La diferenciación de los adipocitos blancos y beiges de tejido adiposo vascular progenitores tiene potencial para mejoramiento metabólico en obesidad. Se describen los protocolos para un CD34 + CD31 + aislamiento de células endoteliales de la grasa humana y un posterior en vitro expansión y diferenciación a adipocitos blancos y beiges. Se discuten varias aplicaciones posteriores.
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Artículo de método
Aislamiento, expansión y Adipogenic inducción de CD31 + CD34 + células endoteliales del humano omentales y subcutáneos de tejido adiposo
En este artículo
Resumen
Resumen
La obesidad se acompaña de una amplia remodelación del tejido adiposo sobre todo a través de la hipertrofia del adipocito. Crecimiento del adipocito extremas resulta en una pobre respuesta a la insulina, la hipoxia local y la inflamación. Mediante la estimulación de la diferenciación de los adipocitos blancos funcionales de progenitores, hipertrofia radical de la población de adipocitos puede prevenirse y, en consecuencia, se puede mejorar la salud metabólica del tejido adiposo junto con una reducción de inflamación. También, estimulando una diferenciación de los adipocitos beige/marrón, el gasto de energía total del cuerpo puede aumentar, lo que resulta en pérdida de peso. Este enfoque podría prevenir el desarrollo de comorbilidades de la obesidad como diabetes tipo 2 y enfermedad cardiovascular.
Este papel describe el aislamiento, expansión y diferenciación de los adipocitos blancos y beiges de un subconjunto de las células endoteliales humanas de tejido adiposo que conjuntamente expresan los marcadores CD31 y CD34. El método es relativamente barato y no se requiere mano de obra. Requiere acceso a tejido adiposo humano y el depósito subcutáneo es adecuado para el muestreo. De este protocolo, muestras de tejido adiposo fresco de sujetos obesos mórbidos [índice de masa corporal (IMC) > 35] se recogen durante los procedimientos de cirugía bariátrica. Utilizando un immunoseparation secuencial de la fracción vascular estromal, se producen suficientes células desde tan poco como 2-3 g de grasa. Estas células pueden ampliarse en cultura durante 10 – 14 días, pueden ser criopreservadas y retienen sus propiedades adipogenic con pases hasta el paso 5 y 6. Las células se tratan durante 14 días con un coctel utilizando una combinación de la insulina humana y lo agonistas PPARy-rosiglitazona adipogenic.
Esta metodología puede utilizarse para la obtención de la prueba de los experimentos de concepto en los mecanismos moleculares que conducen a respuestas adipogenic en adiposas células endoteliales, o para la detección de nuevos fármacos que pueden mejorar la adipogenic respuesta dirigida ya sea hacia el blanco o diferenciación del adipocito marrón/beige. Utilizando pequeñas biopsias subcutáneas, esta metodología puede utilizarse para descartar temas no respondedor ensayos clínicos dirigidos a estimular los adipositos beige/marrón y blanco para el tratamiento de la obesidad y comorbilidades.
Introducción
La evidencia reciente muestra que tanto en ratones como en seres humanos, se puede distinguir un subconjunto de células residentes en la vasculatura de tejido adiposo en ya sea blanco o beige/brown adipocytes1,2,3. El fenotipo de estas células es un tema de controversia, con evidencias que las células endoteliales, músculo liso/pericyte o un espectro de fenotipos intermedios4,5,6,7. El alcance del desarrollo de esta metodología fue probar el potenci....
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Protocolo
El Comité de revisión institucional en Eastern Virginia Medical School aprobó la investigación y recolección de muestras de tejido adiposo humano utilizado en el estudio. Se obtuvo consentimiento informado de los pacientes.
1. preparación de tampones, medios e instrumentos
- Preparar una solución de Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS): 135 mM cloruro sódico, cloruro de potasio 5 mM, sulfato de magnesio 1 m m, 0.4m m potasio Fosfato dibásico, 5,5 mM de glucosa, adenosina 1 mM, 0.01% antibiótico/antimicótico mezcla (50 μg/mL de penicilina, 50 μg/mL de estreptomicina, 30 μg/mL de gentamicina, 15 ng/mL de anfotericina) y 10 mM HEP....
