Un análisis de la virulencia bacteriana rápida basada en imágenes usando ameba

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para medir la virulencia de las bacterias planctónicas o conectado a superficie utilizando D. discoideum (ameba) como anfitrión. Virulencia se mide durante un período de 1 h y anfitrión matando se cuantifica usando análisis de imagen y microscopia de fluorescencia. Demostramos este protocolo utilizando la bacteria p. aeruginosa.

Resumen

Ensayos de virulencia bacterianos tradicionales implican la exposición prolongada de las bacterias a lo largo de varias horas a las células del huésped. Durante este tiempo, las bacterias pueden experimentar cambios en la fisiología debido a la exposición al ambiente de crecimiento de anfitrión y la presencia de las células hospedadoras. Hemos desarrollado un ensayo para medir rápidamente el estado de virulencia de las bacterias que reducen al mínimo el grado al cual las bacterias crecen en presencia de las células del huésped. Bacterias y amebas se mezclan juntos e inmovilizadas en un solo plano de proyección de imagen con una almohadilla de agar. El procedimiento utiliza imágenes por fluorescencia unicelular con calceína-acetoxymethyl ester (calceína-AM) como un indicador de salud de la célula huésped. La fluorescencia de las células huésped se analiza después de 1 h de la exposición de las células del huésped a las bacterias mediante microscopía de epifluorescencia. Software de análisis de imagen se utiliza para calcular un índice de matanza de host. Este método se ha utilizado para medir la virulencia dentro de planctónicos y une superficie de Pseudomonas aeruginosa las subpoblaciones durante la etapa inicial de formación de biopelículas y puede ser adaptado a otras bacterias y otras etapas del crecimiento de biopelícula. Este protocolo proporciona un método rápido y robusto para medir la virulencia y evita muchas de las complejidades asociadas con el crecimiento y mantenimiento de líneas de células de mamífero. Fenotipos de virulencia mide aquí con las amebas también han sido validados con los macrófagos de ratón. En particular, este análisis fue utilizado para establecer esa virulencia de upregulates accesorio superficie en p. aeruginosa.

Introducción

La infección bacteriana es una de las principales causas de mortalidad en humanos y animales^1,2. La capacidad para medir la virulencia de las bacterias en cultivos o biofilms es importante en entornos de cuidado de la salud y la investigación. Aquí, describimos un método versátil, rápido y relativamente simple para cuantificar la virulencia bacteriana. El organismo eucariota Dictyostelium discoideum (ameba) se utiliza como organismo modelo host. D. discoideum se ha utilizado como un host para identificar factores de virulencia de Pseudomonas aeruginosa (p. aeruginosa)^3,4,5 y otras bacterias^{6,7 ,8} y es susceptible a en gran parte los mismos factores de virulencia que matan las células mamíferas, incluyendo el tipo III secreción^9,10. Anteriores ensayos de virulencia mediante D. discoideum han implicado la exposición prolongada de las bacterias con D. discoideum las células en el transcurso de horas^3,4,5. Protocolo, aquí, presenta un método rápido de determinación de virulencia usando esta ameba. Este protocolo (figura 1) se describe como: (1) crecen las amebas axenically (en ausencia de bacterias), (2) crecer bacterias para el análisis, (3) preparar las bacterias y las células del huésped para microscopía, (4) realizan microscopía de epifluorescencia y (5) analizan los ameba fluorescencia.

Amebas inicialmente con mechas hacia fuera de la acción congelada y crecidas en un jardín de Escherichia coli (e. coli), donde las amebas producen esporas. Estas esporas son seleccionadas y se inocula en un medio enriquecido para el crecimiento axénico. Las amebas se mantienen a través del crecimiento axénico en condiciones ricas en nutrientes hasta que están listos para ser mezclados con bacterias para la evaluación de la virulencia bacteriana. La supervivencia o la muerte de las amebas se cuantifica midiendo la fluorescencia de calceína-acetoxymethyl (calceína-AM), que es hendida por esterasas intracelulares y, por lo tanto, activado por fluorescencia^11,12. Amebas vivo exhiben poca o ninguna fluorescencia mientras que subrayó y fluorescencia de células muertas intensamente. Este resultado es debido a poca o ninguna incorporación de calceína-AM en amebas saludables e incorporación y clivaje del sustrato en amebas estresado¹³. Este comportamiento es notablemente distinto de fluorescencia de calceína-AM en células de mamífero^11,14,15,16.

