En Vivo Sondas de microdiálisis método para recolectar grandes proteínas extracelulares de líquido intersticial cerebral con corte de peso molecular alto

Resumen

Microdiálisis in vivo ha permitido colección de moléculas presentes en el líquido intersticial del cerebro (ISF) de animales despiertos, comportarse libremente. Con el fin de analizar las moléculas relativamente grandes en ISF, el actual artículo se centra específicamente en el protocolo de microdialysis con sondas de alto peso molecular cortado de las membranas.

Resumen

Microdiálisis in vivo es una técnica poderosa para recoger ISF en despiertos, comportándose libremente animales basados en el principio de la diálisis. Aunque la microdiálisis es un método establecido que mide relativamente pequeñas moléculas como aminoácidos o neurotransmisores, se ha utilizado recientemente para evaluar también la dinámica de moléculas más grandes en ISF usando puntas de prueba con alto peso molecular cortado membranas. Al uso de estas sondas, microdialysis tiene que ejecutar en modo push-pull para evitar la presión acumulada dentro de las sondas. Este artículo proporciona protocolos paso a paso, incluyendo cirugía estereotáctica y cómo configurar líneas de microdiálisis para recoger las proteínas de la ISF. Durante microdialysis, drogas pueden administrarse ya sea sistémica o por infusión directa en ISF. Microdiálisis reversa es una técnica para incorporar directamente compuestos en ISF. Inclusión de medicamentos en el búfer de perfusión de microdiálisis permite que difunden en ISF a través de las sondas mientras recogía simultáneamente ISF. Mediante la medición de la proteína tau por ejemplo, el autor muestra cómo los niveles se alteran al estimular la actividad neuronal por microdiálisis reversa de picrotoxin. Ventajas y limitaciones de microdiálisis se describen junto con la solicitud extendida mediante la combinación de otros métodos en vivo .

Introducción

ISF consta de 15-20% del volumen total del cerebro y ofrece un microentorno crítico para la transducción de señales, transporte de substrato y separación de residuos¹. Por lo tanto, la capacidad de recogida de ISF de animales vivos proporcionará mayor implicaciones para diversos procesos biológicos como mecanismo de enfermedad. Microdiálisis in vivo es uno de los pocos métodos muestra y cuantificar moléculas extracelulares de ISF de despierto, moviendo libremente animales y de tal modo sirve como una herramienta útil en Neurociencias investigación campo^2,3. En este método, las ....

Protocolo

Todos los estudios en animales fueron revisados y aprobados por el cuidado institucional de Animal y uso de la escuela graduada de medicina en la Universidad de Tokio.

1. pre-quirúrgico

1. Antes de comenzar la cirugía, limpie todo con etanol al 70% para mantener las condiciones estériles. Se recomienda el apoyo térmico utilizando una almohadilla de calefacción.
2. Anestesiar los ratones por inyección intraperitoneal de hidrato de cloral (400 mg/kg). Confirmar anestesia realizando una pizca del dedo del pie. Se recomienda el uso de meloxicam SR en la inducción y la buprenorfina recuperación oferta durante al menos 24 h.
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Resultados

Para estimular o inhibir la actividad neuronal en la microdiálisis reversa^11,12,13, picrotoxin, antagonista de los receptores GABA_A o tetrodotoxina, blocker del canal del Na⁺ se han utilizado. Se ha demostrado que liberación de tau es estimulada por el aumento de la actividad neuronal^13,14. Consistente con estas obse.......

Discusión

Microdialysis con alto peso molecular cortado las membranas tiene que ser operado por un modo de vaivén, por lo tanto es fundamental que el caudal es constante y precisa. La inexactitud en las tasas de flujo puede ser la causa de la generación de burbujas de aire y la inconsistencia en la concentración de la muestra. Si el flujo es incompatible, verifique todas las conexiones de salida. Si el problema persiste, puede ser necesario volver a empezar con nuevas sondas y tubos.

Sondas Microdilaysi.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
El Micromuestreador Univentor 820	Univentor	8303002	Colector de fracciones refrigerado
Bomba de jeringa	KD scientific	KDS-101
Bomba de rodillos	Eicom Microdiálisis	ERP-10
Raturn Sistema autónomo	BASi	MD-1409	Sistema de movimiento libre Kit de
jaula de doble especie	BASi	CX-1600
Sonda de microdiálisis AtmosLM (longitud del eje 8 mm, longitud de la membrana 2 mm)	Microdiálisis	Eicom PEP-8-02	La longitud del eje para una sonda, una guía, una sonda dumy y un adaptador estereotáxico debe ser idéntica.
Guía de microdiálisis (longitud del eje 8 mm)	Eicom microdiálisis	PEG-8
Sonda ficticia de microdiálisis (longitud del eje 8 mm)	Eicom microdiálisis	PED-8
Tornillo óseo	BASi	MD-1310
Super bond C& Conjunto B	Sunmedical		Cemento dental
Instrumento estereotáxico para animales pequeños con consola de visualización digital	Kopf	Modelo 940	Aparato estereotáxico
Ratón y rata neonatal	Adaptador Stoelting	51625
Barras de oreja estándar y puntas de goma para ratón Stoelting estereotáxico		51648
Solución de albúmina de suero bovino	Sigma	A7284-50ML	solución BSA al 30%
(70 cm)	Microdiálisis Eicom	JF-10-70	Volumen interno = 0,5 µ L/cm
Tubo de teflón (50 cm)	Microdiálisis Eicom	JT-10-50	Volumen interno = 0,08 µ L/cm
Tubo Byton	Microdiálisis Eicom	JB-30
Adaptador de puñalada Luer Intramedic 23G	BD	427565	Aguja roma
Tubo de rodillo	Microdiálisis Eicom	RT-5S	Volumen interno = 4 µ L
Tuerca ciega	Eicom microdiálisis	AC-5
0,25 mL Tubo de microcentrífuga con tapón	QSP	503-Q	Tubos para colector de fracciones
Adaptador esterotáxico (longitud del eje 8 mm)	Microdiálisis	Eicom PESG-8
Aguja de conexión	Microdiálisis Eicom	RTJ
Collar de animales para ratones	BASi	MD-1365
Kit de Micromotor Rotativo de Alta Velocidad	FOREDOM	K.1070	Taladro
Picrotoxina	Sigma	P1675
Destornillador para tornillos de
Bisturí
Hisopo
Cortapelos

Tubo FEP de huesode algodón quirúrgicos