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Resultados
Nuestro protocolo tiene como objetivo proporcionar un enfoque en vitro para determinar el potencial de adipogenic de CD31 + CD34 + células vasculares de diferentes depósitos de tejido adiposo humano. En la figura 1Ase muestra un diagrama de diagrama de flujo simplificado. El primer paso mediante una selección positiva de CD34 expresando células resulta en > 95% CD34 + células en la población de las células recién aisladas (fig.......
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Discusión
El enfoque de este trabajo es proporcionar una metodología para el aislamiento, expansión y adipogenic inducción de CD31 + CD34 + de las células endoteliales de los depósitos viscerales y subcutáneos de tejido adiposo humano.
Metodologías se han divulgado para el aislamiento de las células endoteliales de varios lechos vasculares de roedores o humanos que implican principalmente técnicas usando CD31 anticuerpos fluorescente etiquetado o junto a granos magnéticos18,.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean reconocer Becky Márquez, el Coordinador de la clínica en el centro de bariátrica Sentara su asistencia con el proceso de paciente investigación y consintiendo. Esta investigación fue apoyada por R15HL114062 a Anca D. Dobrian.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipos grandes | |||
| Gabinete de bioseguridad | Nuaire | nu-425-400 | |
| Incubadora de cultivo celular | Thermo-Fisher Scientific | 800 DH | |
| Baño de agua | Forma Scientific | 2568 | Agitador recíproco |
| Máquina RT-PCR | BIO-RAD | > CFX96-C1000 | |
| Caja de electroforesis | BIO-RAD | Mini PROTEAN 3 celdas | |
| Caja Transblot | BIO-RAD | Mini celda trans-blot | |
| Electroforesis Fuente de alimentación | BIO-RAD | PowerPac Basic | |
| Lector de ELISA | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Lector de borrones | LI-COR | Odyssey | Infrarrojo cercano |
| Centrífuga refrigerada < | p>Eppendorf | 5810 R | |
| Centrífuga de sobremesa | Eppendorf | MiniSpin Plus | |
| Microscopio fluorescente | Olympus | BX50 | |
| Microscopio invertido | Nikon | TMS | |
| KRBSS Buffer | |||
| HEPES | Research Products International | H75030 | |
| Bicarbonato de sodio | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| Cloruro de calcio dihidratado | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Fosfato de potasio monobásico | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sulfato de magnesio | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Cloruro de sodio | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Fosfato de sodio monobásico monohidratado | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Potasio cloruro | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Glucosa | Acros Organics | 410950010 | |
| Adenosina | Acros Organics | 164040250 | |
| Albúmina sérica bovina | GE Biociencias de la salud | SH30574.02 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Thermo-Fisher Scientific | 15070063 | |
| Digestión de tejidos | |||
| 20 mL Jeringa | Global Medical | 67-2020 | |
| Malla de nylon, 250 y micro; m | Sefar | 03-250/50 | |
| Agujas de pipeteo | Popper | 7934 | |
| Tijeras finas | Herramientas de ciencia fina | 14058-11 | |
| Pinzas de tejido | George Tiemann & Co | 160-20 | |
| Colagenasa Tipo I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Placas de Petri, 100 mm | USA Scientific | 5666-4160 | TC tratado |
| Tubos Eppendorf, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Tubos cónicos, 15 mL | Nest Scientific | 601052 | |
| Tubos cónicos, 50 mL | Nalgene | 3119-0050 | |
| Viales de centelleo | Kimble | 74505-20 | Cubitos de tejidos |
| Aislamiento celular | |||
| Celómetro | Nexcelom | Auto 2000 | |
| Portaobjetos de celómetro | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
| Tinción de viabilidad del celómetro | Nexcelom | CS2-0106-5mL | Naranja de acridina/Propidium Yodo |
