante, estos criterios son relativamente fáciles de lograr junto a adaptar los métodos y materiales para un ensayo de Y2...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar

Agradecimientos

Agradecemos al personal en el Instituto de genética humana para secuenciación y NGS biblioteca preparación. Damos las gracias por su experiencia en la preparación de fragmentos de la biblioteca genómica de la biblioteca de plásmido Y2H aquí Einat Snir. Este trabajo fue financiado por National Institutes of Health: NIH R21 EB021870-01A1 y beca de proyecto de investigación NSF: 1517110.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Illumina HiSeq 4000Plataforma de secuenciación profundaIllumina
Anticuerpos monoclonales anti-HABiolegend901514Anticuerpo primario para detectar la expresión de HA en construcciones pGal4AD Anticuerpos
policlonales anti-mycQED Biosciences Inc18826Anticuerpo primario para detectar la expresión de MYC en construcciones pTEF-GBD
NarINew England BioLabsR0191S
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S
BamHI-HFNew England BioLabsR3236S
XhoINew England BioLabsR0146S
Polietilenglicol 3350, polvoJ.T. BakerU2211-08
Salmon Sperm DNATrevigen, Inc vendido por Fisher Scientific50-948-286ADN portador para la transformación de levaduras sección 3.2.1.
Monosulfato de kanamicina Productos deinvestigación internacionalesK22000
LE AgarosaGeneMateE-3120-500utilizado para hacer geles de agarosa de ADN
de cloruro de sodioInternacionalS23025
triptonaInternacionalT60060
Productos de investigación de D-sorbitolInternacionalS23080
Acetato de litio dihidratadoMP Biomedicals155256
cloruro de calcioThermoFisherC79
EDTA Sal de sodiode investigación internacionalesE57020
Extracto de levadura en polvo Productosinvestigación internacionalesY20020
Base de nitrógeno de levadura (sulfato de amonio) sin aminoácidosResearch Products InternationalY20040
CSM-TRP-LEU+40ADEparaDCS0789
medio CSM-Trp-LEU-HIS+40ADEparaDCS1169
medio CSM-Leu-Metpara medioDCS0549
CSM-Trp-MetBio 101, Inc4520-922
L-metioninapara medioDOC0168
AdenineResearch Products InternationalA11500
D-(+)-GlucoseResearch Products InternationalG32045
Bacto AgarBD214010utilizado para la fabricación de placas de medios en la sección 1
PeptoneResearch Products InternationalP20240
3-amino-1,2,4 TriazolSigmaA8056
2- Mercaptoehanol (BME)Sigma-AldrichM6250
Zymolyase 100TUSBiológicoZ1004
Fosfato de potasio dibásicoSigmaP8281
Fenol:Cloroformo:IAAAmbionAM9732
Acetato de amonioSigma-Aldrich238074
Laboratorios de descontaminación deetanol2716
ARNasa AThermoFisherEN0531
UreaResearch Products InternationalU20200
SDSResearch Products InternationalL22010
glicerolSigma AldrichG5516
Tris-HClGibco15506-017
azul de bromofenolAmresco449
Kit de clonación de ensamblaje de GibsonNew England BiolabsE5510SMétodo de ensamblaje rápido para la clonación de plásmidos en la sección 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master MixNew England BiolabsM0541SSe utiliza para la amplificación de productos para el ensamblaje de Gibson en la sección 2.3, así como para la preparación de muestras para la secuenciación profunda de DEEPN en la sección 6.2.1
Bromuro de etidioAmresco0492-5G
Kit de purificación de PCR QIAquickQiagen28104Se utiliza para la purificación de productos de PCR en la sección 6.2.3
Kit de extracción de gel de ADN QiaquickQiagen28704Se utiliza para la purificación de pTEF-GBD digerido en la sección 2.1
Kit KAPA Hyper Prep KAPABiosystemsKK8500kit de preparación para la secuenciación profunda
Optimización de codoneshttp://www.jcat.de
Optimización de codoneshttps://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocksIntegrated DNA Technologies Fragmentosde ADN utilizados para la clonación en la sección 2.2
StringsThermofisherutilizados para la clonación en la sección 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit EPOCHLife SciencesUtilizado para preparar cantidades de ADN en la sección 2.3
Covaris E220Covarisultrasonido de alto rendimiento en sección 7
oligo nucelotide 5'- CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3'		Tecnologías de ADN integradas o Thermofisherutilizadas para la amplificación y secuenciación de PCR 5' inserto pTEF-GBD durante la construcción de plásmidos
oligo nucelotide 5'-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3'		Tecnologías de ADN integradas o Thermofisherutilizadas para la amplificación y secuenciación de PCR 5' insertan pTEF-GBD durante la construcción de plásmidos
