Artículo de método

Un método invasivo para la activación de la convolución del cerebro dentada de ratón por el estímulo de alta frecuencia

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DOI:

10.3791/57857

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2 de junio de 2018

 , 
1Department of Neurobiology, Beijing Institute of Basic Medical Sciences, 2Key Laboratory of Neuroregeneration, Co-innovation Center of Neuroregeneration, Nantong University

En este artículo

Resumen

Este protocolo muestra cómo establecer un método confiable de HFS en ratones. Las neuronas en el hipocampo giro dentado son estimuladas eléctricamente por HFS directamente e indirectamente en vivo. La actividad neuronal y señalización molecular son examinados por c-fos y coloración inmunofluorescente de Notch1, respectivamente; la neurogénesis se cuantifica por bromodeoxiuridina etiquetado ensayo.

Resumen

Estimulación eléctrica de alta frecuencia (HFS), usando electrodos implantados a varias regiones del cerebro, se ha demostrado como un eficaz tratamiento para diversos trastornos neurológicos y psiquiátricos. HFS en la región profunda del cerebro, también llamado estimulación cerebral profunda (DBS), se está convirtiendo en cada vez más importante en los ensayos clínicos. Avances recientes en el campo de la cirugía DBS (HF-DBS) de alta frecuencia ha comenzado a difundir la posibilidad de utilizar esta técnica invasiva a otras situaciones, tales como el tratamiento para el trastorno de depresión mayor (MDD), trastorno obsesivo-compulsivo (TOC) y así en.

A pesar de estas indicaciones de expansión, los mecanismos subyacentes de los efectos beneficiosos de la HF-DBS siguen siendo enigmáticos. Para abordar esta cuestión, un enfoque es utilizar electrodos implantados que activan escasamente distribuidas subpoblaciones de neuronas por HFS. Se ha divulgado que HFS en el núcleo anterior del tálamo puede ser utilizado para el tratamiento de epilepsia refractaria en la clínica. Los mecanismos subyacentes podrían estar relacionado con la neurogénesis aumento y alteración la actividad neuronal. Por lo tanto, estamos interesados en explorar las alteraciones fisiológicas por la detección de la actividad neuronal, así como la neurogénesis en el giro dentado (DG) de ratón, antes y después del tratamiento de HFS.

En este manuscrito, se describen metodologías para HFS a la activación de la dirección general en ratones, directa o indirectamente y de forma aguda o crónica. Además, se describe un protocolo detallado para la preparación de rodajas de cerebro de c-fos y Notch1 inmunofluorescente tinción para monitorear la actividad neuronal y activación de señalización y de bromodeoxiuridina (BrdU) etiquetado para determinar la neurogénesis después de la inducción HF-DBS. La activación de la actividad neuronal y de neurogénesis después del tratamiento de la HF-DBS ofrece evidencia neurobiológica directa y los posibles beneficios terapéuticos. Particularmente, esta metodología puede ser modificada y aplicada para llegar a otras regiones del cerebro interesado como los ganglios basales y regiones subtalámicos para los trastornos cerebrales específicos en la clínica.

Introducción

HF-DBS es una tecnología para la estimulación eléctrica en el cerebro, que se ha desarrollado desde la década de 18701. A finales de 1980, HFS primero fue utilizado como una potencial intervención terapéutica para la enfermedad de Parkinson y trastornos del otro movimiento2. En las últimas décadas, HF-DBS ha sido más ampliamente utilizado en el tratamiento de los trastornos cerebrales que son actualmente intratables por una estrategia terapéutica tradicional. En particular, debido a la mejora en la precisión del electrodo HFS, resultados altamente efectivos y efectos secundarios mínimos, el número de trastornos cerebrales tratados por HF-DBS ha aumentado significativamente en los últimos decenios3,4, 5. Por ejemplo, HF-DBS ha sido aprobado por la US Food y Drug Administration (FDA) para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson (EP), de tipo Alzheimer, temblor esencial y otros tipos de trastornos de movimiento2,6, 7. en pacientes con EP, la medicación dopaminérgica se reduce hasta un 50% durante8de HF-DBS. Además del tratamiento acertado de trastornos del movimiento, HF-DBS también ha demostrado sus efectos poderosos en el tratamiento de enfermedades psiquiátricas en la clínica y para el aumento cognitivo como bien2,9, 10 , 11. Cabe señalar que la investigación de HFS para el tratamiento de otros trastornos psiquiátricos están en varias etapas, que ofrece mucha promesa de pacientes12.