Las bacterias que se aplicará para la virulencia se cultivan por separado. Aquí, describimos cómo medir la virulencia de los patógenos oportunistas p. aeruginosa y detalle cómo cuantificar la virulencia de planctónico (natación) y las subpoblaciones conectado a superficie. Este protocolo puede ser adaptado para probar la virulencia de otras bacterias. En la sección de resultados de representante, demostramos que la virulencia se activa en las células de superficie conectado y es baja en las células planctónicas, que fue divulgado previamente¹³. Virulencia-activado superficie unida p. aeruginosa mata amebas mientras no virulenta células planctónicas son consumidas por las amebas. Si únicamente se es analizar la virulencia de las bacterias planctónicas, las bacterias pueden ser cultivadas en tubos de cultivo ordinario en lugar de utilizar placas de Petri como se describe en el protocolo.

El crecimiento de las amebas y las culturas de p. aeruginosa debe coordinarse que cultivos de p. aeruginosa alcanzan la fase de crecimiento previsto, mientras que las amebas están creciendo en estado estacionario en condiciones ricas en nutrientes. Esta condición requiere típicamente culturas amebas a diluirse al menos 1 día antes cuando se mezclan con las bacterias. Amebas y bacterias se inmovilizan usando teclas de agar son co se incubó por 1 h y fotografiado con una resolución baja (10 X, abertura numérica 0.3) filtros de la proteína de fluorescencia verde, objetiva (GFP) y una cámara. Análisis se pueden realizar usando el software ImageJ libremente disponible o modificado para requisitos particulares software de análisis de imagen. Nuestro análisis fue realizado usando nuestro propio software escrito usando un paquete de análisis científico¹³. El software debe crear una máscara con la imagen de contraste de fase y extraer valores de fluorescencia de las áreas enmascaradas en la imagen de fluorescencia. Valores de fluorescencia son un promedio sobre por lo menos 100 células, resultando en un índice de matanza de host numéricos.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo en la Universidad de California, Irvine.

1. tampones y soluciones

1. Para preparar caldo de lisogenia (LB) en un frasco de vidrio de 1 L agregar 25 g de mezcla LB-Miller en 1 L de agua destilada doble (ddH₂O). Para placas de Petri, agregar un adicional 20 g de agar. Autoclave para esterilizar. Vierte 25 mL de medio agar fundido en platos de Petri de 10 cm de diámetro y dejar para solidificar a temperatura ambiente. Almacenar medios líquidos a temperatura ambiente y las placas de agar a 4 ° C.
2. Preparar platos para glucosa levadura peptona (GYP) en una botella de vidrio de 1 L mezclando 1 g de D-glucosa, extracto de 2 g de peptona, 0,25 g de levadura, 4,2 g de KH₂PO₄, 5,1 g de Na₂HPO₄7 H₂O y 25 g de agar en 1 L de ddH₂ O. Autoclave para esterilizar. Vierte 25 mL de agar fundido en platos de Petri de 10 cm de diámetro y dejar para solidificar a temperatura ambiente. Almacenar a 4 ° C.
3. Preparación de medio de peptona S (PS) en una botella de vidrio de 1 L mezclando 10 g de peptona, extracto de 7 g de levadura, 15 g de D-glucosa, 0,12 g de Na₂HPO₄7 H₂O, 1,4 g de KH₂PO₄, 40 μg de vitamina B₁₂ , y 80 μg de ácido fólico en 800 mL de ddH₂O. calibrar un medidor de pH electrónico utilizando estándares de pH 7 y pH 4, si el medidor de pH no ha sido utilizado dentro de un día.
   1. Medir el pH del medio PS utilizando el medidor de pH. Añadir KOH de 5 M o 5 M H₃PO₄ para ajustar el pH a 6.5. Ajustar el volumen final de 1 L con ddH₂filtro de O. esterilice usando 0.22 μm filtro vacío y almacenar a 4 ° C.
      Nota: Proceder con cautela con los ajustes de pH con el uso de equipo de protección como guantes, ropa protectora, protección para los ojos y cara protección.
4. Preparar 10 x Buffer de desarrollo primer (DB') buffer en una botella de vidrio de 1 litro mediante la adición de 3,4 g de KH₂PO₄, 13,4 g de Na₂HPO₄ 7 H₂O y ddH₂O hasta un volumen total de 800 mL. Calibrar un medidor de pH electrónico utilizando estándares de pH 7 y pH 4, si el medidor de pH no ha sido utilizado dentro de un día.
   1. Medir el pH del buffer usando el medidor de pH electrónico. Suavemente agregar KOH de 5 M o 5 M H₃PO₄ según sea necesario para ajustar el pH a 6.5. Ajustar el volumen final de 1 L con ddH₂O y esterilizar en autoclave. Almacenar a temperatura ambiente.
      Nota: Proceder con cautela con los ajustes de pH con el uso de equipo de protección como guantes, ropa protectora, protección para los ojos y cara protección.
5. Hacer 1 x de tampón de desarrollo (DB) mezclando 100 mL de 10 x DB' buffer con 1 mL de esterilizada 2 M MgCl₂, y 1 mL de esterilizado 1 M CaCl₂. Ajustar el volumen final de 1 L en una botella de vidrio de 1 L con un ddH esterilizada en autoclave₂O. almacén a temperatura ambiente.
6. Medio PS:DB en una botella de vidrio de 1 L se preparan mezclando 100 mL de medio de PS estéril, 100 mL de esterilizado 10 x DB' buffer y ddH esterilizada₂O hasta un volumen total de 1 L. suplemento con 1 mL de esterilización de MgCl 2 M₂ y 1 mL de esterilizado 1 M CaCl ₂. almacenar a 4 ° C.
7. Preparar la solución madre de calceína-AM por añadiendo 50 μl de DMSO a 50 μg de calceína-AM en el envase plástico proporcionado por el fabricante. Almacenar a-20 ° C.

