Procesamiento por lotes de pantallas 2-híbrido de levadura permite la comparación directa de los perfiles de la interacción de múltiples proteínas de cebo con un sistema altamente complejo presa de proteínas de fusión. Aquí, describimos métodos de refinado, nuevos reactivos y cómo implementar su uso para esas pantallas.
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Artículo de método
Una pantalla de 2 híbrido de levadura en lote para comparar las interacciones proteína
En este artículo
Resumen
Resumen
Detección de interacciones proteína-proteína usando el análisis de 2 híbrido de levadura ha sido una herramienta eficaz, pero su uso en gran parte se ha limitado al descubrimiento de interactianos de alta afinidad que se enriquecen altamente en la biblioteca de los candidatos interactúan. En un formato tradicional, el ensayo de 2-híbrido de la levadura puede producir también muchas colonias a analizar cuando se llevó a cabo en baja estrigencia donde podrían hallarse los interactianos de baja afinidad. Por otra parte, sin un interrogatorio amplio y completo de la misma biblioteca contra cebos diferentes plásmidos, no se puede lograr un análisis comparativo. Aunque algunos de estos problemas pueden abordarse utilizando bibliotecas de vestida de presa, el costo y la infraestructura necesaria para el funcionamiento de estas pantallas pueden ser prohibitivos. Como alternativa, hemos adaptado el ensayo 2-híbrido de levadura para descubrir al mismo tiempo decenas de transitorios y las interacciones de proteínas estáticas dentro de una sola pantalla utilizando una estrategia denominada DEEPN (enriquecimiento dinámico para la evaluación de redes de proteínas), que incorpora la secuencia de la DNA de alto rendimiento y cálculo para seguir la evolución de una población de plásmidos que codifican a socios interactúan. Aquí, describimos modificado para requisitos particulares los reactivos y protocolos que permiten una pantalla DEEPN para ejecutar fácil y rentable.
Introducción
Una comprensión completa de los procesos biológicos de la célula se basa en la búsqueda de las redes de interacción de proteínas que subyacen sus mecanismos moleculares. Un enfoque para identificar las interacciones entre proteínas es la levadura 2-híbrido (Y2H), que trabaja montando un factor de transcripción quimérica de funcionamiento una vez que dos dominios de la proteína de interés unen unos a otros1. Una típica pantalla de Y2H se realiza mediante la creación de una población de levaduras que alberga tanto una biblioteca de plásmidos que codifican las proteínas interactúan con fusible para un activador transcripcional (ej., prote....
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Protocolo
1. preparación de medios de comunicación y placas
Nota: Todas las placas deben ser mínimamente 2 días antes de comenzar el protocolo. Los medios de comunicación se pueden hacer en cualquier momento. Sin embargo, la adenina de dextrosa de peptona de extracto de levadura protegido (bYPDA) debe hacerse el día que se utilizará. Algunos medios de comunicación se realiza mediante una combinación de suplemento que contiene un nivel de adenina que es más grande que lo que se suele utilizar. Más suplementos de medios mínimos especifican adenina 10 mg/L. Suplementos con la etiqueta '+ 40Ade' especificar un total de adenina 40 mg/L.
- Preparar....
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Resultados
El ensayo de Y2H ha sido ampliamente utilizado para la búsqueda de las interacciones proteína: proteína y se han desarrollado varias adaptaciones y sistemas. En su mayor parte, las mismas consideraciones que ayudan a asegurar el éxito con estos métodos anteriores son importantes para DEEPN. Algunos de los puntos de referencia importantes son: garantizar la expresión de dominio DNA-obligatorio proteínas de fusión, asegurando un bajo fondo de falso crecimiento su + en los diploides que cont.......