Aunque muchos estudios han demostrado que una focal HFS tiene efectos tanto locales como remotos a lo largo de los13del cerebro, los mecanismos neurológicos y moleculares de los efectos siguen siendo escurridizo2,14. En la clínica, terapéutica HF-DBS se suele aplicar de una manera a largo plazo para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, dolor crónico etc. que muchas opiniones se plantean para explicar la mejora generada por un tratamiento de la HF-DBS, entre que una posibilidad que la corriente HFS modula la actividad de la red neuronal, probablemente por una despolarización repetitiva de los axones en las inmediaciones del electrodo implantado de HFS. O, HF-DBS puede cambiar la tasa de descarga de las neuronas de salida y los objetivos previstos. También, HF-DBS puede conducir a cambios sinápticos a largo plazo, potenciación a largo plazo (LTP) y depresión a largo plazo (LTD), que puede contribuir a una mejora sintomática. Hasta ahora, es todavía incierto si HFS influencias los eventos moleculares claves que regulan el celular procesos tales como la neurogénesis adulta en vivo. Varias líneas de estudios han demostrado que el HFS en roedores podría imitar respuestas neurales similares de DBS clínicamente aplicada15,16. Para entender los mecanismos celulares subyacentes de HF-DBS, en este estudio, en primer lugar establecimos un en vivo metodología HFS en ratones en un agudo (un día) o de manera crónica (cinco días). En segundo lugar, hemos creado una metodología de análisis de activación para determinar la alteración de la actividad neuronal y de neurogénesis después de una entrega de HF-DBS.

Dado que la producción neuronal de las células madre neurales es abundante durante el desarrollo embrionario, pero continúa a lo largo de la vida adulta, la zona subgranular hipocampo es una de las principales zonas donde se produce la neurogénesis. El proceso de neurogénesis es influenciado por muchos factores fisiológicos y patológicos. En ciertos casos de epilepsia, la neurogénesis hipocampal es drásticamente disminuido17,18. Además, una sola terapia electroconvulsiva podría aumentar significativamente la producción neuronal en el giro dentado19. Estas observaciones sugieren que la actividad electrofisiológica juega un papel crítico en la regulación de la neurogénesis adulta y la plasticidad sináptica en neuronas hippocampal. Por lo tanto, para demostrar aún más los efectos del HF-DBS en la actividad neuronal y de neurogénesis, primero llevamos a cabo un ensayo de immunostaining de principios inmediatos gene (IEG) c-fos que es un conocido marcador de la actividad neuronal a corto plazo resultantes de Experiencia de20. Señalización Notch1 se detecta también a supervisar la activación de la señalización después de la entrega HFS21,22. Por otra parte, detectamos también la producción neuronal por un BrdU etiquetado análisis después de la inducción HF-DBS en diversas maneras, aunque la tinción de BrdU puede ser también un marcador para gliogenesis.

