Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D In Vitro modelo sistemas inducen formación de glóbulo esferoide

Resumen

Hemos desarrollado un modelo de cáncer de mama heterogéneos consistiendo en las células fibroblastos y tumor inmortalizadas encajadas un bioink de alginato/gelatina de bioprintable. El modelo recoge el microambiente tumoral de en vivo y facilita la formación de esferoides multicelulares tumor, dando la penetración en los mecanismos de conducción tumorigenesis.

Resumen

La heterogeneidad celular, bioquímica y Biofísica del microambiente tumoral nativo no es recapitulada por creciente líneas celulares de cáncer inmortalizadas mediante cultivo celular (2D) bidimensional convencional. Estos retos pueden superarse mediante técnicas de bioprinting para construir modelos de tumor heterogéneo de (3D) tridimensional por el que se encajan los diferentes tipos de células. Alginato y la gelatina son dos de los biomateriales más comunes empleados en bioprinting debido a su biocompatibilidad, biomimética y propiedades mecánicas. Mediante la combinación de dos polímeros, logramos un hidrogel compuesto de bioprintable con similitudes a la arquitectura microscópica de un tejido conectador tumoral nativo. Estudiamos la imprimibilidad de hidrogel compuesto por reología y obtiene la ventana de impresión óptima. Fibroblastos y las células de cáncer de mama fueron incrustados en los hidrogeles e impreso para formar un modelo 3D que mímico el microambiente en vivo . El modelo heterogéneo de bioprinted alcanza una alta viabilidad de cultivos celulares a largo plazo (> 30 días) y promueve el automontaje de las células de cáncer de mama en esferoides multicelulares tumor (MCTS). Se observan la migración y la interacción de las células de fibroblastos asociada al cáncer (CAF) con el MCTS en este modelo. Mediante el uso de plataformas de la cultura de célula bioprinted como sistemas de co-cultivo, ofrece una herramienta única para estudiar la dependencia de tumorigénesis de la composición del estroma. Esta técnica cuenta con un alto rendimiento, bajo costo y alta reproducibilidad, y también puede proporcionar un modelo alternativo a los cultivos de monocapa de celulares convencionales y modelos animales de tumor para el estudio de la biología del cáncer.

Introducción

Aunque cultivo celular 2D es ampliamente utilizado en la investigación del cáncer, existen limitaciones como se cultivan las células en forma de monocapa con una concentración uniforme de nutrientes y oxígeno. Estas culturas carecen de importante célula-célula y las interacciones célula-matriz presentan en el microambiente del tumor nativo (TME). En consecuencia, estos modelos mal recapitulan las condiciones fisiológicas, lo que resulta en comportamientos aberrantes de la célula, incluyendo morfologías antinaturales, organización irregular del receptor, polarización de la membrana y expresión de genes anormales, entre otros condiciones^1,

Protocolo

1. preparación de los materiales, hidrogel y materiales de la cultura de célula

1. Preparación de material y la solución
   1. Lavar y secar 250 mL y vasos de precipitado de 100 mL vidrio, agitadores magnéticos, espátulas, cartuchos de 10 mL, boquillas cilíndricas 25 G (0.5 en) y un diámetro interno de 250 μm. Esterilice en autoclave los los materiales ellos a 121 ° C/15 min/1 ATM no los materiales bajo condiciones estériles hasta su uso.
      Nota: Consulte la Tabla de materiales para la información del vendedor.
   2. Pesar 3 g de alginato (3% w/v) y 7 g de gelatina (7% w/v) (denotado como A3G7 en adelante).

Resultados

El barrido de temperatura muestra una clara diferencia del precursor del A3G7 a 25 ° C y 37 ° C. El precursor es líquido a 37 ° C y tiene una viscosidad compleja de 1938.1 mPa ± 84,0 x s, que es validado por un G mayor "sobre G'. A medida que la temperatura disminuye, el precursor somete a congelación física debido al enredo físico espontáneo de las moléculas de gelatina en un tri-helix formación^29,30. Tanto el G' y el G "aumentar.......

