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Artículo de método

Una plataforma de Microphysiologic de grasa humana: intercala tejido adiposo blanco

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DOI:

10.3791/57909

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15 de agosto de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center

En este artículo

Resumen

Tejido adiposo blanco (WAT) tiene deficiencias importantes en sus modelos actuales de cultivo primario, que obstaculizan el desarrollo farmacológico y estudios metabólicos. Aquí, presentamos un protocolo para producir un sistema microphysiological adiposo WAT bocadillo entre las hojas de las células estromales. Esta construcción proporciona una plataforma estable y adaptable para cultivo primario de WAT.

Resumen

Tejido adiposo blanco (WAT) desempeña un papel crucial en la regulación de la salud peso y todos los días. Sin embargo, existen importantes limitaciones a los modelos disponibles en cultivo primario, que no han podido recapitular el microambiente adiposo fielmente o extender la viabilidad WAT más de dos semanas. La falta de un modelo de cultura primaria confiable impide severamente investigación en WAT metabolismo y desarrollo de medicamentos. Para ello hemos utilizado estándares de NIH de un sistema de microphysiologic para desarrollar una nueva plataforma para cultivo primario WAT llamado 'SWAT' (tejido adiposo blanco intercalado). Vencemos la flotabilidad natural de los adipocitos intercalando picada WAT racimos entre las hojas de células estromales derivadas del adiposo. En esta construcción, WAT las muestras son viables después de ocho semanas en la cultura. SWAT mantiene el ECM intacta, contactos célula a célula y las presiones físicas de en vivo las condiciones WAT; Además, SWAT mantiene un perfil transcripcional robusto, sensibilidad a la señalización química exógena y función del tejido entero. SWAT representa un método simple, reproducible y eficaz de cultivo primario de adiposo. Potencialmente, es una plataforma ampliamente aplicable para la investigación en fisiología, Fisiopatología, metabolismo y desarrollo farmacéutico de WAT.

Introducción

Tejido adiposo es el órgano principal de la obesidad, que lleva los costos médicos anuales directos entre $ 147 billones y $ 210 billones en los Estados Unidos1. La acumulación de tejido adiposo contribuye también a otras causas de muerte tales como enfermedad cardíaca, tipo diabetes II y ciertos tipos de cáncer2. Modelos de cultivo in vitro son esenciales para los estudios metabólicos y de desarrollo de fármacos, pero modelos actuales de la investigación del tejido adiposo tienen deficiencias importantes. Adipocitos son frágiles, boyante y células que no se adherirán a los plásticos de la cultura de célula y por lo tanto no pueden ser cultivadas utilizando métodos de cultivo celular convencionales terminalmente diferenciadas. Desde la década de 1970, varios métodos se han utilizado en los intentos de superar estas barreras, incluyendo el uso de cubreobjetos de vidrio, techo cultura, cultura de suspensión y matrices extracelulares3,4,5, 6 , 7. sin embargo, estos métodos han sido marcados por la muerte de la célula y diferenciación, y se suelen usar para nada más que un periodo de dos semanas de estudio. Por otra parte, estos modelos no tratan de recapitular el microambiente adiposo nativo ya no sostienen el ECM intacto, las interacciones entre los adipocitos y stromal células de apoyo, ni las fuerzas contráctiles células ejercen sobre otros en en vivo WAT.

En la ausencia de un método estándar de oro en cultivo primario adiposo, investigación adiposo ha confiado principalmente en los adipocitos pre diferenciadas (diffAds). DiffAds son multiloculares, adherente y metabólicamente activo. Por el contrario, adipocitos blancos primarios son uniloculares, nonadherent y demuestran metabolismo relativamente baja. El fracaso de los modelos actuales de cultura adiposo para recapitular la fisiología del tejido adiposo maduro sano es probablemente un factor importante en la ausencia de medicamentos aprobados por la FDA que directamente adipocitos. De hecho, la falta de modelos de órganos fisiológicos en vitro es un problema importante en la mayoría de los órganos y la enfermedad.