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Discusión
Aquí ofrecemos a una guía de cómo llevar a cabo ensayos de Y2H en lote usando métodos optimizados. Hay algunos pasos críticos en el procedimiento para garantizar que la población de levaduras que se colocaba en la selección es representante de la biblioteca de partida y que suficiente de la población a partir de la levadura se utiliza para someterse a la selección para limitar la variabilidad . Lo importante, estos criterios son relativamente fáciles de lograr junto a adaptar los métodos y materiales para un ensayo de Y2.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar
Agradecimientos
Agradecemos al personal en el Instituto de genética humana para secuenciación y NGS biblioteca preparación. Damos las gracias por su experiencia en la preparación de fragmentos de la biblioteca genómica de la biblioteca de plásmido Y2H aquí Einat Snir. Este trabajo fue financiado por National Institutes of Health: NIH R21 EB021870-01A1 y beca de proyecto de investigación NSF: 1517110.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Illumina HiSeq 4000 | Plataforma de secuenciación profunda | Illumina | |
| Anticuerpos monoclonales anti-HA | Biolegend | 901514 | Anticuerpo primario para detectar la expresión de HA en construcciones pGal4AD Anticuerpos |
| policlonales anti-myc | QED Biosciences Inc | 18826 | Anticuerpo primario para detectar la expresión de MYC en construcciones pTEF-GBD |
| NarI | New England BioLabs | R0191S | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3236S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| Polietilenglicol 3350, polvo | J.T. Baker | U2211-08 | |
| Salmon Sperm DNA | Trevigen, Inc vendido por Fisher Scientific | 50-948-286 | ADN portador para la transformación de levaduras sección 3.2.1. |
| Monosulfato de kanamicina Productos de | investigación internacionales | K22000 | |
| LE Agarosa | GeneMate | E-3120-500 | utilizado para hacer geles de agarosa de ADN |
| de cloruro de sodio | Internacional | S23025 | |
| triptona | Internacional | T60060 | |
| Productos de investigación de D-sorbitol | Internacional | S23080 | |
| Acetato de litio dihidratado | MP Biomedicals | 155256 | |
| cloruro de calcio | ThermoFisher | C79 | |
| EDTA Sal de sodio | de investigación internacionales | E57020 | |
| Extracto de levadura en polvo Productos | investigación internacionales | Y20020 | |
| Base de nitrógeno de levadura (sulfato de amonio) sin aminoácidos | Research Products International | Y20040 | |
| CSM-TRP-LEU+40ADE | para | DCS0789 | |
| medio CSM-Trp-LEU-HIS+40ADE | para | DCS1169 | |
| medio CSM-Leu-Met | para medio | DCS0549 | |
| CSM-Trp-Met | Bio 101, Inc | 4520-922 | |
| L-metionina | para medio | DOC0168 | |
| Adenine | Research Products International | A11500 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International | G32045 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | utilizado para la fabricación de placas de medios en la sección 1 |
| Peptone | Research Products International | P20240 | |
| 3-amino-1,2,4 Triazol | Sigma | A8056 | |
| 2- Mercaptoehanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Zymolyase 100T | USBiológico | Z1004 | |
| Fosfato de potasio dibásico | Sigma | P8281 | |
| Fenol:Cloroformo:IAA | Ambion | AM9732 | |
| Acetato de amonio | Sigma-Aldrich | 238074 | |
| Laboratorios de descontaminación de | etanol | 2716 | |
| ARNasa A | ThermoFisher | EN0531 | |
| Urea | Research Products International | U20200 | |
| SDS | Research Products International | L22010 | |
| glicerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Tris-HCl | Gibco | 15506-017 | |
| azul de bromofenol | Amresco | 449 | |
| Kit de clonación de ensamblaje de Gibson | New England Biolabs | E5510S | Método de ensamblaje rápido para la clonación de plásmidos en la sección 2 |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541S | Se utiliza para la amplificación de productos para el ensamblaje de Gibson en la sección 2.3, así como para la preparación de muestras para la secuenciación profunda de DEEPN en la sección 6.2.1 |
| Bromuro de etidio | Amresco | 0492-5G | |
| Kit de purificación de PCR QIAquick | Qiagen | 28104 | Se utiliza para la purificación de productos de PCR en la sección 6.2.3 |
| Kit de extracción de gel de ADN Qiaquick | Qiagen | 28704 | Se utiliza para la purificación de pTEF-GBD digerido en la sección 2.1 |
| Kit KAPA Hyper Prep KAPA | Biosystems | KK8500 | kit de preparación para la secuenciación profunda |
| Optimización de codones | http://www.jcat.de | ||
| Optimización de codones | https://www.idtdna.com/CodonOpt | ||
| gBlocks | Integrated DNA Technologies Fragmentos | de ADN utilizados para la clonación en la sección 2.2 | |
| Strings | Thermofisher | utilizados para la clonación en la sección 2.2 | |
| GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit EPOCH | Life Sciences | Utilizado para preparar cantidades de ADN en la sección 2.3 | |
| Covaris E220 | Covaris | ultrasonido de alto rendimiento en sección 7 | |
| oligo nucelotide 5'- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3' | Tecnologías de ADN integradas o Thermofisher | utilizadas para la amplificación y secuenciación de PCR 5' inserto pTEF-GBD durante la construcción de plásmidos | |
| oligo nucelotide 5'-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3' | Tecnologías de ADN integradas o Thermofisher | utilizadas para la amplificación y secuenciación de PCR 5' insertan pTEF-GBD durante la construcción de plásmidos | |
