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Artículo de método

Proyección de imagen de células del TGF-β/Smad3 señalización vía In Vitro y In Vivo utilizando un Adenovirus reportero sistema en vivo

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DOI:

10.3791/57926

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30 de julio de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Surgery (RMH), University of Melbourne

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para obtener imágenes de células vivas de la actividad de señalización de TGF-β/Smad3 utilizando un adenovirus reportero sistema. Este sistema rastrea actividad transcripcional en tiempo real y puede ser aplicado a ambas células en vitro y en animales vivosmodelos.

Resumen

Transformación de Factor de crecimiento β (TGF-β) señalización regula muchas funciones importantes para la homeostasis celular y se encuentra comúnmente sobre expresa en muchas enfermedades, incluyendo cáncer. TGF-β está implicado fuertemente en metástasis durante la progresión del cáncer de etapa tardía, activando un subconjunto de las células del tumor invasivo y migratorias. Los métodos actuales de análisis de la vía de señalización se centran en modelos de punto final, que a menudo tratan de medir señales post-hoc del evento biológico y no reflejan la naturaleza progresiva de la enfermedad. Aquí, demostramos un adenovirus novela reportero sistema específico para la vía de señalización de TGF-β/Smad3 que puede detectar la activación transcripcional en células vivas. Utilizando un reportero Ad-CAGA12-Td-Tom , podemos lograr una tasa de infección del 100% de las células MDA-MB-231 dentro de 24 h in vitro. El uso de un reportero fluorescente permite la proyección de imagen de células vivas en tiempo real con identificación directa de las células transcripcionalmente activas. Estimulación de las células infectadas con TGF-β muestra sólo un subconjunto de las células que son transcripcionalmente activas y participan en funciones biológicas específicas. Este enfoque permite alta especificidad y sensibilidad a un nivel unicelular para mejorar la comprensión de las funciones biológicas relacionadas con TGF-β señalización en vitro. Smad3 actividad transcripcional puede ser también registrados en vivo en tiempo real a través de la aplicación de un Ad-CAGA12- Luc reportero. Ad-CAGA12- Luc puede medirse de la misma manera que las líneas celulares de luciferase estable transfected tradicional. Smad3 actividad transcripcional de las células implantadas en vivo se puede analizar a través de la proyección de imagen convencional de IVIS y seguimiento directo durante la progresión del tumor, proporcionando una visión única en la dinámica de la vía de señalización de TGF-β. Nuestro protocolo describe un sistema reportero ventajosa que permite proyección de imagen de alto rendimiento rápido de vías de señalización de células vivas in vitro e in vivo. Este método puede ser ampliado a una gama de análisis de imagen basado y presenta como un enfoque sensible y reproducible para la biología básica y desarrollo terapéutico.

Introducción

Factor de crecimiento de transformación β (TGF-β) es una citoquina fundamental implicado en el desarrollo humano que las señales a través de un complejo de tipo II heterodiméricos y tipo de receptores1. Unión a receptor II tipo resultados en el reclutamiento y la fosforilación del tipo I del receptor, que a su vez fosforila Smad2/3 aguas abajo proteínas de2,3. Estos activan bind Smad2/3 de proteínas a Smad4, formando un complejo que se transloca en el núcleo y regula la transcripción de gen4. Condiciones homeostáticas de TGF-β/Smad signaling es estrictamente regulado; sin embargo, en muchas enfermedades, la vía de señalización está desregulada y sobreexpresa con frecuencia conducen a la progresión de la enfermedad5,6,7. Estudios recientes han demostrado que la respuesta celular a TGF-β es heterogénea y subpoblaciones de células activadas TGF-β/Smad son responsables de la función biológica en una forma dependiente del tiempo8,9. Análisis celular común de señalización de TGF-β/Smad implica el uso de ensayos de punto final fijo que ofrecen sólo una instantánea de la actividad celular y con frecuencia cuantificar el promedio de efecto de TGF-β/Smad10. Estos métodos, sin embargo, pueden no exactamente representan el comportamiento molecular de señalización de TGF-β/Smad en el estado fisiológico durante la progresión de la enfermedad. Análisis basado en imágenes de células vivas capturar la dinámica de procesos celulares y biológicos con una comprensión espacial y temporal.

