Ensayo de co-inmunoprecipitación utilizando proteínas nucleares endógenas de las células cultivadas bajo condiciones hipóxicas

Resumen

Aquí se describe un protocolo de co-inmunoprecipitación para estudiar interacciones de proteínas entre las proteínas nucleares endógenas bajo condiciones hipóxicas. Este método es conveniente para la demostración de las interacciones entre los factores de transcripción reguladores Co transcripcionales a hipoxia.

Resumen

Niveles bajos de oxígeno (hipoxia) accionar una variedad de respuestas adaptativas con el factor inducible por hipoxia 1 (HIF-1) complejo actuando como regulador maestro. HIF-1 se compone de una subunidad α regulados por oxígeno de heterodiméricos (HIF-1α) y expresa constitutivamente la subunidad β (HIF-1β) también conocido como aril hidrocarburo del receptor nuclear translocador (ARNT), regulación de genes implicados en diversos procesos como angiogénesis , eritropoyesis y glucólisis. La identificación de proteínas interactuantes de HIF-1 es clave para la comprensión de la vía de señalización de la hipoxia. Además de la regulación de la estabilidad de HIF-1α, hipoxia desencadena también la translocación nuclear de los muchos factores de transcripción, incluyendo HIF-1α y ARNT. En particular, la mayoría de los métodos actuales utilizados para el estudio de tales interacciones proteína-proteína (IBP) se basa en sistemas donde los niveles de proteínas se incrementan artificialmente a través de la sobreexpresión de la proteína. Sobreexpresión de la proteína a menudo conduce a resultados no fisiológicos derivados de artefactos temporales y espaciales. Aquí describimos una co-inmunoprecipitación modificada protocolo después del tratamiento de la hipoxia con proteínas nucleares endógenas y como una prueba de concepto, para mostrar la interacción entre HIF-1α y ARNT. En el presente Protocolo, las células hipóxicas se cosecharon bajo condiciones hipóxicas y tampón de lavado de Dulbecco Phosphate-Buffered salina (DPBS) también fue previamente equilibrado a condiciones hipóxicas antes de su uso para mitigar la degradación de la proteína o complejo de la proteína disociación en reoxygenation. Además, las fracciones nucleares se extrajeron posteriormente para concentrar y estabilizar proteínas nucleares endógenas y evitar resultados falsos a menudo vistos en la sobreexpresión de la proteína. Este protocolo puede utilizarse para demostrar interacciones endógenas y nativas entre los factores de transcripción reguladores transcripcionales Co bajo condiciones hipóxicas.

Introducción

La hipoxia ocurre cuando falta oxígeno se suministra a las células y tejidos del cuerpo. Juega un papel fundamental en diversos procesos fisiológicos y patológicos como la diferenciación de la célula de vástago, inflamación y cáncer^1,2. Factores inducible por la hipoxia (HIFs) funcionan como heterodímeros, compuesto por una subunidad α regulados por el oxígeno y una subunidad β constitutivamente expresada también conocido como ARNT³. Hasta la fecha se han identificado tres isoformas de las subunidades de HIF-α (HIF-1α, 2α HIF y HIF-3α) y tres subunidades β HIF (HIF/ARNT-1β, ARNT2 y ARNT....

Protocolo

Esta sección del Protocolo, que utiliza el riñón embrionario humano 293A celular (HEK293A), s sigue las directrices del Comité de ética de investigación en la Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur.

1. inducción de hipoxia en las células HEK293A

1. Preparar cuatro platos de 10 cm y la semilla 3 – 5 x 10 células de⁶ HEK293A por plato en 10 mL Dulbecco modificado suplementado Eagle (DMEM, glucosa de 4.5 g/L) con 10% suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 110 mg/L, 100 U/mL de penicilina y 100 mg / estreptomicina de mL. Las células a 37 ° C, 5% CO₂ incubadora de la cultura.
   Nota: Cel....

Resultados

Para evaluar la respuesta celular a la hipoxia, la expresión se examinaron los niveles y la localización subcelular de los componentes de tratamiento complejo de hipoxia siguiente de HIF-1. HEK293A las células fueron cultivadas bajo condiciones hipóxicas durante 4 h o guardado en normoxia como controles. Niveles de la proteína HIF-1α y ARNT se examinaron en células completas o extractos nuclear citoplasmática por western blot. Como los niveles de HIF-1α esperados, total eran upregulated p.......

