Guiada por la base de datos-citometría de flujo para la evaluación de la maduración de células mieloides de la médula

Summary

La diagnosis MDS es difícil en ausencia de criterios morfológicos o citogenética no informativo. MFC podría ayudar a perfeccionar el proceso de diagnóstico de MDS. Para ser de utilidad para la práctica clínica, el análisis MFC debe basarse en parámetros con suficiente especificidad y sensibilidad, y resultados deben ser reproducibles entre diferentes operadores.

Abstract

Un grupo de trabajo iniciado dentro de la asociación francesa de citometría (AFC) fue desarrollado con el fin de armonizar la aplicación de la citometría de flujo multiparamétrico (MFC) para el diagnóstico de enfermedad mieloide en Francia. El protocolo presentado aquí fue acordada y aplicada entre septiembre de 2013 y noviembre de 2015 en seis laboratorios de diagnóstico francés (hospitales universitarios de Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Niza y Lille e Instituto Paoli-Calmettes en Marsella) y permite la estandarización de la médula ósea muestra preparación y adquisición de datos. Tres bases de datos de maduración fueron desarrollados para neutrófilos, monocítica y linajes eritroides con la médula ósea de individuos "sanos" donantes (personas sin ninguna evidencia de una enfermedad hematopoyética). Un método robusto de análisis para cada linaje mieloide debe ser aplicable para el uso rutinario de diagnóstico. Nuevos casos pueden ser analizados de la misma manera y con respecto a las bases de datos generalmente. Por lo tanto, cuantitativas y cualitativas las anormalidades fenotípicas pueden ser identificadas y aquellos por encima de 2SD en comparación con los datos de las muestras de médula ósea normal puede considerarse indicativas de patología. La principal limitación es la mayor variabilidad entre los datos que se consigue utilizando los anticuerpos monoclonales obtenidos con los métodos basados en hibridomas tecnologías y actualmente se utiliza en diagnóstico clínico. Establecimiento de criterios para la validación técnica de los datos adquiridos puede ayudar a mejorar la utilidad de MFC para el diagnóstico MDS. El establecimiento de estos criterios requiere un análisis contra una base de datos. La reducción de la subjetividad del investigador en análisis de datos es una ventaja importante de este método.

Introduction

En la ausencia de marcadores fenotípicos específicos a los que ocurren en las células mieloides durante la MDS iniciación y progresión de los cambios displásticos, ha propuesto un nuevo enfoque en los últimos años basadas en la evaluación de las vías de maduración (expresión alterada de antígenos mieloides durante la producción de células mieloides maduras) o de la distribución anormal de los diferentes tipos de células en la médula (BM) la célula compartimientos^1,2.

Este artículo presenta un nuevo método para el uso estandarizado de MFC para detectar cambios displásticos en BM comp....

Protocol

El protocolo a continuación ha sido aprobado por el "Comité de protección des Personnes" (Comité de ética independiente) 1 Sud-Est de la Universidad Hospital de Saint-Etienne, Francia.

1. citometría ajustes

Nota: La configuración de citómetro se realizaron según recomendaciones de flujo de Francia, según procedimiento EuroFlow "EuroFlow operativo protocolo de estándar (SOP) para la configuración del instrumento y compensación (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).

1. Configuración instrumento mensual
   1. Gire en el citómetro. Asegurar que todos los niveles de fluido adecuad....

Results

Las 54 muestras de BM en anticoagulante EDTA K se incluyeron en el estudio. Se analizaron los datos MFC en la ausencia de cualquier información sobre los pacientes. Estudio retrospectivo demostró que las muestras del BM eran de 7 donantes sanos (5 machos y 2 hembras con una edad media de 47.4 [35-48], 11 personas sin evidencia de una enfermedad hematopoyética (8 varones y 3 hembras con una edad promedio de 57.9 [35-72]) y 36 casos con varias condiciones patológicas: 1 caso con anemia y n.......

