Artículo de método

Definición acompañante Regulación Redox actividad de Hsp33 y mapeo de cambios conformacionales en la Hsp33 mediante espectrometría de masas de intercambio hidrógeno-deuterio

DOI:

10.3791/57806

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7 de junio de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Safra Campus Givat Ram, The Hebrew University of Jerusalem

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una de las más difíciles condiciones de estrés que organismos durante toda su vida consiste en la acumulación de oxidantes. Durante el estrés oxidativo, las células dependen pesadamente chaperonas moleculares. Aquí, presentamos los métodos utilizados para investigar la regulación redox agregación de la actividad, así como para dar seguimiento a los cambios estructurales que rigen la función de chaperona con HDX-MS.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los organismos vivos necesitan regularmente hacer frente a ambientes fluctuantes durante su ciclo de vida, incluyendo cambios en la temperatura, pH, la acumulación de especies reactivas del oxígeno y más. Estas fluctuaciones pueden dar lugar a una proteína extensiva despliegue, agregación y muerte celular. Por lo tanto, las células han desarrollado una red dinámica y estrés específico de chaperonas moleculares, que mantener un "sano" proteoma durante condiciones de estrés. Acompañantes independientes de ATP constituyen una importante clase de chaperonas moleculares, que sirven como moléculas de defensa de primera línea, protegiendo contra la agregación de proteínas en una forma dependiente de la tensión. Una característica de que estos acompañantes tienen en común es su capacidad para utilizar la plasticidad estructural para su activación específica de estrés, el reconocimiento y la versión del cliente mal plegado.

En este artículo, nos centramos en el análisis funcional y estructural de un tal acompañante intrínsecamente desordenada, la Hsp33 bacteriana regulada de redox, que protege a las proteínas contra la agregación durante el estrés oxidativo. Aquí, presentamos una caja de herramientas de diversas técnicas para estudiar la actividad de regulación redox acompañante, así como para el mapeo de cambios conformacionales de la acompañante, subyacente a su actividad. Específicamente, se describe un flujo de trabajo que incluye la preparación de proteínas completamente reducidas y completamente oxidadas, seguido de un análisis de chaperone actividad contra la agregación en vitro usando dispersión de luz, centrándose en el grado de la actividad contra la agregación y su cinética. Para superar los frecuentes afloramientos acumuladas durante ensayos de agregación, describimos el uso de Kfits, una nueva herramienta gráfica que permite el fácil procesamiento de medidas cinéticas. Esta herramienta se puede aplicar fácilmente a otros tipos de medidas cinéticas para eliminación de outliers y parámetros cinéticos. Para correlacionar la función con la estructura de la proteína, se describen la configuración y el flujo de trabajo de una técnica estructural espectrometría de masas, espectrometría de masas de intercambio hidrógeno-deuterio, que permite el mapeo de cambios conformacionales en la acompañante y sustrato durante las diferentes etapas de la actividad de la Hsp33. La misma metodología se puede aplicar a otras interacciones proteína-proteína y proteína-ligando.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células con frecuencia encuentran una acumulación de especies reactivas del oxígeno (ROS), producidas como subproductos de la respiración1,2, proteína, lípido oxidación3,4y procesos adicionales5, 6,7. A pesar del papel beneficioso de ROS en diversos procesos biológicos como celular8,9 y respuesta inmune10de señalización, un desequilibrio entre la producción de ROS y su desintoxicación puede ocurrir, lleva a oxidativo estrés7. Los objetivos biológicos de ROS son las proteínas, lípidos y ácidos nucleicos, la oxidación de las cuales afectan su estructura y función. Por lo tanto, la acumulación de oxidantes celulares está fuertemente vinculada a una amplia gama de patologías como cáncer9,11, inflamación12,13y envejecimiento14, 15y se han encontrado para ser implicado en la aparición y progresión de enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, Parkinson y ALS enfermedad16,17,18.

