Análisis cuantitativo de empalmes alternativos del Pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón usando análisis de ARN In Situ hibridación

Xuan Guo; Yiqing Zhao; Hieu Nguyen; Tonghua Liu; Zhenghe Wang; Hua Lou

doi:10.3791/57889

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Artículo de método

Análisis cuantitativo de empalmes alternativos del Pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón usando análisis de ARN In Situ hibridación

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DOI:

10.3791/57889

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26 de agosto de 2018

Xuan Guo¹^,² , Yiqing Zhao¹^,³ , Hieu Nguyen¹ , Tonghua Liu² , Zhenghe Wang¹^,³ , Hua Lou¹^,³^,⁴

¹Department of Genetics and Genome Sciences, Case Western Reserve University, ²Department of Endocrinology, Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine, ³Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University, ⁴Center for RNA Science and Therapeutics, Case Western Reserve University

En este artículo

Resumen

Se describe un protocolo en situ hibridación (ISH) que utiliza oligonucleótidos antisentidos corto para detectar patrones de splicing alternativo del pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón.

Resumen

Empalme alternativo (AS) ocurre en más del 90% de genes humanos. El patrón de expresión de un exón alternativamente empalmado a menudo está regulado de manera específica de tipo celular. COMO expresión patrones típicamente son analizados por RT-PCR y RNA-seq con muestras de RNA aislados de una población de células. In situ examen de como patrones de la expresión de una particular estructura biológica puede realizarse por el RNA en situ hibridación (ISH) utilizando sondas exón específico. Sin embargo, este uso particular del ISH ha sido limitada porque exones alternativos son generalmente demasiado cortos para el diseño de sondas exón específico. En este informe, el uso de BaseScope, una tecnología recientemente desarrollada que emplea cortos oligonucleótidos antisentidos en ARN ISH, se describe a analizar como patrones de la expresión en secciones de cerebro de ratón. Exón 23a de neurofibromatosis tipo 1 (Nf1) se utiliza como ejemplo para ilustrar que corta exón-exón cruce sondas exhiben señales de hibridación robusto con alta especificidad en el análisis de ARN ISH en secciones de cerebro de ratón. Más importante aún, las señales detectadas con exón específico inserción y saltar las puntas de prueba pueden utilizarse para calcular fiablemente el porcentaje empalmado en los valores de expresión de 23a exón de Nf1 en diferentes áreas anatómicas del cerebro de un ratón. Presentan el protocolo experimental y el método de cálculo para análisis. Los resultados indican que BaseScope proporciona una nueva herramienta poderosa para evaluar como los patrones de expresión en situ.

Introducción

Empalme alternativo (AS) es un proceso común que ocurre durante la maduración del pre-mRNA. En este proceso, un exón puede incluirse diferencialmente en el mRNA maduro. Así, a través de AS, un gen puede generar mRNAs muchos ese código para productos diferentes de proteínas. Se estima que 92 – 94% de los genes humanos sufrir splicing alternativo del¹^,². Alternativa anormal empalme patrones resultado de mutaciones genéticas se han ligado a un gran número de enfermedades, como esclerosis lateral amiotrófica, distrofia miotónica, cáncer³^,⁴. Por lo tanto es....