Discussion

La calidad de aspirado del BM podría impactar en los resultados finales. La hemodilución de la aspirada del BM podría distorsionar la distribución de células en diferentes etapas de maduración debido a la ausencia de progenitores o precursores. Probablemente emplear un bulto lisis método puede ayudar en la normalización de BM aspira por hemodilución en los análisis de citometría de flujo. Además, los pasos críticos para la evaluación de la displasia mieloide BM por citometría de flujo son la muestra procesamiento y tinci.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Citómetro de flujo BD FACSCanto II	BD Biosciences, CA, EE. UU	SN:	configuración de 3 láseres, 4-2-2, Detalles de filtros y espejos:
Centrífuga https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf Awel C48-R	AWEL Industries, FR	SN: 910120016; Modelo: 320002001	centrífugas de baja velocidad; capacidad 60 tubos FACS
pipetas de 10 y micro; L y 200µ L
pipetas
15 mL Tubos Falcon tubo de
polipropileno para FACS
Ratón Anti-Humano HLA-DR	BD Biosciences, CA, EE. UU		. 655874 clon L243 Ratón BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)
Ratón Anti-Humano CD45	BD Biosciences, CA, EE. UU	.	560777 clon HI30 Ratón IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)
Ratón Anti-Humano CD16	BD Biosciences, CA, EE. UU.	656146	clon CLB/fcGran1 Ratón BALB/c IgG2a, κ Fluorocromo FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Ratón Anti-Humano CD13	BD Biosciences, CA, EE. UU		. clon de 347406 L138 Ratón BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorocromo PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Ratón Anti-Humano CD34	BD Biosciences, CA, EE. UU.	de 347222	8G12 Ratón BALB/c IgG1, κ Fluorocromo PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)
Ratón Anti-Humano CD117	BD Biosciences, CA, EE. UU	. 339217	clon 104D2 Ratón BALB/c IgG1 Fluorocromo PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)
Ratón Anti-Humano CD11b	BD Biosciences, CA, EE. UU	. clon de 333143	D12 ratón BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorocromo APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm
Ratón Anti-humano CD10 BD	Biosciences, CA, EE. UU	. clon	646783 HI10A Ratón BALB/c IgG1, κ Fluorocromo APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Ratón Anti-Humano CD35	BD Biosciences, CA, EE. UU.	555452	clon E11 Ratón IgG1, κ Fluorocromo FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Ratón Anti-Humano CD64	BD Biosciences, CA, EE. UU		. 644385 clon 10.1 Ratón BALB/c IgG1, κ Fluorocromo PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Ratón Anti-Humano CD300e	Immunostep	IREM2A-T100	clon UP-H2 Ratón BALB/c IgG1, k Fluorocromo APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Ratón Anti-Humano CD14	BD Biosciences, CA, EE. UU.	641394	clon MoP9 ratón BALB/c IgG2b, κ Fluorocromo APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Ratón Anti-Humano CD36	BD Biosciences, CA, EE. UU	. clon de 656151	CLB-IVC7 Ratón IgG1, κ Fluorocromo FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Ratón Anti-Humano CD105	BD Biosciences, CA, EE. UU	. 560839	clon 266 Ratón BALB/c IgG1, κ Fluorocromo PE (Ex máx. 496 nm/ Em máx. 578 nm)
Ratón Anti-Humano CD33		345800	clon P67.6 Ratón BALB/c IgG1, κ Fluorocromo APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Ratón Anti-Humano CD71	BD Biosciences, CA, EE. UU		. 655408 clon M-A712 Ratón BALB/c IgG2a, κ Fluorocromo APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Solución de lisis 10x Concentrado (IVD)	BD Biosciences, CA, EE. UU	349202
FACSFor fluido de vaina baja	BD Biosciences, CA, EE. UU	342003
FACSDiva CS& T Cuentas IVD	BD Biosciences, CA, EE. UU.	656046
PARTÍCULAS DE CALIBRACIÓN ARCO IRIS, 8 PICOS	Cytognos, Salamanca, España	Lotes SPH-RCP-30-5A	EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
Partículas de compensación Multicolor CompBeads (CE/IVD)	BD Biosciences, CA, USA	ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Diva software versiones 6.1.2 y 6.1.3	BD Biosciences, CA, EE. UU.
Tabletas de solución salina tamponada con fosfato	R& D Systems, Minneapolis, EE.UU.	5564
Albúmina sérica bovina ( BSA)	Sigma-Aldrich, Francia	A9647
Azida sódica 99%	Sigma-Aldrich, Francia	199931
Infinicyt versión 1.8.0.e	Cytognos, Salamanca, España