Las proteínas recién sintetizadas y maduras son muy sensibles a la oxidación debido a las modificaciones potencialmente peligrosas de sus cadenas laterales, que forman la proteína estructura y función19,20. Por lo tanto, el estrés oxidativo conduce generalmente a una inactivación de la proteína generalizada, mal plegamiento y agregación, llevando eventualmente a la muerte celular. Una de las estrategias celulares elegante para hacer frente a los daños potenciales de oxidación de proteínas es utilizar acompañantes redox-dependientes, que inhiben la agregación de proteína generalizada, en vez de formar complejos estables con las proteínas mal plegadas cliente21 ,22,23. Estos acompañantes de primera línea de defensa se activan rápidamente por una oxidación específica (generalmente en residuos de cisteína) que se convierte en potente de la agregación de moléculas24. Puesto que el estrés oxidativo resulta en la inhibición de la respiración y disminuye en los de niveles de ATP celular25, canónicos acompañantes dependientes de ATP son menos eficaces durante el estrés oxidativo condiciones25,26 ,27. Por lo tanto, acompañantes independientes de ATP redox-activa juegan un papel vital en mantener homeostasis de proteínas sobre la acumulación de oxidantes en bacterias y eucariotas (por ejemplo, Hsp3328 y RidA29 en bacterias, Get330 en la levadura, peroxirredoxinas31 en eucariotas). La actividad de estos acompañantes depende fuertemente reversibles estructurales cambios conformacionales inducidos por una oxidación específica que destapa hidrofóbicas regiones implicadas en el reconocimiento de las proteínas mal plegadas del cliente.

Investigación del mecanismo de la agregación y los principios que rigen el reconocimiento de las proteínas del cliente por acompañantes no es fácil debido a la naturaleza dinámica y heterogénea de sustrato acompañante interacciones32,33, 34,35,36,37. Sin embargo, acompañantes regulados por el estrés tienen una oportunidad para avanzar en nuestra comprensión de la función de la agregación debido a su capacidad para: 1) obtener de dos formas diferentes de la acompañante, activo (p. ej., oxidada) e inactivos (por ejemplo, reducido), con la introducción o eliminación de una condición de estrés fácilmente cambiar entre ellos (p. ej., oxidante y reductor), 2) tiene una amplia gama de sustratos, 3) forman complejos muy estables con las proteínas de cliente que pueden ser evaluadas por diferentes metodologías estructurales y 4) se centran exclusivamente en el reconocimiento de sustrato y liberación, mediada por cambios conformacionales redox-dependientes, como la mayoría de estos acompañantes carece de la capacidad de plegado.

Aquí, analizamos la actividad contra la agregación de la bacteriana acompañante regulación redox de la Hsp33, un componente vital de los sistemas de defensa bacteriana contra la oxidación inducida por la proteína agregación28. Cuando reduce, la Hsp33 es una proteína de unión a zinc firmemente doblada sin actividad de acompañante; sin embargo, cuando se exponen al estrés oxidativo, Hsp33 sufre cambios conformacionales extensos que exponen su sustrato Unión regiones38,39. A la oxidación, el ion de zinc que está fuertemente enlazado a cuatro residuos de cisteína altamente conservados del dominio c-terminal es lanzado40. Esto resulta en la formación de enlaces de disulfuro dos, un despliegue de dominio C-terminal y una desestabilización de la región adyacente vinculador del41. Las regiones c-terminal y linker son altamente flexibles y se definen como intrínsecamente o parcialmente desordenado. Regreso a condiciones de estrés no, quedar reducidos las cisteínas y el acompañante vuelve a su estado doblado nativo sin actividad contra la agregación. El refolding de la acompañante conduce a un mayor despliegue y desestabilización de la proteína de clientes consolidados, que desencadena su transferencia al sistema canónicas acompañante, DnaK/J, para repliegue38. Análisis de sitios de interacción de Hsp33 sugiere que Hsp33 usos tanto desordenado su cargada regiones así como las regiones hidrofóbicas en el vinculador y el dominio N-terminal para capturar mal proteínas de cliente y evitar su agregación38, 42. en el estado doblado, estas regiones están ocultos por el vinculador doblado y el dominio C-terminal. Curiosamente, la región de linker sirve como guardián de estado plegado e inactivo de Hsp33 "sensing" el estado plegado de su lado de dominio C-terminal34. Una vez desestabilizado por mutagénesis (ya sea por una mutación de punto o una perturbación de la secuencia completa), Hsp33 se convierte en un acompañante constitutivamente activo independientemente el estado redox de sus cisteínas redox-sensibles43.

Los protocolos presentados aquí permiten monitoreo de actividad redox dependiente acompañante de Hsp33, así como cambios conformacionales mapeo sobre la activación y Unión de proteínas del cliente. Esta metodología se puede adaptar a investigación otros modelos de reconocimiento de acompañante del cliente así como las interacciones proteína-proteína de acompañante no. Por otra parte, se presentan los protocolos para la preparación de acompañantes totalmente reducidas y oxidadas que pueden utilizarse en estudios de otras proteínas redox-switch, para revelar el papel potencial de la oxidación de la proteína sobre la actividad de la proteína.