| oligo nucelotida 5'-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTCTC-3' | Tecnologías de ADN integradas o Thermofisher | utilizadas para la amplificación y secuenciación de PCR 3' inserto pTEF-GBD durante la construcción de plásmidos | |
| oligo nucelotide 5'-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3' | Tecnologías de ADN integradas o Thermofisher | utilizadas para la amplificación y secuenciación de PCR 3' inserto pTEF-GBD durante la construcción de plásmidos | |
| oligonucleótido 5'-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3' | Tecnologías de ADN integradas o Thermofisher | 5' Pimer utilizado para la amplificación de insertos de pGAL4AD | |
| oligonucelotide 5'-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3' | Tecnologías de ADN integradas o Thermofisher | 3' Pimer utilizado para la amplificación de insertos de pGAL4AD | |
| oligonucelotide 5'-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3' | Integrated DNA Technologies o Thermofisher | 5' Pimer utilizado para la amplificación de insertos de pGADT7 | |
| oligonucelotide 5'- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3' | Integrated DNA Technologies o Thermofisher | 3' Pimer utilizado para la amplificación de insertos de la cepa de levadura pGADT7 | |
| PJ69-4A MatA | http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Bibliotecas genómicas y una cepa huésped diseñada para la selección altamente eficiente de dos híbridos en levadura. GENÉTICA 1996 144:1425-1436 | MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7 | |
| pTEF-GBD | Dr. Robert Piper Lab | Gal4-DNA binding doimain expression plasmid | |
| pGal4AD (pPL6343) | Dr. Robert Piper Lab | Plásmido de expresión de dominio de activación Gal4 | |
| placas de Petri de 100 mm | Kord-Vallmark vendido por VWR | 2900 | |
| Matraz PYREX Erlenmeyer de 125 mL | Fisher Scientific | S63270 | |
| Matraz PYREX Erlenmeyer de 250 mL | Matraz Pyrex | S63271 | |
| 1.000 mL Matraz PYREX Erlenmeyer | Fisher Scientific | S63274 | |
| Matraz PYREX Erlenmeyer de 2.000 mL Matraz Fisher | Scientific | S63275 | |
| 20 X 150 mm Tubo de cultivo desechable | Thermofisher | 14-961-33 | |
| pipeta | Drummond | 4-000-100 | |
| 5 mL Pipeta serológica | Denville | P7127 | |
| 10 mL Pipeta serológica | Denville | P7128 | |
| 25 mL pipeta serológica | Denville | P7129 | |
| 1.000 mL PYREX Vaso de precipitados Griffin | Fisher Scientific | 02-540P | |
| 1.000 mL PYREX Botella de almacenamiento de medios utilizables | Fisher Scientific | 06-414-1D | |
| Cilindro graduado de 1.000 mL | Fisher Scientific | 08-572-6G | |
| SpectraMax 190 | Dispositivos | utilizados para medir la densidad óptica de las células | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | Espectrofotómetro utilizado para cuantificar la cantidad de ADN |
| UV electrónico transiluminador | Ultra Lum | MEB 20 | utilizado para visualizar el ADN en un gel de agarosa de bromuro de etidio |
| P1000 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F123602G | |
| P200 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F123601G | |
| P20 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F123600G | |
| P10 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F144802G | |
| 1250 y micro; L Puntas de pipeta de baja retención | GeneMate | P-1236-1250 | |
| 200 µ Puntas de pipeta de retención LLow | VWR | 10017-044 | |
| 10 µ L XL Puntas de pipeta de baja retención | VWR | 10017-042 | |
| Tubo cónico de 50 ml | VWR | 490001-627 | |
| Tubo cónico de 15 ml | VWR | 490001-621 | |
| Rascador de células | Denville Scientific | TC9310 | |
| 1,5 mL Tubos de microcentrífuga | USA Scientific | 1615-5500 | |
| HCl | Fluka Analytical | 318949-1L | |
| NaOH | J.T. Baker | 5674-02 | |
| Aplicadores de madera | Solon Care | 55900 | |
| Microcentrífuga Eppendorf 5424 | Microcentrífuga | Fisher Scientific | 05-400-005 |
| Sorvall ST16R | Thermo Fisher Scientific | 75004381 | centrífuga de sobremesa |
| Amersham ECL Rabbit IgG, Ab entero ligado a HRP (de burro) | GE Healthcare | NA934-1ML | Anticuerpo secundario |
| Amersham ECL IgG de ratón, Ab entero ligado a HRP (de ovejas) | GE Healthcare | NA931-1ML | Anticuerpo secundario |
| SuperSignal West Pico Sustrato quimioluminiscente | Thermo Fisher Scientific | 34080 | ECL |
| Incubadora Isotemp | Thermo Fisher Scientific | Incubadora | |
| Mutitron 2 | INFORS HT | Incubadora de agitación | |
| Isotemp Baño de agua con control digital modelo 205 | Fisher Scientific | baño de agua | |
| Y2H Biblioteca de ADNc para ratones en Y187 (tejido pan) | Clontech | 630482 | Biblioteca de ADNc disponible comercialmente |
| ADNc para ratones Y2H en Y187 (cerebro de ratón) | Clontech | 630488 | Biblioteca de ADNc disponible comercialmente |
| Vector | pGADT7 ADClontech | 630442 | vector AD disponible comercialmente que alberga muchas bibliotecas de ADNc |
| pGBKT7 Vector DNA-BD | Clontech | 630443 | disponible comercialmente Vector DNA-BD |
| Biolase ADN polimerasa | Bioline | BIO-21042 | ADN polimerasa utilizada para la sección 2.4 |
| Termociclador GeneMate GCL-60 Máquina | PCR | BioExpress | P-6050-60 |
| Tubos de PCR TempAssure 0,5 mL | Científico de EE. UU | 1405-8100 |
Referencias
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
- Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Mo....
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Reimpresiones y permisos