2. crecimiento y mantenimiento de las amebas

1. Crecer la cepa de e. coli B/r¹⁷ como fuente de alimento para las amebas durante el período de crecimiento inicial. Racha de e. coli B/r de un stock congelado almacenados a-80 ° C sobre una placa de agar LB e incubar a 37 ° C durante la noche para obtener colonias individuales.
2. Inocular una sola Colonia de e. coli B/r en 2 mL de medio LB e incubar en un tambor de rodillo o una coctelera a 37 ° C durante la noche.
3. Llevar durante la noche de cultura de e. coli a la temperatura ambiente. Usando un palo de madera, inocular amebas de un stock congelado guardado a-80 ° C en 750 μl de la cultura durante la noche.
   Nota: Uso D. discoideum cepa AX3, que es capaz de crecimiento axénico¹⁸. Este paso no requiere crecimiento axénico, pero los pasos posteriores tendrán su requisito.
4. Inmediatamente añadir 700 μl de la mezcla dee. coli de amebas - sobre una placa de glucosa levadura peptona (GYP). Difundir la cultura uniformemente en la superficie de la placa inclinándola y hacia atrás y de lado a lado según sea necesario. Evitar el uso de un esparcidor.
5. Coloque la placa GYP con el agar hacia arriba en una caja que mantiene la humedad. Utilizar dos envases de plástico desechables (183 cm x 183 cm x 91 cm) apilados en la parte superior unos a otros. Llene el recipiente inferior con aproximadamente 25 mL de agua y colocar el contenedor superior con varios 0,5 cm de diámetro agujeros perforados a través del suelo del recipiente para permitir que la humedad mover el tanque de agua en el contenedor superior.
6. Incubar la placa de GYP y caja de 22 ° C durante 4-5 días hasta que las esporas de la ameba se observan creciendo cerca de la superficie de la placa (figura 2). Utilizar una incubadora refrigerada para incubar las placas en lugar de incubación a temperatura ambiente.
   Nota: Después de que las esporas han crecido, siguen siendo viables en las placas durante varias semanas si se almacena a 4 ° C. Almacenar las placas con agar hacia arriba. Después de 3-4 días de incubación, se observan zonas de claro en el césped bacteriano, que indican el inicio de la esporulación de la ameba.
   1. Observar amebas pequeñas esporas sobre la superficie de la placa tras 4-5 días de incubación (figura 2).
      Nota: Crecen las amebas por más de una semana, como la calidad de las esporas disminuye más allá de este período de tiempo.
7. Recoger las esporas de las amebas para prepararse para el crecimiento axénico de las amebas por barrido paralelo a la superficie de la placa de una punta de pipeta estéril 1 mL. Recoger las esporas de la mitad de un plato de Petri de 10 cm.
   Nota: Evite tocar la punta de la superficie de la placa de agar como esta propuesta recogerá gran cantidad de e. coli.
8. Resuspender las amebas en la punta de la pipeta por sumergir la punta en 1 mL de medio de PS y pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
9. Transferir la mezcla inoculada en un frasco de 250 mL que contenga 25 mL del medio PS complementado con la solución de antibiótico-antimicótico en concentración x 0.25.
   Nota: Almacene la solución antibiótico-antimicótico como alícuotas de μl 250 a-20 ° C. Evite ciclos repetidos de descongelación y congelación de esta solución como esto puede disminuir su eficacia.
10. Crecen amebas axenically a 22 ° C en un agitador rotatorio a 100 rpm. Para el análisis de la virulencia en el paso 5, crecen las células a una densidad óptica medida a 600 nm (OD₆₀₀) de 0.2 a 0.5.
    Nota: Este paso requiere 3-4 días de crecimiento desde el momento de la inoculación (paso 2.7). Si las células han crecido a una densidad más alta, diluir la cultura en el medio PS a un OD₆₀₀ de 0.05 o menor y crecer a un OD₆₀₀ de 0.2 a 0.5.

