Ensayo de co-inmunoprecipitación utilizando proteínas nucleares endógenas de las células cultivadas bajo condiciones hipóxicas

Xiaofeng Zheng; Calvin Qing Wei Ho; Xiaowei Zheng; Kian Leong Lee; Katarina Gradin; Teresa S. Pereira; Per-Olof Berggren; Yusuf Ali

doi:10.3791/57836

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Artículo de método

Ensayo de co-inmunoprecipitación utilizando proteínas nucleares endógenas de las células cultivadas bajo condiciones hipóxicas

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DOI:

10.3791/57836

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2 de agosto de 2018

Xiaofeng Zheng¹^,² , Calvin Qing Wei Ho¹ , Xiaowei Zheng³ , Kian Leong Lee⁴ , Katarina Gradin⁵ , Teresa S. Pereira³ , Per-Olof Berggren¹^,²^,³ , Yusuf Ali¹^,²

¹Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, ²Singapore Eye Research Institute (SERI), Singapore General Hospital, ³The Rolf Luft Research Center for Diabetes and Endocrinology, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, ⁴Cancer and Stem Cell Biology Program, Duke-NUS Medical School, ⁵Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet

En este artículo

Resumen

Aquí se describe un protocolo de co-inmunoprecipitación para estudiar interacciones de proteínas entre las proteínas nucleares endógenas bajo condiciones hipóxicas. Este método es conveniente para la demostración de las interacciones entre los factores de transcripción reguladores Co transcripcionales a hipoxia.

Resumen

Niveles bajos de oxígeno (hipoxia) accionar una variedad de respuestas adaptativas con el factor inducible por hipoxia 1 (HIF-1) complejo actuando como regulador maestro. HIF-1 se compone de una subunidad α regulados por oxígeno de heterodiméricos (HIF-1α) y expresa constitutivamente la subunidad β (HIF-1β) también conocido como aril hidrocarburo del receptor nuclear translocador (ARNT), regulación de genes implicados en diversos procesos como angiogénesis , eritropoyesis y glucólisis. La identificación de proteínas interactuantes de HIF-1 es clave para la comprensión de la vía de señalización de la hipoxia. Además de la regulación de la estabilidad de HIF-1α, hipoxia desencadena también la translocación nuclear de los muchos factores de transcripción, incluyendo HIF-1α y ARNT. En particular, la mayoría de los métodos actuales utilizados para el estudio de tales interacciones proteína-proteína (IBP) se basa en sistemas donde los niveles de proteínas se incrementan artificialmente a través de la sobreexpresión de la proteína. Sobreexpresión de la proteína a menudo conduce a resultados no fisiológicos derivados de artefactos temporales y espaciales. Aquí describimos una co-inmunoprecipitación modificada protocolo después del tratamiento de la hipoxia con proteínas nucleares endógenas y como una prueba de concepto, para mostrar la interacción entre HIF-1α y ARNT. En el presente Protocolo, las células hipóxicas se cosecharon bajo condiciones hipóxicas y tampón de lavado de Dulbecco Phosphate-Buffered salina (DPBS) también fue previamente equilibrado a condiciones hipóxicas antes de su uso para mitigar la degradación de la proteína o complejo de la proteína disociación en reoxygenation. Además, las fracciones nucleares se extrajeron posteriormente para concentrar y estabilizar proteínas nucleares endógenas y evitar resultados falsos a menudo vistos en la sobreexpresión de la proteína. Este protocolo puede utilizarse para demostrar interacciones endógenas y nativas entre los factores de transcripción reguladores transcripcionales Co bajo condiciones hipóxicas.

Introducción

La hipoxia ocurre cuando falta oxígeno se suministra a las células y tejidos del cuerpo. Juega un papel fundamental en diversos procesos fisiológicos y patológicos como la diferenciación de la célula de vástago, inflamación y cáncer¹^,². Factores inducible por la hipoxia (HIFs) funcionan como heterodímeros, compuesto por una subunidad α regulados por el oxígeno y una subunidad β constitutivamente expresada también conocido como ARNT³. Hasta la fecha se han identificado tres isoformas de las subunidades de HIF-α (HIF-1α, 2α HIF y HIF-3α) y tres subunidades β HIF (HIF/ARNT-1β, ARNT2 y ARNT....