En Vivo Sondas de microdiálisis método para recolectar grandes proteínas extracelulares de líquido intersticial cerebral con corte de peso molecular alto

Resumen

Microdiálisis in vivo ha permitido colección de moléculas presentes en el líquido intersticial del cerebro (ISF) de animales despiertos, comportarse libremente. Con el fin de analizar las moléculas relativamente grandes en ISF, el actual artículo se centra específicamente en el protocolo de microdialysis con sondas de alto peso molecular cortado de las membranas.

Resumen

Microdiálisis in vivo es una técnica poderosa para recoger ISF en despiertos, comportándose libremente animales basados en el principio de la diálisis. Aunque la microdiálisis es un método establecido que mide relativamente pequeñas moléculas como aminoácidos o neurotransmisores, se ha utilizado recientemente para evaluar también la dinámica de moléculas más grandes en ISF usando puntas de prueba con alto peso molecular cortado membranas. Al uso de estas sondas, microdialysis tiene que ejecutar en modo push-pull para evitar la presión acumulada dentro de las sondas. Este artículo proporciona protocolos paso a paso, incluyendo cirugía estereotáctica y cómo configurar líneas de microdiálisis para recoger las proteínas de la ISF. Durante microdialysis, drogas pueden administrarse ya sea sistémica o por infusión directa en ISF. Microdiálisis reversa es una técnica para incorporar directamente compuestos en ISF. Inclusión de medicamentos en el búfer de perfusión de microdiálisis permite que difunden en ISF a través de las sondas mientras recogía simultáneamente ISF. Mediante la medición de la proteína tau por ejemplo, el autor muestra cómo los niveles se alteran al estimular la actividad neuronal por microdiálisis reversa de picrotoxin. Ventajas y limitaciones de microdiálisis se describen junto con la solicitud extendida mediante la combinación de otros métodos en vivo .

Introducción

ISF consta de 15-20% del volumen total del cerebro y ofrece un microentorno crítico para la transducción de señales, transporte de substrato y separación de residuos¹. Por lo tanto, la capacidad de recogida de ISF de animales vivos proporcionará mayor implicaciones para diversos procesos biológicos como mecanismo de enfermedad. Microdiálisis in vivo es uno de los pocos métodos muestra y cuantificar moléculas extracelulares de ISF de despierto, moviendo libremente animales y de tal modo sirve como una herramienta útil en Neurociencias investigación campo^2,3. En este método, las sondas de microdiálisis con membranas semipermeables son insertadas en el cerebro y perfundidas con tampón de perfusión en la tasa de flujo relativamente lento (0.1-5 μl/min). Durante esta perfusión, moléculas extracelulares en ISF pasivamente se difunden en la punta de prueba según el gradiente de concentración y recogen como un dializado. Aunque este artículo se centra en el método de muestra de ISF en el cerebro, el principio y el método pueden aplicarse a otros órganos por la modificación apropiada si es necesario.

Microdiálisis primero fue empleado en la década de 1960 y desde entonces ha sido ampliamente utilizado para recoger pequeñas moléculas como aminoácidos o neurotransmisores en el cerebro. Sin embargo, la reciente disponibilidad comercial de las sondas de microdiálisis con peso molecular alto cortar membranas (100 kDa 3 MDa) ha extendido su aplicación a las proteínas relativamente mayores en ISF así^{4,5,6 ,7}. Los estudios de uso de estas sondas ha llevado a la conclusión que las proteínas como tau o α-sinucleína que durante mucho tiempo se pensó que exclusiva citoplásmico también son fisiológicamente presente en ISF^4,5,8.

Una de las dificultades con sondas de microdiálisis de corte grandes membranas (normalmente más de 1.000 kDa) es que son más susceptibles a la pérdida de líquido de ultrafiltración debido a la presión interna acumulada en las puntas de prueba. Sondas de microdiálisis aquí tienen una estructura única para evitar este problema. La presión no se construirá debido a esta estructura, por lo tanto microdialysis con estas puntas de prueba debe ser operado en un modo de "push-pull" utilizando una bomba de jeringa para inundar las sondas (= empuje) y una bomba peristáltica/rodillo para recoger la venida del dializado de la salida de la sonda (= tirar) ⁹ (aunque necesita empujar y tirar bombas, debido a la cancelación de los orificios de ventilación en las puntas de prueba, la presión el sistema es técnicamente sólo impulsado por la bomba de extracción). Este artículo comienza con la cirugía estereotáctica de una implantación de cánula guía y describe cómo configurar líneas de microdiálisis para recoger ISF a través de sondas de microdiálisis con 1.000 membranas de corte kDa.