Específicamente, se describe un procedimiento para monitorear actividad chaperona en vitro y definir su especificidad de sustrato bajo diferentes tipos de agregación de la proteína (químicamente o térmicamente inducida) con dispersión de la luz (LS) medida por un fluorospectrometer44. Durante la agregación, dispersión de luz en 360 nm aumenta rápidamente debido a la creciente turbiedad. Por lo tanto, la agregación puede ser monitoreada en forma dependiente del tiempo en esta longitud de onda. LS es un método rápido y sensible para las pruebas de agregación de la proteína y, por tanto, la actividad contra la agregación de una proteína de interés usando concentraciones nanomolares, lo que permite la caracterización de los parámetros cinéticos relacionados con la agregación de proteína bajo diferentes condiciones. Además, el protocolo de LS descrito aquí no requiere la instrumentación costosa y puede establecerse fácilmente en cualquier laboratorio.

Sin embargo, es muy difícil obtener curvas cinéticas "limpio" y obtener parámetros cinéticos de la proteína de tal luz dispersión de experimentos, debido al ruido y la gran cantidad de afloramientos generada por las burbujas de aire y los grandes agregados. Para superar este obstáculo, presentamos una nueva herramienta gráfica, Kfits45, utilizada para reducir niveles de ruido en diferentes medidas cinéticas, equipados específicamente para datos cinéticos de la agregación de proteínas. Este software proporciona parámetros cinéticos preliminares para una primera evaluación de los resultados y le permite "limpiar" grandes cantidades de datos rápidamente sin afectar sus propiedades cinéticas. Kfits es implementado en Python y está disponible en código abierto a 45.

Una de las preguntas difíciles en el campo se refiere a la asignación de sitios de interacción entre acompañantes y sus proteínas de cliente y entender cómo acompañantes reconocen una amplia gama de sustratos mal plegadas. Esta pregunta es más complicada cuando el estudio de complejos de proteína altamente dinámicos que implican intrínsecamente desordenada acompañantes y propensas a la agregación de sustratos. Afortunadamente, espectrometría de masas estructural ha avanzado considerablemente en la última década y ha proporcionado con éxito enfoques útiles y herramientas para analizar la plasticidad estructural y mapa de residuos implicados en el reconocimiento de la proteína46, 47 , 48 , 49., presentamos aquí un tal cambio de técnica-hidrógeno-deuterio espectrometría de masas (HDX-MS)-que permite el mapeo de cambios del nivel del residuo en una conformación estructural sobre modificación de la proteína o proteína/ligando vinculante35, 50,51,52,53,54,55. HDX-MS utiliza el intercambio continuo de hidrógenos de la columna vertebral por deuterio, la tasa de que se ve afectada por el ambiente químico, accesibilidad, y covalentes y no covalentes56. HDX-MS pistas de estos procesos de cambio utilizando un disolvente deuterado, comúnmente agua pesada (D2O) y permite la medición basada en el cambio de peso molecular tras el hidrógeno al intercambio de deuterio. Más lenta tasa de intercambio hidrógeno-deuterio puede resultar de hidrógenos participar en enlaces de hidrógeno o, simplemente, de impedimento estérico, que indica los cambios locales en estructura57. Cambios a un ligando o modificaciones post-traduccionales también pueden conducir a diferencias en el entorno de hidrógeno, con un enlace lo que resulta en diferencias en el hidrógeno-deuterio intercambio (HDX) tarifas46,53.

Hemos aplicado esta tecnología a las regiones 1) mapa Hsp33 que rápidamente desarrollan sobre oxidación, conduciendo a la activación de la Hsp33 y 2) definen la interfaz de enlace potencial de la Hsp33 con su cuerpo entero sustrato mal plegada, citrato sintetasa (CS)38.

Los métodos descritos en este manuscrito pueden aplicarse para estudiar funciones redox-dependientes de las proteínas en vitro, definiendo la actividad contra la agregación y la función de los cambios estructurales (si cualquiera) en función de la proteína. Estas metodologías pueden ser fácilmente adaptadas a diversos sistemas biológicos y aplicadas en el laboratorio.