En su documento de posición anunciando la creación de su programa de Microphysiological Systems (MPS), los institutos nacionales de salud (NIH) informó que la tasa de éxito de 2013 a través de todos los ensayos clínicos farmacéuticos humanos era sólo 18% para la fase II y 50% para la fase III ensayos clínicos8. El programa MPS está diseñado para abordar directamente la imposibilidad de fisiología humana modelo de monocultivo en vitro . El NIH define MPSs como sistemas de cultivo conformados por primaria humano o células madre en multicelulares construcciones 3D que recapitulan el funcionamiento del órgano. A diferencia de los modelos reduccionistas de cultivos de células homogéneas, inmortalizado, MPSs deben modelar con precisión la célula, célula de drogas, fármacos y fármacos órgano interacciones9. A diferencia de los métodos de cultivo primario a corto plazo, normas NIH exigen sostenibilidad MPS durante 4 semanas en cultura8. Pueden encontrar más detalles sobre el programa MPS en los NIH AFR (#RFA-TR-18-001)10.

Hemos desarrollado una novela simple, adaptable, y MPS adiposo barato llamado "tejido adiposo blanco intercalada" (SWAT)11. Vencemos la flotabilidad natural de los adipocitos por "bocadillo" picada el principal tejido adiposo entre las hojas de células del estroma adiposo derivados (ADSCs) (figura 1). La construcción resultante 3D recapitula el contacto célula-célula y el microambiente adiposo nativo rodeando adipocitos maduros con una población de célula de soporte natural del adipocito. SWAT ha sido validado por demostrar viabilidad de 8 semanas, respuesta a la señalización, la secreción de adipoquinas y engraftment en un modelo animal exógena.

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Protocolo

Todas las tareas se realizaron en adhesión a protocolos 8759 # y #9189, aprobado por la oficina de LSUHSC-NO. de IRB Animal todo el trabajo se realizó en adhesión a protocolo #3285 aprobado por la oficina de IACUC LSUHSC-NO.

1. siembra de intercalando hojas de células

Nota: Vea la figura 1.

  1. Semilla ADSCs en aproximadamente 80% de confluencia en las placas de cultivo de tejidos (6 cm o placas de 6 pocillos). Para cada pocillo de SWAT deseado, semillas 1 cultivo convencional de tejidos bien y 1 pozo del tamaño correspondiente en la placa de plástico recubierto de poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm) cultivo de tejidos.
    Nota: En consecuencia, una placa de 6 pozos de SWAT requieren de siembra de células en una placa de cultivo de tejidos estándar 6-pozo (capa base) y una placa de 6 pozos recubiertos de pNIPAAm cultivo de tejidos (capa superior). las placas revestidas de pNIPAAm pueden adquirirse comercialmente o producción en el laboratorio12,13,14.
  2. Mantener ADSCs en 37 ° C y 5% CO2 en de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con 10% FBS y 1 x penicilina/estreptomicina. Cambiar el medio cada 2 días.
  3. Permitir que las células se aglutinan hasta que se convierten en 100% confluente y tomar en un patrón estriado (aproximadamente 6-8 días).
    Nota: Estas células se necesitan funcionar como una hoja sola célula intacta para estabilizar el tejido adiposo boyante. Las células insuficientemente confluentes se fragmentan en siembra con WAT.

2. preparación de suministros SWAT

  1. Preparar varias alícuotas de 10 mL de 1 x madeja equilibrado sal solución (HBSS); preparar suficiente para el número de las placas con volumen de sobra.
  2. Preparar el aparato de émbolo para la siembra de SWAT. Construir el émbolo utilizando plásticos de acrílico simple, conformados de un vástago conectado a un disco redondo. Asegurar que se ajuste a la circunferencia de los pocillos de cultivo de tejidos (diámetro: < 6 cm para plato de 6 cm, < 3,5 cm de placa de 6 pozos, masa aproximada: 6,7 g para un plato de 6 cm, 5,1 g de una placa de 6 pozos).
    1. Preparar elementos adicionales para asegurar que el procedimiento funcionará sin problemas en caso que hay un problema con cualquier émbolo individual.
    2. Coloque cinta de laboratorio alrededor del borde del disco de émbolo, por lo menos 2 x, para evitar la fuga de solución de gelatina.
    3. Rocíe un gabinete de seguridad biológica (BSC) con 70% EtOH. Aerosol hacia abajo de un estante de tubo cónico de 15 mL dentro del BSC con tubos cónicos de 15 mL de vacío, sin la tapa; tubos ayudará a garantizar la colocación de los émbolos de gelatina.
    4. Rocíe completamente cada émbolo envueltos en cinta con 70% EtOH y el lugar en un tubo cónico de 15mL en el estante. Rociar las arandelas de metal (masa aproximada de 6,3 g) y colocarlos en la bandeja junto con un par de pinzas de gancho; las arandelas de añadir peso a los émbolos durante la siembra de SWAT.
    5. Cierre la hoja BSC y encienda la UV luz para facilitar el secado y la esterilización.
      Nota: Lo ideal es realizar este paso 24 h antes de la siembra de SWAT. Por otra parte, dirigir el proceso en el día de siembra de colección/SWAT de tejido; sin embargo, que en este caso, 15 – 45 min de UV de secado o esterilización.

