Tejido adiposo blanco (WAT) tiene deficiencias importantes en sus modelos actuales de cultivo primario, que obstaculizan el desarrollo farmacológico y estudios metabólicos. Aquí, presentamos un protocolo para producir un sistema microphysiological adiposo WAT bocadillo entre las hojas de las células estromales. Esta construcción proporciona una plataforma estable y adaptable para cultivo primario de WAT.
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Artículo de método
Una plataforma de Microphysiologic de grasa humana: intercala tejido adiposo blanco
En este artículo
Resumen
Resumen
Tejido adiposo blanco (WAT) desempeña un papel crucial en la regulación de la salud peso y todos los días. Sin embargo, existen importantes limitaciones a los modelos disponibles en cultivo primario, que no han podido recapitular el microambiente adiposo fielmente o extender la viabilidad WAT más de dos semanas. La falta de un modelo de cultura primaria confiable impide severamente investigación en WAT metabolismo y desarrollo de medicamentos. Para ello hemos utilizado estándares de NIH de un sistema de microphysiologic para desarrollar una nueva plataforma para cultivo primario WAT llamado 'SWAT' (tejido adiposo blanco intercalado). Vencemos la flotabilidad natural de los adipocitos intercalando picada WAT racimos entre las hojas de células estromales derivadas del adiposo. En esta construcción, WAT las muestras son viables después de ocho semanas en la cultura. SWAT mantiene el ECM intacta, contactos célula a célula y las presiones físicas de en vivo las condiciones WAT; Además, SWAT mantiene un perfil transcripcional robusto, sensibilidad a la señalización química exógena y función del tejido entero. SWAT representa un método simple, reproducible y eficaz de cultivo primario de adiposo. Potencialmente, es una plataforma ampliamente aplicable para la investigación en fisiología, Fisiopatología, metabolismo y desarrollo farmacéutico de WAT.
Introducción
Tejido adiposo es el órgano principal de la obesidad, que lleva los costos médicos anuales directos entre $ 147 billones y $ 210 billones en los Estados Unidos1. La acumulación de tejido adiposo contribuye también a otras causas de muerte tales como enfermedad cardíaca, tipo diabetes II y ciertos tipos de cáncer2. Modelos de cultivo in vitro son esenciales para los estudios metabólicos y de desarrollo de fármacos, pero modelos actuales de la investigación del tejido adiposo tienen deficiencias importantes. Adipocitos son frágiles, boyante y células que no se adherirán a los plásticos de la cultura de célula y po....
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Protocolo
Todas las tareas se realizaron en adhesión a protocolos 8759 # y #9189, aprobado por la oficina de LSUHSC-NO. de IRB Animal todo el trabajo se realizó en adhesión a protocolo #3285 aprobado por la oficina de IACUC LSUHSC-NO.
1. siembra de intercalando hojas de células
Nota: Vea la figura 1.
- Semilla ADSCs en aproximadamente 80% de confluencia en las placas de cultivo de tejidos (6 cm o placas de 6 pocillos). Para cada pocillo de SWAT deseado, semillas 1 cultivo convencional de tejidos bien y 1 pozo del tamaño correspondiente en la placa de plástico recubierto de poly(N-isopr....
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Resultados
Inicialmente se evaluó la viabilidad de SWAT por brightfield serial proyección de imagen de los racimos individuales de WAT (n = 12) durante aproximadamente 7,6 semanas. Grupos seguía siendo seguros en lugar de la monocapa en todo este tiempo. Se observaron ligeros cambios morfológicos con adipocitos individuales combarse ligeramente o cambiar posiciones. Sin embargo, adipocitos ni ser multiloculares con el tiempo, lo que indica una falta de diferenciación, ni presentan signos visibles de.......
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Discusión
Este protocolo detalla el uso de ADSCs humano tejido adiposo blanco sandwich; líneas de celulares ADSC humanas pueden ser aisladas mediante protocolos bien establecidos15. Sin embargo, el sistema puede ser adaptado para los requisitos de la investigación individualizada (como el uso de las células 3T3L-1 ratón emparedado WAT). Este proceso implica el manejo primario del tejido humano. Deben emplearse precauciones de seguridad estándar; manejar los tejidos humanos como BSL-2 patógenos (p. ej., .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean reconocer el apoyo institucional de LSU Health Sciences Center, que financió el proyecto.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10x HBSS | Thermofisher | 14185052 | |
| Gelatina | Sigma-aldrich | G9391 | |
| Colagenasa | Sigma-aldrich | C5138 | |
| Adenosina | Sigma-aldrich | A9251 | |
| DMEM | Thermofisher 11995065 | ||
| M199 Media | Thermofisher 11043023 | Fenol sin rojo | |
| 250 y micro; m Filtro de malla | Pierce | 87791 | |
| 0.2 µ m Jeringa Filtro | Celltreat | 229747 | |
| 5 mL jeringas Luer-Lok | BD | 309646 | |
| Arandelas de | Estas son arandelas de metal simples y se pueden comprar en cualquier ferretería. Simplemente añaden peso ligero a la parte posterior de los tapones para garantizar un contacto uniforme entre las células y la gelatina, a la vez que son fáciles de almacenar y esterilizar. Masa aproximada: 6,3 g | ||
| Name | >Company | Número de catálogo | Comentarios |
| >Equipo calefactado | |||
| Incubado Agitador orbital | VWR | 10020-988 | Las muestras deben colocarse en un ángulo de 45° para facilitar la digestión de la colagenasa |
| Bloque de calor | Establecer en 37-40 ° C y se coloca debajo | ||
| del baño | ajustado a ~ 75 & deg; C | ||
| Nombre | Company | >Número de catálogo | Comentarios |
| Specialized Plastics | |||
| Upcell Platos 6cm de Nunc de 6 pocillos múltiples | 174902 o 174901 | Se trata de placas recubiertas de pNIPAAm disponibles comercialmente que se pueden utilizar para hacer crecer la lámina superior de ADSC. Alternativamente, las placas recubiertas de pNIPAAm se pueden producir en el laboratorio. Diámetro: < 6 cm para plato de 6 cm, < 3,5 cm para placa de 6 pocillos; Masa aproximada: 6,7 g para un plato de 6 cm, 5,1 g para un plato de 6 pocillos | |
| Aparato de émbolo de | Estos se pueden diseñar para que se ajusten a los plásticos recubiertos de pNIPA deseados (placas de varios pocillos, placas de Petri). Están formados por un tallo simple unido a un disco circular. Pueden ser producidos en el laboratorio o en cualquier instalación que pueda fabricar plásticos acrílicos |
Referencias
- Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity: An instrumental variables approach. Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).
- Pi-Sunyer, X. The Medical Risks of Obesity. Postgraduate Medicine. 121 (6), 21-33 (2009).
- Smith, U.
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