Discusión

El complejo de HIF-1 es un regulador principal de la homeostasis del oxígeno celular y regula una gran cantidad de genes implicados en diferentes respuestas de adaptación celulares a la hipoxia. Identificación de nuevas proteínas interactuantes de HIF-1 es importante para la comprensión del transduction de la señal hipóxica. Experimentos de co-inmunoprecipitación se utilizan comúnmente para los estudios de IBP para delinear vías de transducción de señal celular. Sin embargo, la sobreexpresión de la proteína sigue siendo .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
fuerte
1.0 M Tampón Tris-HCl, pH 7.4	1ª BASE	1415
Proteína A/G Perlas de Sefarosa	Abcam	ab193262
Proteína IgG natural de ratón	Abcam	ab198772
EDTA	Bio-Rad	1610729
2x Laemmli Tampón	de muestra Bio-Rad 1610737
2-Mercaptoetanol	Bio-Rad	1610710
Nitrocelulosa Membrana	Bio-Rad	1620112
Bloqueador de grado secante	Bio-Rad	1706404	Leche en polvo descremada para aplicaciones de Western Blot
10x Solución salina tamponada Tris (TBS)	Bio-Rad	1706435
10% Tween 20	Bio-Rad	1610781
10x Tris/Glycine/SDS	Bio-Rad	1610732
10x Tris/Glycine Buffer	Bio-Rad	1610771
Precision Plus Protein Patrones de color duales	Bio-Rad	1610374
Anti-conejo IgG, Anticuerpo ligado a HRP	Señalización	7074
Anti-ratón IgG, Anticuerpo ligado a HRP	Señalización celular	7076
SignalFire ECL	Reactivo Señalización celular	6883
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco	Corning	21-030-CV
Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)	Merck Millipore	52332
Anticuerpo ARNT/HIF-1 beta	Novus Biologicals	NB100-124	Concentración: 1.4 mg/mL
Anticuerpo HIF-1 alfa	Novus Biologicals	NB100-479	Concentración: 1,0 mg/mL
YY1 Anticuerpo	Novus Biologicals	NBP1-46218	Concentración: 0,2 mg/mL
Qproteome Nuclear Protein Kit	Qiagen	37582	Tampón de lisis NL y tampón de extracción NX1 se proporcionan en el kit
GAPDH Anticuerpo	Santa Cruz	sc-47724	Concentración: 0,2 mg/mL
Glicerol (≥ 99%)	Sigma	G5516
Cloruro de potasio	Sigma	P9541
Tampón RIPA	Sigma	R0278
Cloruro de sodio (NaCl)	Sigma	71376
NP-40	Sigma	127087-87-0
Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM, 4,5 g/L de glucosa)	Thermo Fisher Scientific	11995065
Ditiothreitol (DTT)	Thermo Fisher Scientific	R0861
Suero fetal bovino	Thermo Fisher Scientific	10270106
línea celular HEK293A	Thermo Fisher Scientific	R70507
Metanol	Thermo Fisher Scientific	67-56-1
Penicilina-estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122
Pierce Tabletas inhibidoras de la proteasa	Thermo Fisher Scientific	88660
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
QSP punta de carga de gel	Thermo Fisher Scientific	QSP#010-R204-Q-PK	1-200 uL
Equipment/Instrument
Thick Blot Paper, Precortado, 7,5 x 10 cm	Bio-Rad	1703932
Mini-PROTEAN  Célula de electroforesis vertical Tetra para mini geles prefabricados, con Mini Trans-Blot  módulo y fuente de alimentación básica PowerPac	Bio-Rad	1658034
4– 15% Mini-PROTEAN TGX Geles de proteínas prefabricadas	Bio-Rad	4561083
ChemiDoc XRS+ System	Bio-Rad	1708265
I-Glove	BioSpherix	I-Glove
Synergy HTX Lector de microplacas multimodo	BioTek	BTS1LFTA
Costar 5mL Stripette Pipetas Serológicas	Corning	4487
Costar 10mL Stripette Pipetas Serológicas	Corning	4488
Costar 25mL Stripette Pipetas Serológicas	Corning	4251
Corning 96-Pocillos Fondo Transparente Microplacas de Poliestireno Negro	Corning	3631
15mL de Alto Tubos de centrífuga cónicos Clarity PP	Corning	352095
Raspador de celda pequeña	Corning	3010
Gilson   Kit de 4 pipetas Pipetman L	Gilson		F167370 P2, P20, P200, P1000 y accesorios
Tubos de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 ml	Greiner Bio-One
PIPETBOY acu 2 Pipeta	INTEGRA Biosciences	155 000
Gabinetes de almacenamiento de líquidos inflamables Justrite	Justrite Manufacturing Co.	896000
Mezclador de vórtice	Labnet	S0200
Incubadora de CO2	NuAire	NU-5820
Agitadores orbitales	Stuart	SSL1
Rotor de tubo SB3 Stuart		SB3
MicroCL 21R Microcentrífuga	Thermo Fisher Scientific	75002470
Sorvall ST 16 Centrífuga	Thermo Fisher Scientific	75004240
Placas de cultivo de tejidos (100 mm)	Thermo Fisher Scientific	150350
Slide-A-Lyzer MINI Dispositivo de diálisis	Thermo Fisher Scientific	69580	10K MWCO, boyas flotantes de 0,1 mL
para dispositivos de diálisis Slide-A-Lyzer MINI de 0,1 ml Thermo	Fisher Scientific	69588
LSE Calentadores de baño seco digitales Thermo	Fisher Científico	1168H25
Termo Científico  Serie 1300 A2 Clase II, Tipo A2 Cabinas de bioseguridad	Thermo Fisher Scientific	13-261-308
Software
Image Lab Software	Bio-Rad	1709691