Artículo de método

Ensayo de co-inmunoprecipitación utilizando proteínas nucleares endógenas de las células cultivadas bajo condiciones hipóxicas

DOI:

10.3791/57836

2 de agosto de 2018

En este artículo

Resumen

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Aquí se describe un protocolo de co-inmunoprecipitación para estudiar interacciones de proteínas entre las proteínas nucleares endógenas bajo condiciones hipóxicas. Este método es conveniente para la demostración de las interacciones entre los factores de transcripción reguladores Co transcripcionales a hipoxia.

Resumen

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Niveles bajos de oxígeno (hipoxia) accionar una variedad de respuestas adaptativas con el factor inducible por hipoxia 1 (HIF-1) complejo actuando como regulador maestro. HIF-1 se compone de una subunidad α regulados por oxígeno de heterodiméricos (HIF-1α) y expresa constitutivamente la subunidad β (HIF-1β) también conocido como aril hidrocarburo del receptor nuclear translocador (ARNT), regulación de genes implicados en diversos procesos como angiogénesis , eritropoyesis y glucólisis. La identificación de proteínas interactuantes de HIF-1 es clave para la comprensión de la vía de señalización de la hipoxia. Además de la regulación de la estabilidad de HIF-1α, hipoxia desencadena también la translocación nuclear de los muchos factores de transcripción, incluyendo HIF-1α y ARNT. En particular, la mayoría de los métodos actuales utilizados para el estudio de tales interacciones proteína-proteína (IBP) se basa en sistemas donde los niveles de proteínas se incrementan artificialmente a través de la sobreexpresión de la proteína. Sobreexpresión de la proteína a menudo conduce a resultados no fisiológicos derivados de artefactos temporales y espaciales. Aquí describimos una co-inmunoprecipitación modificada protocolo después del tratamiento de la hipoxia con proteínas nucleares endógenas y como una prueba de concepto, para mostrar la interacción entre HIF-1α y ARNT. En el presente Protocolo, las células hipóxicas se cosecharon bajo condiciones hipóxicas y tampón de lavado de Dulbecco Phosphate-Buffered salina (DPBS) también fue previamente equilibrado a condiciones hipóxicas antes de su uso para mitigar la degradación de la proteína o complejo de la proteína disociación en reoxygenation. Además, las fracciones nucleares se extrajeron posteriormente para concentrar y estabilizar proteínas nucleares endógenas y evitar resultados falsos a menudo vistos en la sobreexpresión de la proteína. Este protocolo puede utilizarse para demostrar interacciones endógenas y nativas entre los factores de transcripción reguladores transcripcionales Co bajo condiciones hipóxicas.

Introducción

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La hipoxia ocurre cuando falta oxígeno se suministra a las células y tejidos del cuerpo. Juega un papel fundamental en diversos procesos fisiológicos y patológicos como la diferenciación de la célula de vástago, inflamación y cáncer1,2. Factores inducible por la hipoxia (HIFs) funcionan como heterodímeros, compuesto por una subunidad α regulados por el oxígeno y una subunidad β constitutivamente expresada también conocido como ARNT3. Hasta la fecha se han identificado tres isoformas de las subunidades de HIF-α (HIF-1α, 2α HIF y HIF-3α) y tres subunidades β HIF (HIF/ARNT-1β, ARNT2 y ARNT....

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Protocolo

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Esta sección del Protocolo, que utiliza el riñón embrionario humano 293A celular (HEK293A), s sigue las directrices del Comité de ética de investigación en la Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur.

1. inducción de hipoxia en las células HEK293A

  1. Preparar cuatro platos de 10 cm y la semilla 3 – 5 x 10 células de6 HEK293A por plato en 10 mL Dulbecco modificado suplementado Eagle (DMEM, glucosa de 4.5 g/L) con 10% suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 110 mg/L, 100 U/mL de penicilina y 100 mg / estreptomicina de mL. Las células a 37 ° C, 5% CO2 incubadora de la cultura.
    Nota: Cel....

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Resultados

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Para evaluar la respuesta celular a la hipoxia, la expresión se examinaron los niveles y la localización subcelular de los componentes de tratamiento complejo de hipoxia siguiente de HIF-1. HEK293A las células fueron cultivadas bajo condiciones hipóxicas durante 4 h o guardado en normoxia como controles. Niveles de la proteína HIF-1α y ARNT se examinaron en células completas o extractos nuclear citoplasmática por western blot. Como los niveles de HIF-1α esperados, total eran upregulated p.......

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Discusión

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El complejo de HIF-1 es un regulador principal de la homeostasis del oxígeno celular y regula una gran cantidad de genes implicados en diferentes respuestas de adaptación celulares a la hipoxia. Identificación de nuevas proteínas interactuantes de HIF-1 es importante para la comprensión del transduction de la señal hipóxica. Experimentos de co-inmunoprecipitación se utilizan comúnmente para los estudios de IBP para delinear vías de transducción de señal celular. Sin embargo, la sobreexpresión de la proteína sigue siendo .......

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Divulgaciones

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Los autores no declaran conflictos de interés.