Discusión

Estructuras cargadas de celulares pueden ser comprometidas si contaminación (biológica o química) se produce en cualquier momento del proceso. Generalmente, contaminación biológica es vista después de dos o tres días de la cultura como un color cambia en los medios de cultivo o de la estructura de bioprinted. Por lo tanto, la esterilización (desinfección física y química) es un paso clave para todos los procesos relacionados con la célula. Notable, gelatina de autoclave cambia sus propiedades gelificantes, que hizo más l.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Alginato de sodio	FMC BioPolymer	CAS-No: 9005-38-3	Protanal LF 10/60 FT
Gelatina	Sigma-Aldrich	G9391	Tipo B de piel bovina
Solución salina tamponada con fosfato de Dubelcco (DPBS 1X)	Gibco	LS14190136	1×, sin calcio, sin magnesio
Placa calefactora magnética	Corning	N/	A Agitador/placa calefactora modelo PC-420
Tubos de centrífuga de 50 mL	Corning		352098 Falcon® 50mL Tubo de centrífuga PP de alta claridad, fondo cónico,
centrífuga	GMI	N/A	Sorvall RT6000D, GMI, EE. UU.
Cloruro de calcio anhidro	Sigma-Aldrich	C1016
MilliQ agua	Millipore	N/A
Millipore 0.22 y micro; m filters	Millipore	SLGS033SB	Millex-GS Unidad de filtro de jeringa, 0.22  y micro; m, mezclas de ésteres de celulosa, 33  mm, óxido de etileno esterilizado
Reómetro de oscilación MCR 302	Anton Paar	N/A
Reómetro herramienta de medición CP25	Anton Paar	79038	Geometría de placa cónica para reómetro
RheoCompass	Anton Paar	N/A	Reómetro de control por software MCR 302
Microscopio electrónico de barrido	Hitachi N	/A	SEM, Hitachi SU-3500 Presión variable
Paraformaldehído, 96%, extra puro	Acros Organics	416785000
medio de águila modificado Dulbecco (DMEM)	Gibco	11965092
Solución antibiótica/antimicótica (100X) estabilizado	Sigma	A5955
Suero fetal bovino	Wisent Bioproducts	080-150
Matraces de cultivo celular T-75	Sigma-Aldrich CLS430641		75 cm2 Tratamiento de superficies con TC
Bioimpresora 3D BioScaffolder 3.1	GeSiM	N/A
GeSim software	GeSiM	N/A	Software de control BioScaffolder 3.1
Cartucho de 10cc resistente a los rayos UV	EFD Nordson	7012126
Tapa final	EFD Nordson 7014472
Tapa de punta	EFD Nordson
pistón	EFD Nordson	7012182
Boquilla de acero inoxidable G25	EFD Nordson	7018345
Baño de agua	VWR	N/A
Agarosa	Sigma-Aldrich	A9539	Biorreactivo, para biología molecular
Costar Placas de 6 pocillos	Corning	3516	TC Placas de pocillos múltiples, envueltas individualmente, estériles
Microscopio invertido de disco giratorio confocal	Olympus Life Science	N/A	Olympus IX83
MTS kit de ensayo	Promega	G3582	CellTiter 96® AQueous  Ensayo de proliferación celular de una solución
Kit de citotoxicidad de viabilidad viva/muerta	Sondas moleculares,ThermoFisher Scientific	L3224
Tripsina 0.25/EDTA 1X	Gibco	25200-072
Corning Placa de 96 pocillos	Corning	3595	Poliestireno transparente de fondo plano TC Microplaca, envuelta individualmente, con tapa de baja evaporación,
autoclave estéril Tuttnauer	Heidolph Brinkmann	N/A	Heidolph Tuttnauer 2540E Esterilizador de Autoclave Modelo Electrónico con 4 Bandejas de Acero Inoxidable, 23L de Capacidad
Trypan Blue	Invitrogen	T10282	Solución al 0,4%
Etanol	Alcoholes comerciales	P016EA95	Alcoholes especiales Greenfield
Incubadora 2	Panasonic	N/A	MCO 19AIC-PA
	SP Scientific	N/A	Virtis Sentry 2.0
SolidWorks	Dassault Systems	N/A	Un software CAD utilizado para construir un modelo demostrativo similar a una hélice
MATLAB	The MathWorks	N/A	Un software de programación utilizado para generar código G para BioScaffolder 3.1

estéril 7014469