3. preparación de gelatina émbolos: aplicación a las hojas de la célula superior

  1. Calentar un baño de agua a 75 ° C.
  2. Preparar la solución de gelatina agregando 0,75 g de polvo de la gelatina a stock 10 mL de 1 x HBSS. Bajo una campana de humos, añada 100 μl de 1 M NaOH para equilibrar el pH de la solución.
    1. Agregar a las existencias de 10 mL para el baño de agua y agitar vigorosamente cada 5 min hasta que el polvo se disuelva en la solución. Objetivo es disolver la gelatina en polvo pronto después de agregar en la bañera de agua caliente.
    2. Encienda el ventilador BSC, apagar la luz UV y levante la hoja. La superficie de BSC y preparar el filtro de insumos (jeringas de luer-lock de 5 mL y filtros de jeringa de 0,2 μm). Preparar varios filtros para filtrar eficientemente volúmenes suficientes de gelatina para aplicar a los émbolos.
  3. Cuando la solución de gelatina alcanza una consistencia homogénea, filtrar la solución y aplicarla a los émbolos. Cargar la jeringa con gelatina. Aplicar la gelatina a los émbolos de plástico a través del filtro de la jeringuilla (~2.5 mL para una placa de 6 pozos, ~4.5 mL para un plato de 6 cm) y dejar para solidificar (~ 20 min).
  4. Una vez que la gelatina es sólida, desenrolle la cinta desde el borde de los émbolos. Con pinzas de gancho, quite la gelatina del borde exterior del émbolo (es decir, los bordes levantados del menisco). Asegurar que la gelatina restante en el centro del émbolo esté totalmente nivelada para maximizar el contacto con la hoja de la ADSC.
  5. Una vez que se quita exceso gelatina, aplique suavemente los émbolos de gelatina a las placas de la ADSC pNIPAAm-revestida. Utilice las arandelas de metal para pesar abajo el émbolo. No corte hojas de célula mientras aplica los émbolos.
  6. Deja los émbolos en las hojas de la célula durante 1,5 h a temperatura ambiente. Incubar las placas/émbolos en un baño de agua helada durante 1,5 h a la completa disociación de la capa celular de la superficie de la placa revestida de pNIPAAm.
    1. Tenga cuidado al mismo tiempo de incubación en el baño de hielo; No permita que el baño de hielo contaminar los medios de comunicación de la célula durante la incubación.
    2. Después de completar la incubación, limpiar la parte inferior de las placas pNIPAAm-revestida para eliminar el agua no estéril.