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Protocolo

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1. preparación de proteínas completamente reducidas y oxidadas completamente

  1. Preparación de una proteína totalmente reducida
    Nota: Aquí, describimos la reducción de una proteína que contiene zinc y vivencias2 solución para restaurar el estado del Zn incorporado, reducción de la proteína. La solución2 de vivencias puede reemplazar o desechar. Tenga en cuenta que el tiempo y la temperatura del proceso de reducción depende de la estabilidad de la proteína y la función y así es específicos por proteína.
    1. Descongelar la muestra de proteína en el hielo y girar hacia abajo para eliminar agregados. Incubar la muestra durante al menos 1,5 h a 37 ° C con 5 mM DTT y de vivencias de 20 μm2 (hasta el 70% de concentración de la proteína).
      Nota: La temperatura en este paso es dependiente de la proteína y debe ajustarse a la estabilidad de la proteína.
    2. Quite el TDT utilizando columnas de desalación.
      Nota: Hay diferentes columnas disponibles de la desalación. El protocolo que a continuación describe el procedimiento utilizando columnas desalación específicos (véase Tabla de materiales). Antes de usar otras columnas desalación, recomendamos examinar la eficiencia de TDT retiro y proteína la recuperación, ya que algunas columnas desalación pueden absorber parcialmente la proteína de interés.
      1. Equilibrar la columna con un tampón de fosfato (KPi) de potasio (40 mM, pH 7.5), llenar completamente la columna con el buffer y permitiendo que el búfer de gotear. Repita este proceso 2 x.
      2. Retire el filtro de disco blanco en la columna suavemente empujando hacia abajo con una pinza y retirar es más fácil de quitar cuando se llena la columna con el buffer de KPi. Rellenar la columna con tampón de KPi y centrifugar a 1.000 x g durante 3 minutos.
      3. Transfiera la columna a un tubo limpio, añadir lentamente la muestra de proteína en el medio de la columna y centrifugar a 1.000 x g durante 2 minutos. La proteína libre de TDT está ahora en el flujo a través.
    3. Compruebe sus concentraciones (por ejemplo, usar un espectrómetro de UV/Vis) y medir su absorbancia a 280 nm. Calcular la concentración de proteína usando la ley de Beer.
    4. Distribuir la mitad de las muestras de proteína en alícuotas. Incubar las alícuotas en condiciones anaerobias (por ejemplo, una cámara de anaerobios) durante 20 min para un retiro completo de oxígeno. Sellar los tubos con la película plástica y almacenar las muestras a-20 ° C o -80 ° C, dependiendo de la proteína.
      Nota: En lugar de utilizar la cámara anaerobia, los tubos también pueden ser flasheados con gas de argón a quitar el oxígeno.
  2. Preparación de una proteína completamente oxidada
    Nota: Se recomienda para preparar muestras de proteína oxidada de proteínas totalmente reducidas (descritas anteriormente). Esto reduce la heterogeneidad en los Estados de oxidación de las cisteínas. Es posible utilizar diferentes reactivos oxidantes; aquí, nos estamos centrando en peróxido de hidrógeno (H2O2).
    PRECAUCIÓN: Evitar la oxidación excesiva como puede conducir a indeseables disulfuro intramolecular y oxidación irreversible de diferentes aminoácidos, como cisteína, metionina, tirosina y otros.
    1. A la muestra de proteína restante, agregar 5 mM H2O2 (recién diluido) e incubar durante 3 h a 40 ° C agitando.
      Nota: La temperatura en este paso es dependiente de la proteína y debe ajustarse a la estabilidad de la proteína.
    2. Equilibrar la columna con tampón de KPi (40 mM, pH 7.5), llenar completamente la columna con el buffer y permitiendo que el búfer de gotear. Repita este proceso 2 x.
    3. Retire el filtro de disco blanco en la columna suavemente empujando hacia abajo con una pinza y retirar es más fácil de quitar cuando se llena la columna con el buffer de KPi.
    4. Rellenar la columna con tampón de KPi y centrifugar a 1.000 x g durante 3 minutos.
    5. Transfiera la columna a un tubo limpio, añadir lentamente la muestra de proteína oxidada a la media de la columna y centrifugar a 1.000 x g durante 2 min; la proteína oxidada está ahora en el flujo a través.
    6. Comprobar las concentraciones de proteínas como en el paso 1.2.5, divida las proteínas oxidadas en alícuotas y almacenar a-20 ° C o -80 ° C, dependiente de la proteína.

2. luz de dispersión análisis de agregación

Nota: Todas las concentraciones en este ensayo son acompañante y substrato-específica y deben ser calibradas. Todas las memorias intermedias deben 0.22 μm filtrado, ya que es extremadamente importante que los amortiguadores son libres de partículas o burbujas de aire y las cubetas estén limpias y libres de polvo. Es muy importante utilizar un agitador en la cubeta de cuarzo. Compruebe agitador diferentes tamaños y formas para asegurar una mezcla eficiente de la solución completa sin producir burbujas indeseables. Por otra parte, existen flouorospectrometers diferentes en laboratorios e instalaciones. Aquí, un fluorospectrometer específico (véase Tabla de materiales) fue utilizado. Diferentes instrumentos tienen una diversa sensibilidad, velocidad de medición y parámetros del muestreador. Por lo tanto, los parámetros de medición exacta (por ejemplo, ancho de banda de emisión y excitación, sensibilidad y otros) deben ser optimizados usando una proteína conocida agregación-propenso y sus correspondientes condiciones. Es recomendable utilizar citrato sintasa (CS) o la luciferasa como sustratos iniciales en concentraciones nanomolares.