Nuestro objetivo fue desarrollar un método sensible de alto rendimiento para obtener imágenes de células vivas de TGF-β/Smad signaling reactivos basados en adenovirus. Aquí, estamos infectados por la línea de celular del cáncer de mama MDA-MB-231 con un adenovirus que expresan la secuencia de enlace de adorno de CAGA de Smad3 y luciferasa (Luc) o gen reportero de Td-tomate (Td-Tom). Adenoviral reportero sistemas proporcionan un método rápido y barato para la introducción de plásmidos que puede resultar en una tasa de infección del 100% en líneas celulares de cáncer. Sistemas de adenoviral reportero también se han aplicado con éxito a líneas celulares difíciles de transfectar con plásmido convencional11. En este protocolo se describe un proceso reproducible y no invasivo para obtener células vivas imágenes de la vía de señalización TGFβ/Smad tanto en vivo como en vitro.

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Protocolo

Todos los experimentos en animales fueron aprobados por la Universidad de Melbourne Comité de ética Animal.

Nota: El protocolo de secuencia, la construcción y la generación para el adenoviral vectores pAd-CMV-Td-Tom, pAd-CMV-GFP y pAd-CAGA12- Luc/Td-Tom se han descrito previamente11,12, 13. Los vectores están disponibles en el mercado.

1. virus título determinación utilizando dosis infectiva de cultivo de tejidos 50% (TCID50)

  1. Preparar 1 x 106 células de HEK293A en 10 mL de DMEM + 10% FBS media.
  2. Semilla 100 μl de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pozos de fondo plano.
  3. Preparar 1 mL de una dilución 1: 100 de stock de virus en el medio completo. Añadir 11 μl de virus diluido en cada pocillo de la columna 1.
  4. Realizar diluciones seriadas 10 veces directamente en la placa de la pozo 96 mezclando 11 μl de virus diluido con 100 μl de suspensión celular hasta la dilución final de 1 x10 se llega a12 . Aunque las células son no adherente en este momento, el número de células entre pozos permanece constante.
  5. Pipeta de 11 μl de cada dilución en cada columna a partir de la dilución más alta de 104. Vuelva a colocar las puntas de pipeta con cada dilución para limitar el cruce de partículas virales.
  6. Añadir 11 μl de medios libre de virus completo a la columna 12 como control negativo.
  7. Incubar la placa durante 7-10 días a 37 ° C con 10% CO2.
  8. Utilizando un microscopio, anotar el número de pozos en cada columna mostrando signos de efectos citopáticos o citotóxicos. Considerar un bien positivo si hay cualquier signo de infección.
  9. Calcular la fracción de pozos positivos de cada dilución con la Reed y Muench (1938) método estadístico14.
  10. Calcular la distancia proporcional (DP) utilizando: (A-50)/(A-B), donde A es la respuesta de porcentaje superior o igual al 50% y B es la respuesta de porcentaje por debajo del 50%.
  11. Calcular TCID50 uso: 10X-PD, donde X es la dilución dando una respuesta superior al 50%.
  12. Calcular el título viral de siguiente: 0,69 / (0.011 x TCID50) PFU/mL

2. adenovirus MOI determinación

  1. Semillas 1.0-1.5 x 105 MDA-MB-231 células con 500 μL de DMEM medios de cultivo que contiene 5% FBS en cada pozo de 12 bien la placa (confluencia celular 35%, 6 pozos en total).
  2. Calcular los volúmenes de stock Ad-CMV-Td-Tom para 0, 250, 500, 2500 y 5000 MOI utilizando las siguientes fórmula: MOI = (volumen [μL] x PFU/μL) / número de células. Ad-CMV-Td-Tom con un título de 1 x 1010 (PFU/mL), los volúmenes de la infección del virus requiere MOIs son 0, 3.75, 7.5, 37.5 y 75 μL respectivamente.
  3. Infectar las células con los volúmenes calculados de Ad-CMV-Td-Tom en la sección 2.2 transfiriendo directamente acciones virales en los pozos con mezcla completa.
  4. Coloque la placa en la incubadora a 37 ° C con 10% de CO2 durante 24 h.
  5. Quitar los medios de comunicación de los pozos y reparar inmediatamente las células con 500 μL de formalina al 10% durante 5 minutos.
  6. La formalina de los pozos de aspirar y lavar los pocillos con 500 μL de PBS una vez.
  7. Tiñen el núcleo de la célula con 500 μL de solución de Hoechst durante 5 minutos.
  8. Retirar la solución de Hoechst y lavar los pocillos con 500 μL de PBS 3 veces.
  9. Imagen la proteína Td-tomate y núcleo de la célula la señal de 200 aumentos en un microscopio de fluorescencia. Excitar la proteína Td-tomate a 554 nm y el tinte de Hoechst en 352 nm.
  10. Análisis de imágenes mediante ImageJ para determinar el funcionamiento que Moi necesario para 100% de infección de tomate Td15.