En el presente estudio, dos metodologías HFS se adaptan a la activación de la dirección general de hippocampal directa e indirectamente. El electrodo implantado directamente en la dirección general o implantado en el camino perforante medial (PP), que envía proyecciones a activar las neuronas DG. Para la inducción HF-DBS, un estimulador programable se presenta para un estímulo continuo a través del electrodo fijo sobre la cabeza de ratón. Para determinar los efectos de HFS en activación neuronal y de neurogénesis, detectamos la expresión de c-fos y Notch1 coloración inmunofluorescente y el número de neuronas positivas BrdU incorporada en la región hippocampal de la DG, respectivamente, después el tratamiento de HFS. Particularmente, los efectos del HF-DBS en la neurogénesis en la DG se comparan entre una aguda y una forma de estimulación crónica, o entre una directa y una manera de estimulación indirecta, respectivamente.

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Protocolo

Procedimientos experimentales animales siguieron las directrices institucionales de la Beijing Instituto de ciencias médicas básicas (Pekín, China) y las regulaciones gubernamentales chinos para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Los ratones (26 masculinos, adultos ~ 30 g) alojado y mantenido a una temperatura constante de 23 ° C, con agua y comida ad libitum, bajo un ciclo oscuro de 12 h luz/12 h (se enciende en 7:00). Todos los procedimientos experimentales se realizaron durante el ciclo de luz.

1. quirúrgico preparación

Nota: Un electrodo de medida era casero usando el método modificado de Halpern informe23.

  1. Utilizar 2 micro-alambres de cobre (con un diámetro exterior de 200 μm) como el electrodo bipolar paralelo. Envuelva los electrodos uno alrededor del otro para formar electrodos cilíndricos para la estimulación.
    Nota: Aquí, la longitud del electrodo en el PP o el DG es variada según la profundidad anatómica del núcleo.
  2. Esterilizar los electrodos con un gabinete de desinfección de óxido de etileno. Maneje y guarde los electrodos de alambre micro 2 canales caseros sin ningún tipo de contaminación. Los electrodos deben ser estrictamente esterilizados antes de cualquier implantación quirúrgica.
  3. Autoclave de los instrumentos quirúrgicos.
  4. Antes de la cirugía, se inyectan el ratón con pentobarbital (20-50 mg/kg) por vía intraperitoneal, para lograr un plano quirúrgico de anestesia.
  5. Inyectar el ratón con una suspensión de procaína estéril penicilina G (75.000 U, I.M.) y un agente analgésico (carprofeno, 0.05 - 1 mg/kg, SC) para disminuir el riesgo de infecciones y dolor, respectivamente24.
  6. Después de la anestesia de animales, aplicar un lubricante ocular en ambos ojos para evitar la sequedad del ojo. Asegurar la inducción de la sedación y la profundidad de la anestesia por los reflejos del animal en respuesta a los dedos pellizcando y proceder a la operación sólo cuando no hay respuesta.
    Nota: Ungüento veterinario es otra opción para evitar la sequedad del ojo.
  7. Afeitar la mayoría de la piel en la parte superior de la cabeza de ratón con cortapelos eléctrico o una cuchilla de afeitar, esterilizar el área depilado con tres peelings alternadas de 70% alcohol y betadine solución y proceder a la operación cuando se haya secado el betadine en la piel.

2. alta frecuencia estimulación cirugía25,26

Nota: En este paso, un electrodo es unilateralmente implantado en la DG dorsal o medial zona PP, una parte del hipocampo con papeles críticos en la memoria y el aprendizaje episódico.