4. blanca procesamiento de tejido adiposo

  1. Al recoger el tejido adiposo humano de la sala de operaciones, mantener las muestras en un recipiente estéril que es sobre hielo hasta que SWAT es a ser sembradas. Agregar medios de mantenimiento estéril, como solución salina tamponada con fosfato (PBS), al contenedor de tejido adiposo para la estabilidad del tejido.
  2. Agregar celda fría medio de cultivo a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL para cada pozo/plato ser sembradas (100 μL para una placa de 6 pozos, 200 μL para un plato de 6 cm).
  3. Pique el tejido adiposo.
    1. Para los segmentos sólidos del tejido adiposo, haga lo siguiente.
      1. Lavar grandes segmentos de tejido adiposo 3 x en PBS estéril y quitar tanta PBS como sea posible.
      2. Groseramente picada tejido con pinzas y maquinilla de afeitar estéril y eliminar tanto vasculatura y fascia como sea posible (véase la discusión para más detalles).
      3. Finamente picada grasa con navaja hasta picada tejido toma consistencia espesa, líquida.
        Nota: Idealmente tejido aparece homogéneo con no visibles segmentos individuales de WAT aunque esto no siempre es posible.
    2. Proceso de lipoaspiración como sigue.
      1. En el BSC, cinta de gasa estéril sobre la parte superior de un vaso de precipitados y colocar este vaso en un vaso más grande para recoger el exceso de líquido.
      2. Con una pipeta serológica de 25 mL, dibujar tanto lipoaspiración según sea necesario y aplicarlo a la superficie de la gasa estéril. Aplicar el PBS directamente sobre esta superficie a lavar lipoaspirated grasa y para eliminar el exceso de sangre y residuos de lípidos.
      3. Utilice pinzas para recuperar tejido drenado, transferir a una superficie estéril de picar y picar la lipoaspiración.
  4. Utilizar una maquinilla de afeitar estéril para cortar el extremo distal de pipetas p1000 para transferir tejido picadito; Esto minimizará el esfuerzo cortante que puede llevar a la lisis del adipocito. Una vez que se alcanza una consistencia adecuada del tejido transferir el volumen de tejido picadito a cada tubo 1,5 mL (300-400 μL para placa de 6 pozos, 500 – 600 μL para plato de 6 cm). Mezcla había picada de WAT y los medios brevemente en los tubos.
  5. Toma de las placas base de la ADSC y aspirado decantar los medios de comunicación. Sustituir los medios de comunicación con la mezcla WAT/medios de cada tubo de 1,5 mL.
    1. Suavemente Retire los émbolos de la gelatina de las placas recubiertas de pNIPAAm y aplicarlos a la mezcla WAT en las placas base de la ADSC. Examinar la monocapa de las placas recubiertas de pNIPAAm bajo un microscopio para confirmar la separación celular.
  6. Establecer un bloque de calor a aproximadamente 37 – 40 ° C en el BSC. Con los émbolos en su lugar, hacia las placas de las superficie del bloque de calor. Añadir 2 – 3 mL de medios de cultivo calentados para incubar las células y facilitar la fusión de la gelatina.
  7. Después de 30 min, retire suavemente los émbolos de la superficie de la placa. Vuelva a colocar las tapas de las placas base de cultivo de tejidos y pasar a una incubadora de cultivo celular. Una vez la gelatina ha licuado completamente a 37 ° C, Aspire y reemplazar medios de cultivo celular.
  8. Mantener SWAT a 37 ° C y 5% CO2 en medio M199 sin rojo de fenol 7 insulina μm, dexametasona μm 30, 1 x penicilina/estreptomicina. Mantener en medios de aproximadamente 2 mL para placas de 6 pocillos y 3 mL en los platos de 6 cm. Cambiar el medio cada 2 días.

5. cosecha de SWAT

  1. Preparar la colagenasa (colagenasa de 0.5 mg/mL, la adenosina 500 nM, en PBS) alícuotas en tubos cónicos de 15 mL (volumen aproximado de 10 mL). Congelar los tubos y almacenar a-20 ° C.
  2. Aspirar cualquier medio de cultivo de células, lavar 1 x con PBS y luego aspirar PBS. Preparación de las alícuotas de colagenasa por descongelación en un baño de agua de 37 ° C.
    Nota: Idealmente, la solución de colagenasa llegará a 37 ° C; inmediatamente después, añadir el tejido.
  3. Añadir todo el tejido de la placa SWAT a las alícuotas individuales. Cosecha SWAT con un scrapper de célula estéril y transferirlo a las alícuotas de colagenasa con una punta de pipeta corte p1000. Agregue el tejido directamente en los tubos cónicos de 15 mL que contiene solución de colagenasa.
    1. Por otra parte, incubar la mezcla de tejido/colagenasa en un tubo cónico de 50 mL; la mayor área de superficie más facilitará la digestión enzimática.
  4. Colocar tubos de muestra en un agitador orbital incubado en un ángulo de 45°. Incubar a 200 rpm, a 37 ° C durante 30 – 60 min.
  5. Filtro de malla de 250 μm de lugar en un nuevo tubo cónico de 15 mL para recolección. Vierta la solución digerida adipocito a través del filtro.
    Nota: Esto permitirá que todas las células pasar a través de filtrado de tejido fibroso.
  6. Permiten paso a reposar 5 min a temperatura ambiente para permitir la separación de fases.
    Nota: Los adipocitos flotará en la parte superior de la solución mientras que las células del estroma adiposas (ASCs) resolverá en las fases inferiores. Centrifugación durante 5 min a 500 x g también puede maximizar la separación de células o cosecha alrededor de ADSCs en el sedimento.
  7. Usando una punta de pipeta corte p1000, transferir los adipocitos (la capa flotante en la parte superior de la solución de colagenasa) a un tubo de colección de microcentrífuga de 1,5 mL. Tomando 250 μl a la vez, pipeta lentamente a lo largo del borde del tubo para recoger los adipocitos.
    1. Girar el tubo lentamente mientras recogía los adipocitos para maximizar la recuperación de las células adheridas en el interior. Guardar dibujo más células hasta el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  8. Retire el exceso de líquido de los adipocitos aislados mediante una jeringa conectada a una aguja (~ 21). Sumergir la aguja debajo de la capa flotante del adipocito. Talle la aguja para desalojar las células adheridas al eje de la aguja y esperar que los adipocitos desalojados flotar en la parte superior.
  9. Sacar lentamente el exceso de líquido, teniendo cuidado de evitar la eliminación accidental de los adipocitos. Use graduaciones del tubo de microcentrífuga para aislar sistemáticamente volúmenes de muestra (por ejemplo,. 0,1 mL para cada muestra).
  10. Uso de las células aisladas para extracción de ADN/ARN, ensayo de absorción de glucosa, prueba de lipolisis, etc.