Agradecimientos

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Agradecemos a Prof. Asoc. pecado Tiong Ong para el uso de la plataforma de la hipoxia. Este trabajo fue apoyado por el siguiente: Singapur Ministerio de educación, Ministerio de educación 1T1-02/04 y MOE2015-T2-2-087 (a Y.A.), Lee Kong Chian Facultad de medicina, concesión de la puesta en marcha de la Universidad Tecnológica de Nanyang M4230003 (a P.O.B.), el Consejo de investigación sueco, la Fundación familiar de Erling Persson, la Fundación de Novo Nordisk, la Fundación af Fundación de Quito, la Asociación Sueca de la Diabetes, la compañía de seguros de Scandia, la investigación de la Diabetes y Wellness Foundation, Fundación de litera von Kantzow, el Programa de i....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
fuerte
1.0 M Tampón Tris-HCl, pH 7.4 1ª BASE1415
Proteína A/G Perlas de SefarosaAbcamab193262
Proteína IgG natural de ratónAbcamab198772
EDTABio-Rad1610729
2x Laemmli Tampónde muestra Bio-Rad 1610737
2-MercaptoetanolBio-Rad1610710
Nitrocelulosa Membrana    Bio-Rad1620112
Bloqueador de grado secanteBio-Rad1706404Leche en polvo descremada para aplicaciones de Western Blot
10x Solución salina tamponada Tris (TBS)Bio-Rad1706435
10% Tween 20Bio-Rad1610781
10x Tris/Glycine/SDSBio-Rad1610732
10x Tris/Glycine Buffer Bio-Rad1610771
Precision Plus Protein Patrones de color dualesBio-Rad1610374
Anti-conejo IgG, Anticuerpo ligado a HRPSeñalización7074
Anti-ratón IgG, Anticuerpo ligado a HRP Señalización celular7076
SignalFire ECLReactivo Señalización celular6883
Solución salina tamponada con fosfato de DulbeccoCorning21-030-CV
Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)Merck Millipore52332
Anticuerpo ARNT/HIF-1 beta Novus BiologicalsNB100-124 Concentración: 1.4 mg/mL
Anticuerpo HIF-1 alfaNovus BiologicalsNB100-479Concentración: 1,0 mg/mL
YY1 AnticuerpoNovus BiologicalsNBP1-46218Concentración: 0,2 mg/mL
Qproteome Nuclear Protein KitQiagen37582Tampón de lisis NL y tampón de extracción NX1 se proporcionan en el kit
GAPDH AnticuerpoSanta Cruzsc-47724Concentración: 0,2 mg/mL
Glicerol (≥ 99%)SigmaG5516
Cloruro de potasioSigmaP9541
Tampón RIPASigmaR0278
Cloruro de sodio (NaCl)Sigma71376
NP-40Sigma127087-87-0
Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM, 4,5 g/L de glucosa)Thermo Fisher Scientific11995065
Ditiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificR0861
Suero fetal bovinoThermo Fisher Scientific10270106
línea celular HEK293AThermo Fisher ScientificR70507
Metanol Thermo Fisher Scientific67-56-1
Penicilina-estreptomicinaThermo Fisher Scientific15140122
Pierce Tabletas inhibidoras de la proteasa Thermo Fisher Scientific88660
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23225
QSP punta de carga de gel Thermo Fisher ScientificQSP#010-R204-Q-PK1-200 uL
Equipment/Instrument
Thick Blot Paper, Precortado, 7,5 x 10 cmBio-Rad1703932
Mini-PROTEAN  Célula de electroforesis vertical Tetra para mini geles prefabricados, con Mini Trans-Blot  módulo y fuente de alimentación básica PowerPacBio-Rad1658034
4– 15% Mini-PROTEAN TGX Geles de proteínas prefabricadasBio-Rad4561083
ChemiDoc XRS+ SystemBio-Rad1708265
I-GloveBioSpherixI-Glove
Synergy HTX Lector de microplacas multimodo BioTekBTS1LFTA
Costar 5mL Stripette Pipetas SerológicasCorning4487
Costar 10mL Stripette Pipetas SerológicasCorning4488
Costar 25mL Stripette Pipetas SerológicasCorning4251
Corning 96-Pocillos Fondo Transparente Microplacas de Poliestireno NegroCorning3631
15mL de Alto Tubos de centrífuga cónicos Clarity PPCorning352095
Raspador de celda pequeñaCorning3010
Gilson   Kit de 4 pipetas Pipetman L GilsonF167370 P2, P20, P200, P1000 y accesorios
Tubos de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mlGreiner Bio-One 
PIPETBOY acu 2 PipetaINTEGRA Biosciences155 000 
Gabinetes de almacenamiento de líquidos inflamables JustriteJustrite Manufacturing Co.896000
Mezclador de vórticeLabnetS0200
Incubadora de CO2NuAireNU-5820
Agitadores orbitalesStuartSSL1
Rotor de tubo SB3 StuartSB3
MicroCL 21R MicrocentrífugaThermo Fisher Scientific75002470
Sorvall ST 16 CentrífugaThermo Fisher Scientific75004240
Placas de cultivo de tejidos (100 mm)Thermo Fisher Scientific150350
Slide-A-Lyzer MINI Dispositivo de diálisisThermo Fisher Scientific6958010K MWCO, boyas flotantes de 0,1 mL
para dispositivos de diálisis Slide-A-Lyzer MINI de 0,1 ml ThermoFisher Scientific69588
LSE Calentadores de baño seco digitales ThermoFisher Científico1168H25
Termo Científico  Serie 1300 A2 Clase II, Tipo A2 Cabinas de bioseguridadThermo Fisher Scientific13-261-308
Software
Image Lab SoftwareBio-Rad1709691
celular 616201

Referencias

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  1. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 148 (3), 399-408 (2012).
  2. Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).
  3. Jiang, B. H.,....

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