  1. Coloque el ratón anestesiado en el marco estereotáctico. Para mantener la cabeza del ratón inmóvil, Alinee correctamente las barras de oído e instalarlos rápidamente. Ajuste suavemente las barras de la oreja para que soporte la cabeza centrada y asegurar un poco el ratón.
  2. Use una almohadilla de termostatica para mantener la temperatura del cuerpo del animal a 37 ± 0.5 ° C.
  3. Use pinzas para sostener la piel anterior a las orejas de ratón y cortarlo con unas tijeras esterilizadas para eliminar sobre 1 cm2 de área de la piel en la parte superior del cráneo de ratón.
    Nota: Se pudo observar una pequeña cantidad de sangrado en los bordes de la piel cortada.
  4. Quitar el músculo y el otro accesorio que cubría el cráneo con un hisopo de algodón para exponer la superficie del cráneo. Use un hisopo de algodón y disección cincel para limpiar todo periostio, tendones y tejido conectivo de lambda suturas líneas y superficie totalmente a identificar la sagital del cráneo.
  5. Identificar el bregma y lambda. La intersección de la sutura coronal y la sutura sagital en la parte media superior de la calvaria es donde se encuentra el vértice. La intersección de la sutura del lambdoid por la sutura sagital es donde es visible la lambda. Utilice el vértice como punto original para establecer la posición de otro núcleo.
  6. Después de la identificación de la posición de bregma y lambda en el cráneo, ajuste estos dos puntos en el plano horizontal. Asegúrese de que la altura de estos dos puntos es casi lo mismo en la dirección de la dorsal-ventral (cualquier error debe ser < 0,05 mm). Además, asegúrese de que el cráneo es el nivel en dirección medial-lateral en la misma forma26.
  7. Para una cirugía unilateral, montar un electrodo de micro alambre cobre casero de 2 canales en el cable porta electrodo giratorio en el marco quirúrgico estereotáxico.
  8. Coloque el electrodo verticalmente sobre el punto bregma al principio y como el sitio original. Uso el digital muestra marco quirúrgico estereotáxico para indicar que el antero-posterior (AP), medial-lateral (ML), y posiciones dorso-ventral (DV).
    Nota: Para evitar que el electrodo que doblada, no toque la punta del electrodo sobre el cráneo durante la operación.
  9. Mueva suavemente el electrodo en la posición correcta (figura 1A, AP-2.1/ML ± 1.0 para DG y AP-3.8/ML ± 3.0 para PP, respectivamente)27 sobre el cráneo sin ningún tacto. Cuando se identificó el sitio deseado para la inserción del electrodo, use los ajustes stereotactic dorsoventral más el soporte de electrodos y marca la posición con un marcador negro.
    Nota: La ubicación exacta en referencia a las coordenadas estereotáxicas puede variar según el sexo, el peso y la cepa de ratón. Ratones adultos del mismo sexo deben utilizarse para minimizar cualquier variación en la ubicación. Si es posible, las exploraciones anatómicas preoperacionales puede usarse para identificar la ubicación en un tema individual base27.
  10. Utilizar un taladro manual asistido por instrumental quirúrgico (las rebabas del tamaño = 0,5 mm) para hacer los agujeros de las rebabas en la posición marcada precisamente. Esterilizar la punta de las rebabas con etanol al 70% antes de perforar. Subir la mini broca a través del cráneo a lo largo del eje z 0,8 - 1,0 mm sin cambiar su posición X-Y. Utilice un algodón estéril para detener cualquier sangrado durante la operación.