Protocolo

Todos los estudios en animales fueron revisados y aprobados por el cuidado institucional de Animal y uso de la escuela graduada de medicina en la Universidad de Tokio.

1. pre-quirúrgico

1. Antes de comenzar la cirugía, limpie todo con etanol al 70% para mantener las condiciones estériles. Se recomienda el apoyo térmico utilizando una almohadilla de calefacción.
2. Anestesiar los ratones por inyección intraperitoneal de hidrato de cloral (400 mg/kg). Confirmar anestesia realizando una pizca del dedo del pie. Se recomienda el uso de meloxicam SR en la inducción y la buprenorfina recuperación oferta durante al menos 24 h.
3. Cepille el cabello con una recortadora quirúrgica. Fijar el ratón el ratón y el adaptador de rata neonatal utilizando barras de oídos y una pinza de nariz.
   Nota: Es crítico para asegurarse de que cabeza de ratón está asegurada en esta etapa y no mueve de lado a lado.
4. Aplique ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras esté bajo anestesia.

2. estereotáxicas cirugía para la implantación de cánula guía

1. Configurar el ratón y la rata neonatal el adaptador sobre el aparato estereotáxicas. Hacer sagittally una incisión en la piel sobre el cráneo con un bisturí.　Limpie la sangre y el tejido conectivo en el cráneo usando un hisopo de algodón húmedo.
2. Determinar la coordenada de la región cerebral de interés utilizando atlas del cerebro. Antes de iniciar las mediciones, asegúrese de que esa línea media es recta de modo que el pedacito de taladro puede ser movido A P y en la sutura de la línea media todo el tiempo.
   Nota: Este artículo utiliza la coordenada (A / P:-3,10 mm, M/L:-2,50 mm, D/V:-1,20 mm, 12 grados) a hipocampo posterior.
3. Nivel cráneo A-p
   1. Coloque un taladro en un manipulador de marco estereotáxicas. Baje la broca hasta que toque suavemente lambda y registrar sus coordenadas ventral. Repita este procedimiento para bregma.
      Nota: Cuando se nivela el cráneo, la medida vertical de vértice es igual a la de lambda. Si no, ajustar en consecuencia la altura de la abrazadera de la nariz. Después de que el cráneo es nivelado, grabar la coordenada anterior/posterior, lateral de bregma.
4. Nivel cráneo de izquierda a derecha
   1. Mueva el taladro del vértice a la coordenada (A / P:-3,10 mm, M/L: +2,0 mm), bajar el taladro en el cráneo y grabar la coordenada vertical. Repita este procedimiento para la coordenada (A / P:-3,10 mm, M/L:-2,00 mm).
      Nota: Si el cráneo está nivelado, estas mediciones verticales de dos puntos equidistantes de la línea media son iguales. Si no es así, ajuste la altura de las barras de oído.
5. Perfore un agujero de burr cuidadosamente en las coordenadas de destino (A / P:-3,10 mm, M/L:-2,50 mm) implantar una cánula guía. Si el diámetro de un orificio de trépano no es lo suficientemente grande como para una implantación de cánula guía, perfore otro agujero que coincide con el primero. Perfore otro agujero en el hueso parietal derecho (lado contralateral) e inserte un tornillo de hueso, que ayuda a garantizar el cemento dental en 1.10 (ver figura 1B).
6. Cortar una pieza cierre circular de la parte trasera de la tapa de un tubo de centrífuga de 1.5 mL por una cuchilla de afeitar y hacer una '' corona ''. Esta corona se utiliza para impedir la propagación a la piel de cemento dental. Colocar sobre el cráneo para que los agujeros de las rebabas en paso 2.5 mantenerse dentro del círculo (ver figura 1).
7. Establecer una Asamblea estereotáctica por colocarle una cánula guía el brazo más corto de un adaptador estereotáxicas y fijarlo con una tuerca ciega. Coloque el brazo más largo del adaptador estereotáctica en la pinza de electrodo. Fije en el manipulador del aparato estereotáctica (ver figura 1A).
8. Gire el conjunto de stereotax D-V en el brazo del manipulador por 12 grados (ver figura 1B). Hacia la cánula guía del orificio de trépano en 1.6. Inserte la cánula guía lentamente el cerebro mediante la reducción de 1,2 mm.
   Nota: El ángulo de la sonda es específico al hipocampo; otras regiones pueden requerir otros ángulos o sin ángulo en todo. Consultar un atlas del cerebro de coordenadas precisas. Secar la superficie del cráneo, porque si no el cemento no se pegue y tapa de cemento puede desplazarse
9. Agregue el cemento dental dentro de la corona completamente cubrir tanto la parte metálica de la cánula de la guía y el tornillo del hueso suficiente para asegurarlos. Aplique cemento dental adicional si hay una parte de cráneo expuesta.
10. Espere hasta que el cemento dental se seque totalmente (~ 12-20 min). Retire el adaptador estereotáctica de la abrazadera del electrodo. Retire la tuerca de la tapa y reemplace el adaptador estereotáxicas con un maniquí de prueba y sujetar la tuerca con sombrerete.
11. Suelte el ratón del aparato estereotáxicas y casa el ratón solo en una jaula individual.
    Nota: El ratón no se debe dejar desatendido hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. Compruebe el ratón todos los días hasta el día de microdiálisis. El ratón recibe AINE como carprofen si parece que está en el dolor. Espera 2 semanas es necesaria para estudios de sueño y vigilia así el ratón habituates al nuevo ambiente¹⁰, pero otros tipos de estudios pueden requerir períodos de recuperación más cortos (por ejemplo, 1-2 días).