  1. Ensayo de agregación química
    1. Preparar el sustrato desnaturalizado por incubación 12 μm CS durante la noche en 40 mM HEPES (pH 7,5) y 4,5 M GdnCl. Para preservar el pH, disolver el GdnCl en el 40 mM HEPES (pH 7.5).
    2. Abra el software de fluorospectrometer y vaya a medida del tiempo de curso. Establecer los parámetros: temperatura: 25 ° C; Λem: 360; Ancho de banda em: 5 nm; Λex: 360; Ex banda: 2.5 nm; y el intervalo de datos: 0.5 s.
    3. Preparar la muestra por adición de 1.600 μl de 40 mM HEPES a una cubeta de cuarzo. Insertar la cubeta en el portamuestras y dejar que la muestra alcance la temperatura deseada.
    4. La agitación ha fijado en 600 rpm y comenzar la medición hasta que se establezca una línea de base. Mantenga la agitación para la medida toda.
    5. Para medir la agregación de CS en la ausencia de un acompañante, 120 s en la medición, añadir (suavemente, pero rápidamente) 10 μl de CS desnaturalizada (concentración final de 75 nM). Continuar la medición para 1.200 s.
    6. Para medir la agregación de CS en la Hsp33, presencia en 60 s en la medición, añadir Hsp33 (concentración final de 300 nM). Después de un adicional 60 s, añadir 10 μl de CS desnaturalizada (concentración final de 75 nM). Continuar la medición para 1.200 s.
      Nota: Al agregar el sustrato o acompañante, para evitar la inserción de burbujas, utilice una pipeta de 10 μl.
  2. Análisis térmico de la agregación
    Nota: La temperatura para el análisis de agregación térmica depende de la estabilidad de la proteína y debe ajustarse independientemente para cada proteína.
    1. Abra el software de fluorospectrometer y vaya a medida del tiempo de curso. Definir los parámetros siguientes: temperatura: 43 ° C; Λem: 360; Ancho de banda de emisión: 5 nm; Λex: 360; Ancho de banda de excitación: 2.5 nm; y el intervalo de datos: 0.5 s.
    2. Preparar la muestra por adición de 1.600 μl de precalentado 40 mM HEPES a una cubeta de cuarzo. Insertar la cubeta en el portamuestras y dejar que la muestra llega a 43 ° C.
    3. La agitación ha fijado en 600 rpm y comenzar la medición hasta que se establezca una línea de base. Mantenga la agitación para la medida toda.
    4. Para medir la agregación de CS en la ausencia de un acompañante, a 120 s en la medición, añadir suavemente CS (concentración final de 125 nM) y de medición para 1.200 s.
    5. Para medir la agregación de CS en la Hsp33, presencia en 60 s en la medición, añadir Hsp33 (concentración final de 600 nM). Después de un adicional 60 s, añadir CS (concentración final de 125 nM). Continuar la medición para 1.200 s.
      Nota: Al agregar el sustrato o acompañante, evitar la inserción de burbujas.
  3. Eliminación de ruido y análisis de datos por Kfits
    Nota: Kfits está disponible en el uso de Kfits se ha descrito previamente en Rimon et al. 45
    1. Subir el archivo de datos.
      Nota: La entrada es el crudo resultado de medidas de dispersión de la luz en un formato texto separados por comas o delimitado por tabuladores.
    2. Para eliminar cualquier ruido, elija parámetros de análisis. Uso automático modelo mejor (recomendado), marque la bandera de ruido está siempre por encima de la señal .
    3. Quitar manualmente afloramientos obvios las líneas verde y roja ajustable; Este paso filtro el ruido por encima de la línea verde y por debajo de la línea roja.
    4. Establecer la línea base y la curva de ajuste. Después de aplicar el umbral de ruido, descarga los datos procesados.