    Nota: Para evitar la generación de calor excesivo y sobre-perforación durante la perforación, asegúrese de que la velocidad de la perforación es de 15.000-18.000 revoluciones por minuto (RPM) y con frecuencia retirar la broca del orificio de trépano cada 8-10 s.
  11. Mantener la perforación hasta que se expone la dura. Usar agujas despuntadas para quitar cualquier restos de hueso que se generan durante la perforación y hacen un pequeño agujero en la dura sin dañar el tejido blando del cerebro subyacente.
    Nota: Para evitar dañar el tejido cerebral, la aguja Roma de doblado también puede ser sustituida con un fórceps Romo fino.
  12. Para confirmar que los agujeros de las rebabas se han realizado correctamente en la posición deseada, reducir la altura de electrodo por un ajuste de la estructura de la cirugía estereotáctica y asegúrese de que el electrodo puede insertarse suavemente a través del agujero de las rebabas sin tocar ningún obstáculo. Si es así, introduzca lentamente los electrodos a una profundidad de 1,8 mm para la DG (o 3,0 mm para el PP) de la superficie del cráneo en el PP medial a la DG (PP-DG).
    Nota: Limpie cualquier líquido cerebroespinal o salidas de la sangre de los agujeros de las rebabas con algodón estéril durante el proceso de la implantación del electrodo.
  13. Después de insertar el electrodo de micro alambre en el orificio del cráneo, mantener en su lugar con cemento dental adecuado usando una pequeña espátula. Como el cemento espesa, molde alrededor del electrodo insertado y tornillos para formar una tapa suave agradable. Desbridar y desinfectar los bordes de la herida.
  14. Desconectar el electrodo del portaelectrodo. Retire el marco estereotáctico con el ratón y volver a una jaula caliente.
    Nota: Después de la cirugía, esperar con devolver los animales a sus jaulas hasta que han recuperado de la anestesia con la suficiente conciencia.
  15. Deja el ratón mueva libremente y permita que recuperar durante 2 días en la jaula. A continuación, conecte el electrodo implantado en el ratón cerebro un estimulador programable vía conduce. Configurar la interfaz de software tal como se presenta en la figura 2. Configurar los parámetros de HFS como 6 series de 6 trenes de 6 pulsos a 400 Hz (figura 1B, 100 ms entre los trenes, 20 s entre las series)28. Ajuste la intensidad de la estimulación a 200 μA.
  16. Entregarán un HFS para el período de tiempo establecido. Entregar el estímulo 2 x al día 8:00 y 20:00
  17. Para el grupo control, implante de electrodos en los ratones y no realice una estimulación.
  18. Para la tinción de c-fos , estimular los ratones experimentales agudo (2 x al día). Para el etiquetado de BrdU, dividir los ratones experimentales en un grupo de estimulación aguda (aplicar 2 veces por día) y un grupo de estimulación crónica (aplicado 10 x en 5 días, 2 veces al día). Durante el curso de la estimulación, asegúrese de que el ratón esté despierto. Recuerde asegurar que los cables no estén retorcidos.
    Nota: En el último día del procedimiento, los ratones en el grupo de estimulación aguda fueron estimulados simultáneamente.
  19. Cuando se realiza la estimulación, cuidadosamente Desconecte el pin del electrodo el portaelectrodo y el conector del sistema de grabación.