oligo nucelotida 5'-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTCTC-3'		Tecnologías de ADN integradas o Thermofisherutilizadas para la amplificación y secuenciación de PCR 3' inserto pTEF-GBD durante la construcción de plásmidos
oligo nucelotide 5'-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3'		Tecnologías de ADN integradas o Thermofisherutilizadas para la amplificación y secuenciación de PCR 3' inserto pTEF-GBD durante la construcción de plásmidos
oligonucleótido 5'-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3'		Tecnologías de ADN integradas o Thermofisher5' Pimer utilizado para la amplificación de insertos de pGAL4AD
oligonucelotide 5'-GCACATGCT
AGCGTCAAATACC-3'		Tecnologías de ADN integradas o Thermofisher3' Pimer utilizado para la amplificación de insertos de pGAL4AD
oligonucelotide 5'-ACCCAAGCA
GTGGTATCAACG-3'		Integrated DNA Technologies o Thermofisher5' Pimer utilizado para la amplificación de insertos de pGADT7
oligonucelotide 5'- TATTTAGA
AGTGTCAACAACGTA -3'		Integrated DNA Technologies o Thermofisher3' Pimer utilizado para la amplificación de insertos de la cepa de levadura pGADT7
PJ69-4A MatAhttp://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Bibliotecas genómicas y una cepa huésped diseñada para la selección altamente eficiente de dos híbridos en levadura. GENÉTICA 1996 144:1425-1436MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBDDr. Robert Piper LabGal4-DNA binding doimain expression plasmid
pGal4AD (pPL6343)Dr. Robert Piper LabPlásmido de expresión de dominio de activación Gal4
placas de Petri de 100 mmKord-Vallmark vendido por VWR2900
Matraz PYREX Erlenmeyer de 125 mLFisher ScientificS63270
Matraz PYREX Erlenmeyer de 250 mLMatraz PyrexS63271
1.000 mL Matraz PYREX ErlenmeyerFisher ScientificS63274
Matraz PYREX Erlenmeyer de 2.000 mL Matraz FisherScientificS63275
20 X 150 mm Tubo de cultivo desechableThermofisher14-961-33
pipetaDrummond4-000-100
5 mL Pipeta serológicaDenvilleP7127
10 mL Pipeta serológicaDenvilleP7128
25 mL pipeta serológicaDenvilleP7129
1.000 mL PYREX Vaso de precipitados GriffinFisher Scientific02-540P
1.000 mL PYREX Botella de almacenamiento de medios utilizablesFisher Scientific06-414-1D
Cilindro graduado de 1.000 mLFisher Scientific08-572-6G
SpectraMax 190Dispositivosutilizados para medir la densidad óptica de las células
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000Espectrofotómetro utilizado para cuantificar la cantidad de ADN
UV electrónico transiluminadorUltra LumMEB 20utilizado para visualizar el ADN en un gel de agarosa de bromuro de etidio
P1000 Gilson PIPETMANFisher ScientificF123602G
P200 Gilson PIPETMANFisher ScientificF123601G
P20 Gilson PIPETMANFisher ScientificF123600G
P10 Gilson PIPETMANFisher ScientificF144802G
1250 y micro; L Puntas de pipeta de baja retenciónGeneMateP-1236-1250
200 µ Puntas de pipeta de retención LLowVWR10017-044
10 µ L XL Puntas de pipeta de baja retenciónVWR10017-042
Tubo cónico de 50 mlVWR490001-627
Tubo cónico de 15 mlVWR490001-621
Rascador de célulasDenville ScientificTC9310
1,5 mL Tubos de microcentrífugaUSA Scientific1615-5500
HClFluka Analytical318949-1L
NaOHJ.T. Baker5674-02
Aplicadores de maderaSolon Care55900
Microcentrífuga Eppendorf 5424MicrocentrífugaFisher Scientific05-400-005
Sorvall ST16RThermo Fisher Scientific75004381centrífuga de sobremesa
Amersham ECL Rabbit IgG, Ab entero ligado a HRP (de burro)GE HealthcareNA934-1MLAnticuerpo secundario
Amersham ECL IgG de ratón, Ab entero ligado a HRP (de ovejas)GE HealthcareNA931-1MLAnticuerpo secundario
SuperSignal West Pico Sustrato quimioluminiscenteThermo Fisher Scientific34080ECL
Incubadora IsotempThermo Fisher ScientificIncubadora
Mutitron 2INFORS HTIncubadora de agitación
Isotemp Baño de agua con control digital modelo 205Fisher Scientificbaño de agua
Y2H Biblioteca de ADNc para ratones en Y187 (tejido pan)Clontech630482Biblioteca de ADNc disponible comercialmente
ADNc para ratones Y2H en Y187 (cerebro de ratón)Clontech630488Biblioteca de ADNc disponible comercialmente
VectorpGADT7 ADClontech630442vector AD disponible comercialmente que alberga muchas bibliotecas de ADNc
pGBKT7 Vector DNA-BDClontech630443disponible comercialmente Vector DNA-BD
Biolase ADN polimerasaBiolineBIO-21042ADN polimerasa utilizada para la sección 2.4
Termociclador GeneMate GCL-60 MáquinaPCRBioExpressP-6050-60
Tubos de PCR TempAssure 0,5 mLCientífico de EE. UU1405-8100
Productos de investigaciónProductos de investigación de Productos de , INC Fragmentos de ADN de moleculares Biblioteca de de .

Referencias

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