| Anti-CD34 Magnetic Beads | StemCell Technologies | 18056 | Kit |
| EasySep Imán | StemCell Technologies | 18000 | |
| Anti-CD31 Plastic Beads | pluriSelect USA | 19-03100-10 | |
| pluriSelect 10x Wash Buffer | pluriSelect USA | 60-00080-10 | |
| pluriSelect Anillo de conector | pluriSelect USA | 41-50000-03 | |
| pluriSelect Tampón de desprendimiento | pluriSelect USA | 60-00046-12 | |
| pluriSelect Tampón de incubación | pluriSelect USA | 60-00060-12 | |
| pluriSelect S Filtro de células | pluriSelect USA | 43-50030-03 | |
| Cell Culture | |||
| 6-pocillos Placas | USA Scientific | > CC7682-7506 | TC tratado |
| 4- portaobjetos con | Corning Life Sciences | 354559 | Fibronectina recubierto |
| 4 portaobjetos con | Thermo-Fisher Scientific | 154526PK | Vidrio sin recubrimiento |
| Células endoteliales microvasculares adiposas humanas (HAMVEC) | Sciencell Research Laboratories | 7200 | Primary cell line |
| Endothelial Cell Media (ECM) | ScienCell Research Laboratories | 1001 | Kit completo |
| DMEM/F12 Basal Media | Thermo-Fisher Scientific | 11320082 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Rocky Mountain Biologicals | FBS-BBT | |
| Insulina | Lilly | U-100 | Humalog |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Cell Analysis | |||
| Oil Red O Dye | Sigma-Aldrich | O0625 | > Preparado en isopropanol |
| 96 placas de pocillos | USA Scientific | 1837-9600 | |
| 96 placas de PCR | Genesee Scientific | 24-300 | |
| Extracción de ARN | Zymo Research | R2072 | Kit |
| cDNA Synthesis | BIO-RAD | 1708841 | Supermix |
| JumpStart PCR Polimerasa | Sigma-Aldrich | D9307-250UN | Arranque en caliente, con tampón de PCR N |
| Solución de cloruro de magnesio | Sigma-Aldrich | M8787-5ML | 3 mM final en reacción de PCR |
| dNTPs | Promega | U1515 | |
| TaqMan AdipoQ | Thermo-Fisher Scientific | Hs00605917_m1 | |
| TaqMan CIDEA | Thermo-Fisher Scientific | Hs00154455_m1 | |
| TaqMan RPL27 | Thermo-Fisher Scientific | Hs03044961_g1 | |
| TaqMan UCP1 | Thermo-Fisher Scientific | Hs00222453_m1 | |
| BCA Assay | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | Kit |
| Bis-acrilamida | BIO-RAD | 1610146 | 40% solución madre |
| Persulfato de amonio | BIO-RAD | 1610700 | |
| TEMED | BIO-RAD | 1610800 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Glicina | BIO-RAD | 1610718 | |
| Sulfato de dodecal sódico | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-100 | |
| Azul de bromofenol | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| Membrana de transferencia | EMD Millipore | IPFL00010 | |
| Metanol | Fisher Scientific | A452-SK4 | |
| Odyssey Blocking Buffer, Tris | LI-COR | 927-50000 | |
| < p>Anticuerpo anti-AKT | Cell Signaling Technology | 2920S | Monoclonal de ratón |
| Anticuerpo anti-pAKT | Tecnología de señalización celular | 9271S | Conejo policlonal |
| Anticuerpo anti-UCP1 | Abcam | ab10983 | Conejo policlonal |
| Anticuerpo IgG anti-ratón | LI-COR | 926-68070 | Policlonal de Cabra, IRDye 680RD |
| Anticuerpo IgG anti-Conejo | LI-COR | 926-32211 | 3Policlonal de Cabra, IRDye 800CW |
| Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-025-003 | Policlonal de Cabra, TRITC |
| Solución salina tampón de fosfato | Thermo-Fisher Scientific | 10010049 | |
| 37% Solución de formaldehído | Electrónica Microscopy Sciences | 15686 | 4% solución para fijación celular |
| Suero de cabra normal | Vector Laboratories | S-1000 | 10% solución de permeabilidad |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | 0.1% solución de permeabilización |
| DAPI | Thermo-Fisher Scientific | D1306 | |
| Calceína AM | Thermo-Fisher Scientific | 65-0853-39 | Visualización fluorescente de células |
| Matrigel Matriz de membrana basal | Corning Life Sciences | 356231 | factor de crecimiento reducido |
| DiI marcado Acetilado LDL | Thermo-Fisher Scientific | L3484 |
Referencias
- Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metaboli....
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Reimpresiones y permisos