3. inmunofluorescencia coloración y etiquetado29 de bromodeoxiuridina

  1. Para el c-fos y la coloración de Notch1, aproximadamente 3 horas después de la última estimulación de HF-DBS, anestesiar los ratones mediante la inyección de pentobarbital (20-50 mg/kg, I.P.) para lograr un plano quirúrgico de anestesia.
  2. Para el etiquetado de BrdU, unas 12 h después de la última estimulación de HF-DBS, dar 6 inyecciones de BrdU al control y a los ratones estimulados en intervalos de 2 horas (50 mg/kg en solución salina al 0.9%, I.P.). 36 h después de la última inyección, anestesiar los ratones mediante la inyección de pentobarbital (20-50 mg/kg, I.P.) para lograr un plano quirúrgico.
  3. Hacer incisiones con un bisturí a través de la caja torácica para exponer el corazón y luego pasar una aguja de calibre 22 Romo perfusión al ventrículo izquierdo. Hacer una pequeña incisión en la aurícula derecha. Transcardially lo perfusión con 50 mL de frío salina tamponada con fosfato (PBS) seguida por 50 mL de frío 4% paraformaldehido (PFA) de 1 x PBS (pH 7.4).
    Nota: Cambiar el PBS a la PFA cuando el ratón sangre en vivo el líquido salga limpia. Una buena perfusión se puede juzgar por la limpieza del hígado. La perfusión debe interrumpirse una vez se han observado30temblores de fijación.
  4. Decapitar el ratón con las tijeras oftálmicas, hacer una incisión en la piel y exponen el cráneo. Con unas pinzas, chip de cráneo ligeramente y con cuidado diseccionar el cerebro de ratón entero. Post-fix el cerebro en paraformaldehído al 4% para 2 días adicionales y transferirlo a una solución de sacarosa al 30% a 4 ° C durante la noche.
  5. Con un criostato, corte los cerebros en secciones coronales de 20 μm. Transferencia y Monte las secciones del portaobjetos de vidrio con un pincel y almacenar a-20 ° C.
    Nota: Animales con misplacements de electrodo o daños mecánicos excesivos serán excluidos del análisis posterior.
  6. Transfiera los portaobjetos a PBS normal (0.1 M, pH 7.4) que contiene no fijador. Lavar las láminas con PBS para x 3-4 de 5 minutos cada uno para quitar cualquier exceso fijador. Para el grupo marcado con BrdU, incubar las secciones en HCl 2 N durante 30 min a 37 ° C y enjuagarlos en un tampón de borato de 0.1 M (pH 8,4; 10 min). Luego lavar las rodajas de 2 x durante 5 minutos en PBS.
    Nota: A continuación se realiza inmunotinción.
  7. Tratar rebanadas por la incubación en el bloqueo de solución (suero de cabra normal 1%, 3% albúmina de suero bovino BSA del < >, 0.5% Tritón X-100 y 0,02% de azida sódica en PBS 1 x) por 1 h a temperatura ambiente (RT).
  8. Incubar las rebanadas con el anti -c-fos anticuerpo policlonal (1: 500, conejo), anticuerpos anti-Notch1 (1:50; cabra) o anticuerpos anti-BrdU (1: 800; rata) en la solución de bloqueo a 4 ° C durante la noche.
  9. Lavar las rodajas de 3 x en PBS, luego los Incube con Alexa Fluor 568 conjugado anti-conejo (1: 500), Alexa Fluor 488 conjugado anti-cabra (1:1, 000), o el anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 anti-rata (1: 500) durante 1 h a TA.
  10. Lavar las muestras 3 x en PBS (10 min cada vez). Cubrir las secciones del cerebro inmuno-etiquetado utilizando un medio de montaje de reactivo anti-fade con DAPI. Deje que las rebanadas de secar y guardarlos protegidos de la luz a 4 ° C.
  11. Adquisición de imágenes de las zonas hipocampales de los lados estimulados y sin estimular el cerebro con una alta resolución multicanal (secuencial) microscopio confocal de barrido. Configurar los parámetros de imagen consistente entre los grupos experimentales y control.
  12. Realizar una proyección de imagen de mosaico utilizando un objetivo de alto aumento (objetivo 20 X aire, NA 0.45) para adquirir continuo imágenes en 3D (XYZ) de campos adyacentes de vista con la etapa motorizada y utilizar el software apropiado para coser juntos para hacer grandes compuesto imágenes.
    Nota: Mosaico funciones incluyen verdadera costura y suavizado de opciones para mejorar imágenes sin fisuras. Imágenes compuestas son rápida y fácilmente preparadas usando la función de pespunte, para formar una imagen sobre un área amplia.
  13. Para c-fos y la coloración de Notch1, realizar un análisis cuantitativo de los núcleos positivos de densidad inmunofluorescente21 de las imágenes cosidas. Al azar seleccione 3 áreas en las subregiones DG hipocampales dorsales, ventrales y rostrales y medir la densidad inmunofluorescente de una manera doble ciego usando Image J software (http://rsb.info.nih.gov/ij/)31.
  14. Para un etiquetado de BrdU, analizar las rebanadas alrededor del punto de perforación a través del hipocampo dorsal (-1,70 mm a-2,70 mm en relación con el vértice) de una manera doble ciego.
  15. Contar sólo las neuronas de BrdU positivas en la dirección general. Son las células que mienten dentro de diámetros 2-celular de la célula del gránulo en la cuenta.
    Nota: Aquí, contando fue realizada usando un 40 X objetivo de aire. Al azar, secciones 3-5 por animal fueron contadas, y las cuentas fueron promediadas y expresadas como medias por DG19.