3. Microdialysis configuración

1. Control de calidad de las puntas de prueba: Llene una jeringa desechable de 1ml con agua destilada waterand lo conecte a la salida (puerto menor) de una sonda con un tubo byton. Cubra los orificios de ventilación con los dedos y presione el émbolo de la jeringa suavemente para infundir el agua a la sonda. Compruebe que el agua aparece desde la entrada de la sonda y hay no hay fugas en la superficie de una membrana de microdiálisis.
   1. Activación de las sondas: sumerja las membranas de una sonda en etanol (70-100%) durante dos segundos. Luego, incorporar agua destilada en la sonda otra vez con una jeringa otra vez.
2. Preparación de buffer de perfusión: con el fin de evitar la adherencia de moléculas Diana para los tubos, añadir BSA por diluir la solución de BSA de 30% al 4% con LCR artificial (1,3 mM CaCl₂, 1,2 mM MgSO₄, 3 mM KCl, 0,4 mM KH₂PO₄, 25 mM NaHCO₃ , 122 m m NaCl, pH = 7.35), que parezca a concentración del electrólito en el LCR, inmediatamente antes del uso. El búfer de perfusión a través de una unidad de filtro de jeringa con 0.1 μm tamaño de poro del filtro.
   Nota: 4% BSA mejora la recuperación para pegar proteínas pero puede limitar severamente la entrega de compuestos, especialmente para compuestos que tienen alta Unión a BSA. Esta es una de las ventajas de utilizar la menor concentración de BSA (como 0,15%) en algunos casos³. Tenga en cuenta que BSA puede Agregar muy fácilmente cuando agitado por vortex o remover la placa. Estos agregados pueden obstruir las sondas o los poros de la membrana. Tenga cuidado al preparar una solución de BSA para limitar esta agregación
3. Preparar dos líneas separadas de entrada y salida (ver figura 1) y conectar ambas líneas con una aguja de conexión. Llene una jeringa desechable de 3 mL con buffer de perfusión y conectar con el extremo de entrada de la tubería utilizando una aguja Roma-final. Llenar el tubo entero con tampón de perfusión mediante la ejecución de la bomba de jeringa.
4. Parar la bomba de jeringa y vuelva a colocar la aguja de la conexión entre entrada y salida de línea con una sonda de microdiálisis activados en el paso 3.3 (ver figura 1). Antes de este reemplazo, coloque la tuerca de tapa en la punta de prueba.
5. Monte el tubo del rodillo en el tubo de salida de la bomba de rodillo. Iniciar la bomba de la jeringuilla a 10 μl/min y luego la bomba de rodillos en el caudal un poco más lento (9,8 9,5 μl/min). Asegúrese de quitar todas las burbujas de aire en el tubo entero, que puede influir en la recuperación cuando introduce la sonda.
6. Anestesiar el ratón de paso 1.12 de la misma manera como en el paso 1.2. Poner el collar de ratón alrededor de su cuello. Retire la tuerca de la tapa y la sonda dummy y lentamente Inserte una sonda de microdiálisis de 3.4 a través de la cánula guía y sujetar la tuerca con sombrerete.
7. Lugar el ratón en la jaula conectada a un sistema de movimiento libre y traba el mouse con el collar. Mantener funcionando la bomba de jeringa y la bomba de rodillo el caudal indicado en el paso 3.5 para al menos 1 h.
   Nota: Para conseguir la colección de ISF de animales despiertos, este artículo utiliza un sistema de movimiento libre, donde la jaula sí mismo responde al movimiento de un animal para mantener tubos de torsión. Alternativamente, líquidos giratorios disponibles de varias compañías pueden también ser utilizados.
8. Parada del rodillo de la bomba primero y luego la bomba de jeringa. Fijar el caudal deseado. Ejecute la jeringa bomba 20% más rápido que la bomba de rodillo.
   Nota: por ejemplo, si ejecuta a 1 μl/min, funciona la bomba de jeringa en 1.2 μl/min caudal óptimo debe determinarse empíricamente para cada molécula.
9. Recoger muestras ISF: Coloque el extremo libre del tubo de salida en el colector de fracciones refrigerados.
   Nota: Volumen de muestra apropiado varía en función de análisis utilizados para el análisis.
10. Después de la terminación del experimento, retire la sonda. (Anestesiar el ratón según sea necesario).  Manejar recuperación de ratón al igual que en el paso 2.11. Análisis de la ISF recogida por métodos tales como HPLC o ELISA.
11. Para lavar la tubería entera después de microdiálisis, conecte la entrada y tubos de salida otra vez mediante la sustitución de la sonda con la conexión de la aguja y ejecutan el blanqueador diluido en el tubo entero y luego lavarlo con agua. Seque y almacene para uso repetido.
    Nota: Otros tipos de tuberías son aceptables, sin embargo, BSA en tampón de perfusión puede obstruir los tubos con pequeño diámetro, por lo tanto estos tubos se consideran como de un solo uso. Los tubos pueden ser usados o tapado después de múltiples usos, así que asegúrese de que el caudal es constante cada vez que lo use.