3. hidrógeno-deuterio intercambio espectrometría de masas

  1. Preparación de buffers y muestras de proteína (complejo Hsp33 y Hsp33-CS)
    1. Diluir las muestras de proteína a una concentración final de 1 mg/mL en tampón de 25 mM Tris-HCl pH 7.5 y transferirlos a frascos de 1,5 mL.
    2. Preparar sustrato de proteína muestras complejas por incubación Hsp33 CS en una proporción de 1: 1.5 a 43 ° C.
      1. Añadir CS de forma escalonada para evitar cualquier agregación rápida y asegurar una Unión fructífera entre la Hsp33 y CS térmicamente desplegado.
      2. Al menos cuatro pasos (es decir, cada vez que añada una cuarta parte del volumen final) e incubar las muestras durante 15 min después de cada adición para permitir la protección de CS por Hsp33.
    3. Retire cualquier agregados mediante una centrifugación de 30 min a 16.000 x g a 4 ° C.
      Nota: Los nuevos complejos de la proteína sustrato deben ser preparados fresco. Adición de sustrato debe hacerse gradualmente; de lo contrario, se producirá la agregación. Concentraciones de sustrato, temperatura y sustrato son específicos de proteína.
    4. Preparar un tampón H (25 mM Tris-HCl, pH 7,5), que sirve como control del grado de deuteración, y un buffer D (25 mM Tris-DCl, pH 7,09), que es el buffer de deuteración. También preparar un buffer Temple fresco (150 mM TCEP, 3 M GdnCl, 0.1% de ácido fórmico).
      Nota: El búfer de amortiguamiento debe ser optimizado para la proteína de interés con el fin de obtener la cobertura máxima de la secuencia después de la digestión de la pepsina.
    5. Transferir todos los búferes y muestras en los frascos y colocarlos en bandejas adecuadas. Mantenga almacenadores intermediarios H y D a 25 ° C (bandeja de 25 ° C); por otro lado, mantenga las muestras y el amortiguamiento buffer en 0 - 2 ° C (0 ° C la bandeja). Coloque las muestras en insertos de vidrio 150 μL (véase la Tabla de materiales) primero y luego transferirlos a frascos.
  2. Preparación del instrumento
    Nota: El espectrómetro de masas viene con dos programas de acompañamiento: uno controla las bombas y el otro controla el espectrómetro de masas (consulte la Tabla de materiales). Se describen los pasos utilizando estos dos programas de software.
    1. Encienda manualmente todas las unidades de refrigeración. Una vez que todos los sistemas de enfriamiento alcanzan su temperatura de destino, cambiar manualmente en la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y bombas de carga.
      Nota: En nuestro caso, estos consisten en dos baños de enfriamiento y una nevera (que contiene la trampa y columnas analíticas). Una unidad de refrigeración enfría la bandeja a 0 ° C, mientras que el otro mantiene la bandeja a 25 ° C; la temperatura de la nevera es de 1-2 ° C.
    2. Abrir el software que controla tanto las bombas, así como el software que controla el espectrómetro de masas; Asegúrese de que MS está en espera.
    3. Desconecte la válvula de salida HPLC el MS y lave el sistema primero con una solución de "triple limpiador" (1% de ácido fórmico, 33% acetonitrilo, isopropanol al 33%, 33% de metanol), luego con buffer B (80% de acetonitrilo, 0.1% de ácido fórmico) y finalmente con tampón (0.1% el ácido fórmico, pH 2.25) y luego inserte la columna de pepsina en el sistema. Si cambio de amortiguadores, asegúrese de purgar dos bombas antes de proceder.
    4. Asegúrese de que el caudal de ambas bombas es 0.1 mL/min y la presión es estable.
    5. Después de lavar el sistema con un caudal constante y presión constante, inserte el enchufe HPLC en la fuente MS y activar el MS.
  3. Parámetros de espectrómetro de masas
    1. Establecer la ionización del péptido a la ionización por electrospray (ESI) a 175 ° C, el caudal de gas de vaina a los 17, el resplandor del gas auxiliar en 2 y la tensión de aerosol en 4.5 kV (figura 1 complementaria).
    2. Configurar los parámetros como sigue para las muestras no deuterados.
      1. Configurar los parámetros: rango de análisis m/z 300-1500; Resolución a 70.000; Objetivo de control automático de ganancia (AGC) a 106; y el máximo tiempo de la inyección (es) en ms de 100.
        Nota: Los 5 iones más intensos con los Estados de carga entre + 2 y + 6 (su intensidad mayor de 1.3 x 104) y una ventana dinámica de 30 en será aislada.
      2. Realizar la fragmentación de iones por la disociación colisión de energía más alta (HCD) en la celda de colisión múltiple con energía de la colisión normalizado (NCE) igual a 28. Detectar iones fragmento por tándem MS con una resolución de 35.000, objetivo AGC de 105, máximo en 60 ms y una ventana de aislamiento de 2.0 m/z.
    3. Para las muestras deuteradas, utilizar el MS1 solamente con una resolución mayor de 140.000 y con parámetros similares.
  4. Ejecutar el experimento
    1. Configurar las bandejas de la siguiente manera.