3. el crecimiento de p. aeruginosa

1. Escoger una sola Colonia de p. aeruginosa de una placa LB, inocular en una cultura de PS:DB de 2 mL y crecer durante la noche a 37 ° C a la saturación.
   Nota: No agregue la solución antibiótico-antimicótico para los medios de PS:DB.
2. Diluir la noche cultura 1: 100 o 1:1,000 en un plato de Petri de 6 cm de diámetro utilizando PS:DB. Si únicamente se es analizar la virulencia de las células planctónicas, crecen las culturas usando tubos de cultivo convencional en su lugar. Sacudir la cultura en un rotador de benchtop de 100 rpm a 37 ° C.
3. Culturas en momentos específicos para asegurar la reproducibilidad de la cosecha. A los 30 min a 1 h antes de la evaluación de virulencia, preparar una almohadilla de agar como se describe en la sección 4.
   Nota: Virulencia en p. aeruginosa es inducida por aproximadamente 8 h de crecimiento en las superficies.
4. Para aislar las células conectado a superficie, quite el medio líquido de la caja Petri, lavar de inmediato con 1 mL de tampón de DB para eliminar las células planctónicas y proceder de inmediato al paso 5.1.
   PRECAUCIÓN: No lave más de 30 s como este se perturban y separar células conectado en superficie y puede afectar la medición de la virulencia.
5. Para aislar las células planctónicas, transferir 10 μl de la cultura de la placa de Petri a una caja de Petri limpia y proceder de inmediato al paso 5.1.

4. microscopía - preparación de la almohadilla de Agar

1. Preparar pastillas de agar aproximadamente 30 min a 1 h antes de las amebas están listas para ser mezclados con p. aeruginosa.
2. Microondas 50 mL de agar 1% (p/v) en buffer DB en un matraz de 250 mL. Mezcla cada 20 s hasta grupos de agar desaparecen.
3. Enfriar el agar fundido al colocarlo en baño de agua precalentada 55 ° C durante 15 minutos.
4. Añadir 15 μl de la solución madre de calceína-AM a 15 mL del agar fundido en un tubo cónico. Mezcle suavemente invirtiendo el tubo 4 - 5 veces y proceder de inmediato al siguiente paso.
   Nota: Realice este paso en un tubo de centrífuga de polipropileno de 15 mL. No use un recipiente de vidrio grueso ya que el agar solidifique demasiado rápido.
5. Vierta la mezcla de agar fundido en la parte superior una placa de vidrio de 12 cm x 10 cm y permitir que el agar solidifique durante 10 minutos a temperatura ambiente. Cortar la almohadilla de agar solidificado en secciones más pequeñas de 1,5 cm x 1,5 cm colocando la placa de vidrio sobre una cuadrícula impresa y corte a lo largo de la rejilla usando una regla de metal.
6. Mantenga el gel hidratado en una caja húmeda hasta que esté listo para su uso.