Resultados

Para estimular o inhibir la actividad neuronal en la microdiálisis reversa^11,12,13, picrotoxin, antagonista de los receptores GABA_A o tetrodotoxina, blocker del canal del Na⁺ se han utilizado. Se ha demostrado que liberación de tau es estimulada por el aumento de la actividad neuronal^13,14. Consistente con estas obse...

Discusión

Microdialysis con alto peso molecular cortado las membranas tiene que ser operado por un modo de vaivén, por lo tanto es fundamental que el caudal es constante y precisa. La inexactitud en las tasas de flujo puede ser la causa de la generación de burbujas de aire y la inconsistencia en la concentración de la muestra. Si el flujo es incompatible, verifique todas las conexiones de salida. Si el problema persiste, puede ser necesario volver a empezar con nuevas sondas y tubos.

Sondas Microdilaysi...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
El Micromuestreador Univentor 820	Univentor	8303002	Colector de fracciones refrigerado
Bomba de jeringa	KD scientific	KDS-101
Bomba de rodillos	Eicom Microdiálisis	ERP-10
Raturn Sistema autónomo	BASi	MD-1409	Sistema de movimiento libre Kit de
jaula de doble especie	BASi	CX-1600
Sonda de microdiálisis AtmosLM (longitud del eje 8 mm, longitud de la membrana 2 mm)	Microdiálisis	Eicom PEP-8-02	La longitud del eje para una sonda, una guía, una sonda dumy y un adaptador estereotáxico debe ser idéntica.
Guía de microdiálisis (longitud del eje 8 mm)	Eicom microdiálisis	PEG-8
Sonda ficticia de microdiálisis (longitud del eje 8 mm)	Eicom microdiálisis	PED-8
Tornillo óseo	BASi	MD-1310
Super bond C& Conjunto B	Sunmedical		Cemento dental
Instrumento estereotáxico para animales pequeños con consola de visualización digital	Kopf	Modelo 940	Aparato estereotáxico
Ratón y rata neonatal	Adaptador Stoelting	51625
Barras de oreja estándar y puntas de goma para ratón Stoelting estereotáxico		51648
Solución de albúmina de suero bovino	Sigma	A7284-50ML	solución BSA al 30%
(70 cm)	Microdiálisis Eicom	JF-10-70	Volumen interno = 0,5 µ L/cm
Tubo de teflón (50 cm)	Microdiálisis Eicom	JT-10-50	Volumen interno = 0,08 µ L/cm
Tubo Byton	Microdiálisis Eicom	JB-30
Adaptador de puñalada Luer Intramedic 23G	BD	427565	Aguja roma
Tubo de rodillo	Microdiálisis Eicom	RT-5S	Volumen interno = 4 µ L
Tuerca ciega	Eicom microdiálisis	AC-5
0,25 mL Tubo de microcentrífuga con tapón	QSP	503-Q	Tubos para colector de fracciones
Adaptador esterotáxico (longitud del eje 8 mm)	Microdiálisis	Eicom PESG-8
Aguja de conexión	Microdiálisis Eicom	RTJ
Collar de animales para ratones	BASi	MD-1365
Kit de Micromotor Rotativo de Alta Velocidad	FOREDOM	K.1070	Taladro
Picrotoxina	Sigma	P1675
Destornillador para tornillos de
Bisturí
Hisopo
Cortapelos

Tubo FEP de huesode algodón quirúrgicos