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Resultados

Después de la estimulación de HF-DBS para la subregión DG hippocampal directamente o la subregión PP para activar el DG indirectamente vía insertado electrodos usando los ajustes stereotactic, los roedores fueron anestesiados con pentobarbital y muestrean 3 h después de la última estimulación de HF-DBS para el c-fos y el immunostaining de Notch1. Para la tinción de BrdU, 36 h después de la última inyección de BrdU después de 1 día o 5 días de estimulación HF-DBS, los roe...

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Discusión

La técnica HF-DBS ha sido ampliamente utilizada como una poderosa herramienta para el tratamiento de muchos trastornos neurológicos desde la década de 1990. Hasta ahora, el trabajo de la señal de HF-DBS es para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson y temblor esencial, que ha atraído mucha atención e interés tanto en la comunidad científica y clínica. Hay varios tipos de estudios en curso HF-DBS por muchos grupos para la aplicación terapéutica de HF-DBS en ciertos trastornos neurológicos y psiquiátricos

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que declarar.

Agradecimientos

Apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China subvenciones 31522029, 31770929 y 31371149 (a Haitao Wu), programa 973 (2014CB542203) del programa estatal desarrollo clave para la investigación básica de China (Wu Haitao) y Grant Z161100000216154 de la Municipal de Beijing de ciencia y tecnología Comisión (Haitao Wu). Los autores agradecen a todos los miembros del laboratorio Haitao Wu para su estímulo y discusiones. Los autores están muy agradecidos a Zhenwei Liu por su ayuda con el aparato de depuración.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Instrumento estereotáxico cerebralStoelting51730DImplante intracraneal estereotáctico para ratón
EstimuladorSistemas A-MModelo 3800MultiStim Estimulador programable de 8 canales
Taladro dentalSaeshin Precision Co., LtdSTRONG 90Para perforación y craneotomía 
BurrMeisingerHM1 005#Para perforación y craneotomía 
Digidata 1550 DigitalizadorMolecular DevicesAXON 1550Adquisición de datos de alta resolución
CryotomeThermo Fisher ScientificThermo Cryotome FSECorte de secciones congeladas de muestras
Microscopio confocalOlympusFV-1200Japón, con objetivo 20x (NA 0.45)
Herramientas de cirugía para ratonesF.S.T.14084-08,11254-20,16109-14Tijeras, pinzas, cortador de huesos, soportes, etc.
Pentobarbital sódicoR& D systems457920-50mg/kg para inyección i.p.
Penicilina G Sigma-AldrichP303275.000 U para inyección i.m.
CarprofenoSigma-AldrichSML17135-10mg/kg, para inyección s.c.
4% Paraformaldehído (PFA)Beijing Solarbio Sci-Tech Co. P1110solución de calcetín para la fijación de tejidos
Tampón de fosfato (PBS)Invitrogen10010023pH7,4, 500 ml en media
Compuesto Tissue-Tek O.C.T.Sakura4583Formulación de glicoles y resinas solubles en agua
anticuerpo anti-BrdUAbcamab6326Diluciones:1/800
anticuerpo anti-c-fosAbcamab209794Diluciones:1/500
IgG anti-conejo de cabra (Alexa Fluor 568)Thermo Fisher ScientificA11036Diluciones:1/500
IgG anti-rata de burro (Alexa Fluor 488)Jackson ImmunoResearch712-546-150Diluciones:1/500
Medio de montaje antidecoloración con DAPIVector LaboratoriesH-1200Contratinción con anticuerpo DAPI
anti-Notch1 (C-20)Santa Cruz Biotechsc-6014Diluciones:1/50
Burro Anti-Cabra IgG (Alexa Fluor 488)Abcamab150073Diluciones:1/1000

Referencias

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