5. microscopía - preparación de la muestra de Bacteria ameba imagen

1. Para la virulencia de células bacterianas con conexión por superficie de ensayo, añadir 10 μl de células de Ameba de paso 2.10 bacterias conectado a superficie del paso 3.4.
   Nota: Este paso describe la mezcla de amebas con las bacterias.
2. Para analizar la virulencia de las células planctónicas, mezclar 10 μl de las células de la ameba de paso 2.10 con 10 μl de las bacterias planctónicas de paso 3.5.
   Nota: No lave las células cultivadas axenically Ameba (en un OD₆₀₀ de 0.2 a 0.5) antes de mezclar con la bacteria. No crecimiento de e. coli se observará en la cultura de Ameba debido al uso de la solución de antibiótico-antimicótico.
3. Inmediatamente colocar la almohadilla de agar de calceína-AM 1,5 cm x 1,5 cm de paso 4.5 sobre la mezcla de bacterias-ameba en la superficie de la placa de Petri.
   Nota: Coloque la almohadilla de agar en la parte superior la mezcla utilizando un movimiento suave de rápido. Este movimiento tiende a empujar las células hacia la periferia y de la parte inferior de la almohadilla, no baje la almohadilla lentamente en la mezcla. Este paso garantizará que las bacterias y las amebas son uniformemente mezclados, inmovilizada y que ambos tipos de células están confinadas en el mismo plano.
4. Quitar exceso de líquido mediante pipeteo suavemente hacia fuera cualquier líquido restante alrededor de la almohadilla de agar. Permita que la placa de Petri secar por 20 min a temperatura ambiente.
5. Cubrir con la placa de Petri con tapa e incubar la mezcla inmovilizados ameba-bacterias a temperatura ambiente durante un adicional 40 min. proceda al paso 6.1.
   Nota: Es importante incubar las muestras durante la misma cantidad de tiempo, como el fondo fluorescencia aumenta con el tiempo. Se recomienda un tiempo de incubación de 1 h. Incubaciones por más de 1 h son menos reproducibles como las células de las amebas pueden empezar a explotar.

6. microscopia - adquisición de imágenes

1. Amebas de imagen utilizando un microscopio de fluorescencia capaz de adquirir imágenes de fluorescencia verde y trasmitida. Para fluorescencia verde, usar filtros de fluorescencia verde (GFP) de la proteína con 474/27 nm y 525/45 nm de excitación y emisión, respectivamente. Utilice un objetivo de (apertura numérica ≥0.3) X 10 a la imagen de las amebas.
   Nota: La calceína-AM en el agar causará muerte amebas a fluorescencia en el canal de fluorescencia verde. Amebas sanas de lo contrario no son fluorescentes.
2. Ajustar tiempos de adquisición para el contraste de fase, canales GFP para limitar fototoxicidad y optimizar el rango dinámico de las intensidades de la imagen. Sustituir el interferencia diferencial (DIC) fase contraste si es necesario.
   Nota: Usar exposiciones de 100-200 ms contraste de fases y fluorescencia de GFP si es posible. Mantener los ajustes de exposición e instrumento sin cambios a lo largo de todo el experimento. Esto es fundamental para calcular el índice de homicidio de host.
3. Adquirir imágenes de por lo menos 100 células de Ameba para obtener buenas estadísticas para calcular el host índice de matanza.

7. Análisis e índice de la matanza de Host de la imagen

1. Cabo el análisis de imagen con ImageJ.
2. Abra el archivo de imagen de contraste de fase en ImageJ haciendo clic en archivo | Abierto y seleccionar la imagen. Ajustar el umbral haciendo clic en imagen | Análisis | Umbral. Ajustar el umbral superior e inferior para seleccionar sólo el pico de intensidad (figura 3A).
3. Convertir la imagen a binario haciendo clic proceso | Binario | Hacer binario. Rellenar agujeros seleccionando proceso | Binario | Llenar los agujeros.
   Nota: Utilizando la imagen en la figura 1 como el origen, pasos 7.1-7.2 producirá una imagen en la que las amebas y las bacterias superficie adjunta aparecen como las regiones oscuras (figura 3B).
4. Asegurar que los cuadros de área y valor del gris medio se incorporan analizar | Establecer las medidas. Medir el tamaño aproximado de las amebas seleccionando la herramienta óvalo de la barra de herramientas principal. Haga clic en analizar | Medida y observe la zona de amebas representante.
5. Crear máscaras para las amebas haciendo clic analizar | Analizar las partículas. En el cuadro tamaño, escriba el área que se incluyen las amebas pero excluyen las bacterias. Seleccionar máscaras en el menú desplegable de la opción de mostrar. Asegúrese de que está marcada la casilla añadir a gerente .
6. Haga clic en OK y una imagen que muestra sólo las amebas y un ROI Manager aparecerá el cuadro de diálogo (figura 3C).
7. Abra la imagen de la fluorescencia usando archivo | Abierto y seleccionar el archivo correspondiente. Seleccionar todas las regiones en el ROI Manager manteniendo pulsada la tecla Mayús y clic en cada región en la lista (figura 3D).
8. Haga clic en el botón de medir en el ROI Manager. Se abrirá una ventana de resultados muestra el valor de la intensidad media de cada ameba.
9. Copiar los valores de fluorescencia para cada ameba en un programa de hoja de cálculo y calcular el anfitrión matando índice tomando el promedio de todos los valores de fluorescencia.