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Resultados

Inicialmente se evaluó la viabilidad de SWAT por brightfield serial proyección de imagen de los racimos individuales de WAT (n = 12) durante aproximadamente 7,6 semanas. Grupos seguía siendo seguros en lugar de la monocapa en todo este tiempo. Se observaron ligeros cambios morfológicos con adipocitos individuales combarse ligeramente o cambiar posiciones. Sin embargo, adipocitos ni ser multiloculares con el tiempo, lo que indica una falta de diferenciación, ni presentan signos visibles de...

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Discusión

Este protocolo detalla el uso de ADSCs humano tejido adiposo blanco sandwich; líneas de celulares ADSC humanas pueden ser aisladas mediante protocolos bien establecidos15. Sin embargo, el sistema puede ser adaptado para los requisitos de la investigación individualizada (como el uso de las células 3T3L-1 ratón emparedado WAT). Este proceso implica el manejo primario del tejido humano. Deben emplearse precauciones de seguridad estándar; manejar los tejidos humanos como BSL-2 patógenos (p. ej., ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean reconocer el apoyo institucional de LSU Health Sciences Center, que financió el proyecto.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10x HBSSThermofisher14185052
GelatinaSigma-aldrichG9391
ColagenasaSigma-aldrichC5138
AdenosinaSigma-aldrichA9251
DMEMThermofisher 11995065
M199 MediaThermofisher 11043023Fenol sin rojo 
250 y micro; m Filtro de mallaPierce87791
0.2 µ m Jeringa FiltroCelltreat229747
5 mL jeringas Luer-Lok BD309646
Arandelas deEstas son arandelas de metal simples y se pueden comprar en cualquier ferretería. Simplemente añaden peso ligero a la parte posterior de los tapones para garantizar un contacto uniforme entre las células y la gelatina, a la vez que son fáciles de almacenar y esterilizar. Masa aproximada: 6,3 g 
Name>CompanyNúmero de catálogoComentarios
>Equipo calefactado
Incubado Agitador orbitalVWR10020-988Las muestras deben colocarse en un ángulo de 45° para facilitar la digestión de la colagenasa
Bloque de calorEstablecer en 37-40 ° C y se coloca debajo
del bañoajustado a ~ 75 & deg; C
NombreCompany>Número de catálogoComentarios
Specialized Plastics
Upcell Platos 6cm de Nunc de 6 pocillos múltiples174902  o 174901Se trata de placas recubiertas de pNIPAAm disponibles comercialmente que se pueden utilizar para hacer crecer la lámina superior de ADSC. Alternativamente, las placas recubiertas de pNIPAAm se pueden producir en el laboratorio. Diámetro: < 6 cm para plato de 6 cm, < 3,5 cm para placa de 6 pocillos; Masa aproximada: 6,7 g para un plato de 6 cm, 5,1 g para un plato de 6 pocillos
Aparato de émbolo deEstos se pueden diseñar para que se ajusten a los plásticos recubiertos de pNIPA deseados (placas de varios pocillos, placas de Petri). Están formados por un tallo simple unido a un disco circular. Pueden ser producidos en el laboratorio o en cualquier instalación que pueda fabricar plásticos acrílicos
metal de agua del gabinete de bioseguridad plástico

Referencias

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