      1. Colocar tampón H y D en la bandeja de 25 ° C, luego coloque las muestras y el amortiguamiento buffer en la bandeja de 0 ° C.
      2. X lugar vacío viales, alineados en ambas bandejas, donde X = el número de muestras x el número de puntos del tiempo.
        Nota: En la bandeja de 25 ° C, los frascos vacíos sirven como viales de reacción, y en la bandeja de 0 ° C, que sirven como amortiguamiento de viales.
      3. Cada uno de los frascos de vacíos contiene un inserto de vidrio vacía; Deseche y reemplace dicho entre experimentos.
        Nota: Para ejecutar el experimento HDX de la manera más eficiente y menos desperdiciador de tiempo, un software que permite que las muestras a ser simultáneamente (figura 2 complementaria) fue utilizado. Se describen los pasos utilizando este software.
    2. Abrir el software. Configurar los parámetros del programa para realizar lo siguiente.
      1. Incubar cada muestra (5 μl) con 45 μl de tampón de D durante varios minutos, dependiendo de los puntos de tiempo seleccionados (p. ej., 1, 3, 18, 40 y 100 min) a 25 ° C. Incubar la muestra no deuterados con 45 μl de tampón de H en su lugar.
      2. Inmediatamente después de la incubación, mezcle 50 μl de proteína deuterada en 50 μl de tampón de amortiguamiento helada e inyectar en una columna de pepsina inmovilizados (20 mm de longitud, 2,0 mm de diámetro).
      3. Eluir cualquier péptidos de la columna de la pepsina en la precolumna de lavado con tampón A 6 minutos a una velocidad de 50 μl/min mantenga la memoria del A la caja de enfriamiento a 0 ° C.
      4. Eluir los péptidos de la columna anterior en la columna analítica de C18 (columna C18, 130 Å, 1,7 μm, 2,1 mm x 50 mm, a 0 ° C) y separarlos mediante la aplicación de un gradiente lineal de acetonitrilo en 100 μl/min Run el gradiente de acetonitrilo usando acetonitrilo 100% buffer B : min 7 a 2%, 7 min 10-30%, 2,5 min a 30-90%, 1,5 min al 90%, gradiente rápido durante 1 min a 90-8% y finalmente equilibrar la columna por 4 min a 2%.
    3. Construir una secuencia de corriente (véase suplementario figura 2): entrar en todos los puntos del tiempo, muestra nombres y localizaciones en las bandejas, así como los nombres de búfer y ubicaciones.
      Nota: El software permite la alineación de todos los tiempos de ejecución diferentes en un programa que corre varias muestras a la vez, eficiente disminuir tiempos en marcha.
  5. Análisis de datos
    Nota: Trabajamos con varios programas de software en el proceso de análisis de datos, como Descubridor del proteoma y MaxQuant (software libre) para la identificación de péptidos y análisis de cobertura de secuencia, así como Banco de trabajo HDX, una software libre que permite el análisis de la incorporación de deuterio en las proteínas y una comparación de las tasas HDX entre diferentes conjuntos de experimentos. Se describen los pasos utilizando estos programas.
    1. Analizar la cobertura del péptido de la muestra mediante la ejecución de las muestras control no deuterados a través del software (suplementario figura 3). Configurar el software usando los siguientes parámetros.
      1. Utilice el método Sequest HT con un No-enzimática (inespecíficas) cleave. La búsqueda de péptidos de aminoácidos 4-144, con una tolerancia total de 7 ppm y de 0,5 para el precursor ion y fragmento. Permitir una oxidación de la metionina dinámico.
      2. Crear una base de datos de la proteína, a través del cual el software puede determinar la cobertura del péptido. Exportación de los péptidos identificados en formato textual.
    2. Analizar los resultados deuterados usando el HDX workbench software libre58.
      1. Abra el editor de proteína y definir la proteína insertando el archivo de cobertura de secuencia y péptidos de proteína.
      2. A continuación, abra el editor de configuración del experimento a mago y entrar en todos los insumos solicitados.
        Nota: El programa requiere el número de muestras, el número de puntos del tiempo, el número de repeticiones, el valor de pH de los buffers y la temperatura.
      3. Finalmente, de entrada los parámetros en relación con el espectrómetro de masas utilizado, después de lo cual el programa genera una lista de péptidos detectados.
        Nota: El software detecta los péptidos "HDX" inspecciona racimos de isótopo y demuestra una clara visualización de deuteración en las muestras.
  6. Presentación de los datos
    1. Las regiones con una absorción de deuteración deferente en la estructura utilizando el software PyMol o cualquier otro software de visualización de la etiqueta.
    2. Presentar los niveles de absorción de deuterio en lugar de los valores del factor B.
      Nota: Un tutorial básico puede encontrarse en https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners.

