Definición acompañante Regulación Redox actividad de Hsp33 y mapeo de cambios conformacionales en la Hsp33 mediante espectrometría de masas de intercambio hidrógeno-deuterio

Rosi Fassler; Nufar Edinger; Oded Rimon; Dana Reichmann

doi:10.3791/57806

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Artículo de método

Definición acompañante Regulación Redox actividad de Hsp33 y mapeo de cambios conformacionales en la Hsp33 mediante espectrometría de masas de intercambio hidrógeno-deuterio

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DOI:

10.3791/57806

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7 de junio de 2018

Rosi Fassler^*¹ , Nufar Edinger^*¹ , Oded Rimon¹ , Dana Reichmann¹

¹Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Safra Campus Givat Ram, The Hebrew University of Jerusalem

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Una de las más difíciles condiciones de estrés que organismos durante toda su vida consiste en la acumulación de oxidantes. Durante el estrés oxidativo, las células dependen pesadamente chaperonas moleculares. Aquí, presentamos los métodos utilizados para investigar la regulación redox agregación de la actividad, así como para dar seguimiento a los cambios estructurales que rigen la función de chaperona con HDX-MS.

Resumen

Los organismos vivos necesitan regularmente hacer frente a ambientes fluctuantes durante su ciclo de vida, incluyendo cambios en la temperatura, pH, la acumulación de especies reactivas del oxígeno y más. Estas fluctuaciones pueden dar lugar a una proteína extensiva despliegue, agregación y muerte celular. Por lo tanto, las células han desarrollado una red dinámica y estrés específico de chaperonas moleculares, que mantener un "sano" proteoma durante condiciones de estrés. Acompañantes independientes de ATP constituyen una importante clase de chaperonas moleculares, que sirven como moléculas de defensa de primera línea, protegiendo contra la agregación de proteínas en una forma dependiente de la tensión. Una característica de que estos acompañantes tienen en común es su capacidad para utilizar la plasticidad estructural para su activación específica de estrés, el reconocimiento y la versión del cliente mal plegado.

En este artículo, nos centramos en el análisis funcional y estructural de un tal acompañante intrínsecamente desordenada, la Hsp33 bacteriana regulada de redox, que protege a las proteínas contra la agregación durante el estrés oxidativo. Aquí, presentamos una caja de herramientas de diversas técnicas para estudiar la actividad de regulación redox acompañante, así como para el mapeo de cambios conformacionales de la acompañante, subyacente a su actividad. Específicamente, se describe un flujo de trabajo que incluye la preparación de proteínas completamente reducidas y completamente oxidadas, seguido de un análisis de chaperone actividad contra la agregación en vitro usando dispersión de luz, centrándose en el grado de la actividad contra la agregación y su cinética. Para superar los frecuentes afloramientos acumuladas durante ensayos de agregación, describimos el uso de Kfits, una nueva herramienta gráfica que permite el fácil procesamiento de medidas cinéticas. Esta herramienta se puede aplicar fácilmente a otros tipos de medidas cinéticas para eliminación de outliers y parámetros cinéticos. Para correlacionar la función con la estructura de la proteína, se describen la configuración y el flujo de trabajo de una técnica estructural espectrometría de masas, espectrometría de masas de intercambio hidrógeno-deuterio, que permite el mapeo de cambios conformacionales en la acompañante y sustrato durante las diferentes etapas de la actividad de la Hsp33. La misma metodología se puede aplicar a otras interacciones proteína-proteína y proteína-ligando.

Introducción

Las células con frecuencia encuentran una acumulación de especies reactivas del oxígeno (ROS), producidas como subproductos de la respiración¹^,², proteína, lípido oxidación³^,⁴y procesos adicionales⁵^, ⁶^,⁷. A pesar del papel beneficioso de ROS en diversos procesos biológicos como celular⁸^,⁹ y respuesta inmune¹⁰de señalización, un desequilibrio entre la producción de ROS y su desi....