Resultados

Hemos crecido salvaje p. aeruginosa cepa PA14¹⁹ o un ΔlasR cepa²⁰ en el mismo fondo de PA14 en cajas Petri de 6 cm de diámetro y se analiza la virulencia de las células planctónicas y conectado a superficie. Culturas fueron inoculadas de colonias solo en las culturas PS:DB, cultivadas durante la noche en tubos de cultivo en un tambor de rodillo a 37 ° C saturación, diluido 1: 100 en PS:DB, cultiva para 8 h de 6 cm de diámet...

Discusión

Este protocolo describe un método rápido y cuantitativo para analizar la virulencia en p. aeruginosa. Este protocolo puede ser probado con otras bacterias. Sin embargo, es importante tener en cuenta que el medio de crecimiento debe ser compatible con las condiciones de crecimiento de la ameba. En particular, hemos optimizado el protocolo usando PS:DB como el medio de crecimiento bacteriano. Si se utilizan otros medios, puede ser necesario realizar un control del crecimiento sólo de los medios de comunicación en ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos
Bacto, deshidratado	BD Difco	214010
Antibiótico-Antimicótico (100X)	Life Technologies	15240062	Alícuota < 1 mL y almacenar a -20 < C
Calceína-acetoximetil éster (calceína-AM)	Life Technologies	C34852	Calceína acetoximetil (AM)
Cloruro de calcio, anhidro	Sigma-Aldrich	C1016
D-glucosa	Fisher Chemical	D16500	Dextrosa
Dimetilsulfóxido	Sigma-Aldrich	D5879
Ácido fólico	Sigma-Aldrich	F8758
LB-Miller	BD Difco	244620
Cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich	M8266
Extracto de levadura	Oxoid	LP0021
Peptona especial	Oxoid	LP0072
Óxido de potasio	Fisher Chemical	P250
Fosfato de potasio monobásico	Sigma-Aldrich	P0662
Fosfato de sodio dibásico heptahidratado	Fisher Chemical	S373
Vitamina B12	Sigma-Aldrich	V2876
Strains
Dictyostelium discoideum	Siryaporn lab	Strain AX318
Escherichia coli	Siryaporn lab	Cepa B/r17
Pseudomonas aeruginosa	Siryaporn lab	PA14	cepa19
Pseudomonas aeruginosa & Delta; lasR	Siryaporn lab	AFS20.1	Cepa derivada de PA1420
>Suministros
0.22 y micro; Filtro M	Millipore	SCGPT01RE	Para la esterilización del filtro
Tubo cónico, 15 mL		Corning 352097
Frascos de vidrio Pyrex		13951L	250 mL, 500 mL, 1000 mL
Placa de Petri, 6 cm de diámetro	Corning	351007	60 x 15 mm placas de poliestireno Placa
Petri, 10 cm de diámetro	Fisher	FB0875712	Placas de poliestireno de 100 x 15 mm
Recipientes de plástico con tapa	Ziploc	2.57E+09	Envases cuadrados de 3 tazas
Platos de vidrio	Bio-Rad	1653308	Para la preparación de almohadillas de agar. Se pueden utilizar otras placas de vidrio con dimensiones similares.
Palos de madera	Fisher	23-400-102
Equipment
Microscopio Eclipse Ti-E	Configuración del	microscopio	Nikon MEA53100
10X Plan Fluor Ph1 objetivo  0.3 NA	Configuración del	microscopio	Nikon MRH20101
Fuente de excitación de fluorescencia	Lumencor	Sola	Configuración del microscopio
Juego de filtros de fluorescencia	Semrock LED-DA	/FI/TX-3X3M-A-000	Configuración del microscopio
Cámara Orca Flash 4.0 V2	Hamamatsu	77054098	Configuración del microscopio
ImageJ	NIH	v. 1.49	Software para el análisis de imágenes
MATLAB	Mathworks	R2013	Software para el análisis de imágenes
Incubadora agitadora orbital	VWR	89032-092	Para el crecimiento de bacterias a 37 °
C Agitador de plataforma	Fisher	13-687-700	Para el crecimiento de amebas a 22 ° C
Espectrofotómetro	Biochrom	Ultrospec 10
Incubadora refrigerada bajo mostrador	Fisher	97990E	Para el crecimiento de amebas a 22 & grados; C
Baño de agua Isotemp	Fisher	15-462-21Q	Para enfriar medios hasta 55 ° C