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Resultados

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Los dos métodos presentados hacen posible seguir la actividad cinética y dinámica de las interacciones de proteínas entre el acompañante y su sustrato. Por otra parte, el protocolo de reducción-oxidación permite la preparación de una acompañante totalmente reducido y completamente oxidado, dando un entendimiento más profundo del mecanismo de activación de redox-dependientes acompañantes desordenados.

En primer lugar, hemos utili...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este trabajo, nos proporciona protocolos para el análisis de la actividad de acompañante de redox-dependientes y la caracterización de los cambios estructurales en la Unión de una proteína de cliente. Estas son metodologías complementarias para definir posibles complejos de sustrato acompañante y analizar posibles sitios de interacción.

Aquí, hemos aplicado estos protocolos para la caracterización de un complejo entre el acompañante regulación redox Hsp33 con un sustrato de acompañante muy ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores están agradecidos a Meytal Radzinski para sus discusiones útiles y crítica de la lectura del artículo y a Patrick Griffin y los miembros de su laboratorio por su ilimitada ayuda estableciendo la plataforma de análisis HDX. Los autores agradecemos a la Fundación alemana-Israel (I-2332-1149.9/2012), la Fundación binacional de ciencia (2015056), la beca de integración de Marie Curie (618806), la Fundación de Ciencias de Israel (1765/13 y 2629/16) y la ciencia humana de la frontera Programa (CDA00064/2014) por su apoyo financiero.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Chemicals, Reactivos
HPLC plusSigma Aldrich34998-2.5L
solvente Ácido fórmico Optima LC/MSFisher ChemicalsA117-50solvente
Alcohol isopropílico, grado HPLCFisher ChemicalsP750717solvente
MetanolFisher ChemicalsA456-212disolvente
Tris(hidroximetil)aminometanoTampón252859 Sigma Aldrich
Ácido trifluoroacéticoSigma Aldrich76-05-1disolvente
Agua para HPLCSigma Aldrich270733-2.5L-Mdisolvente
ZnCl2, cloruro de zincMerckB0755416 308reactivo
DTTgoldbio27565-41-9agente reductor
PD mini trampa G-25 columnas GE healthcareGE healthcare29-9180-07columna de desalinización
Fosfato de potasioEstados Unidos Biochemical Corporation20274tampón
Peróxido de hidrógeno 30%MerckK46809910526agente oxidante
citrato sintasasigma aldrichC3260sustrato
HEPES libre de ácidosigma aldrich7365-45-9tampón
Gndclsigma aldrichG3272-500Gdesnaturalizante
de cloruro de deuteriosigma aldrich543047-10Gtampón
de óxido de deuterio 99%sigma aldrich151882-100Gdisolvente
TCEPbioworld42000058-2agente
reductorMicro-inserto de 150uL con interior de mandril & Pies de polímero, 29 * 5 mmLa-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm rosca, 11.6 * 32mmLa-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
cubeta de cuarzoHellma 101-QS
strong>Instruments
Jasco FP-8500 FluorospectrómetroJasco
Thermomixer ComfortEppendorf13058/0
Heraeus Megafuge 16R, mesa de sobremesaCentrífugaThermo Scientific
Medidor de pH, PB-11 sartoriusSartorius13119/0
AffiPro Columna de pepsina inmovilizada (20 mm de longitud, 2,0 mm de diámetro).Precolumna AffiPro
Waters (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm)Columna analítica Waters
C18 (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm)
Cámara anaeróbica de vinilo con puerta AirlockCoy
Q-exactive-orbitrap espectrómetro de masasThermo-Fischer Sistema
PAL científico LHX - sistema robótico para el manejo de muestras HDXSistema PALhttps://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, bomba XRSThermo Scientific
Bomba auxiliar Dionex AXP-MSThermo Scientific
Software, Herramientas de software, Búsqueda en bases de datos
Kfits: Ajuste de datos de agregaciónhttp://kfits.reichmannlab.com/fitter/
software Thermo Scientific Xcaliburhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune)https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Software Chronos (Axel Semrau)http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
software Proteome Discoverer V1.4https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
software de banco de trabajo HDX http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html
suplemento solución <

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