3. dual-adenovirus transducción en células vivas individuales

  1. Semillas 1.0-1.5 x 105 MDA-MB-231 células con 500 μL de DMEM medios de cultivo que contiene 5% FBS en cada pozo de 12 bien la placa (confluencia celular 35%, 2 pozos en total).
  2. Infectar células con 75 μL de Ad-CMV-GFP (título = 5 x 109 PFU/mL) y 7.5 μL de Ad-CAGA12-Td-Tom (título = 5 x 1010 PFU/mL) para obtener un MOI 2.500, que puede alcanzar el 100% de positividad de la infección.
  3. Tratar las células con o sin 0,25 μL de TGF-β por pozo (10 mg/mL en la acción, 5 ng/μL como la concentración final) inmediatamente después de la infección del adenovirus.
  4. Coloque la placa en la incubadora a 37 ° C con 10% de CO2 durante 24 h.
  5. Imagen en las células con el microscopio de fluorescencia contraste de fase. Excitar la GFP a 470 nm y proteína Td-tomate a 554 nm.
  6. Fijar las células y mancha el núcleo de las células como se describe en pasos 1.6 - 1.9.
  7. Imagen la proteína Td-tomate y Hoechst manchan usando un microscopio de fluorescencia. Excitar el tinte de Hoechst en 352 nm.
  8. ImageJ, calcular que el porcentaje de positivos GFP y Td-tomate células15.

4. viva sola célula de señalización en la cicatrización de heridas ensayo

  1. Semillas 4-5 x 105 MDA-MB-231 células con 1 mL de DMEM medios de cultivo que contiene 5% FBS en cada pozo de 6 bien la placa (confluencia del 50% de la célula, 2 pozos en total).
  2. Infectar las células con 22,5 μL de Ad-CAGA12-Td-Tom (título = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500).
  3. Coloque la placa en la incubadora a 37 ° C con 10% de CO2 durante 24 h.
  4. Rayar dos líneas cruzadas en la capa celular de cada pocillo utilizando una pipeta de P200.
  5. Retire los medios viejos pozos y reemplazar con 2 mL de dulce 5% media FBS con o sin 0,5 μL de TGF-β por pozo (10 mg/mL en la acción, 5 ng/μL como concentración final).
  6. Colocar la placa en la incubadora a 37 ° C con 10% de CO2 durante 5 minutos y tomar imágenes de zonas seleccionadas de la herida de 100 aumentos en un microscopio de contraste de fase.
  7. Coloque la placa en la incubadora a 37 ° C con 10% de CO2 durante 24 h.
  8. Tomar imágenes de la clausura de herida en las mismas zonas que antes.
  9. Fijar las células, núcleo de la célula de la mancha como se describe en pasos 1.6 - 1.9 y visualizar señal Td-tomate en el área de la herida y el área de la herida no de 200 aumentos en un microscopio de fluorescencia.
  10. Cuantificar el porcentaje de células positivas de Td y tomate en la herida y el área de la herida no utilizar ImageJ software15.

5. in Vitro ensayo de luciferasa

  1. Preparar una suspensión de 3-5 x 104 MDA-MB-231 células en 1 mL de medio DMEM que contenía 5% FBS.
  2. Infectar la suspensión celular con 2,5 μL de Ad-CAGA12- Luc (título = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500).
  3. Semilla de las células infectadas en un 96 placa bien a 3.000 células/100 μL/pocillo.
  4. Coloque la placa en la incubadora a 37 ° C con 10% de CO2 durante 24 h.
  5. Eliminar medios viejos pozos y reemplazar con 100 μl de fresco 5% SFB los medios de comunicación con o sin 0.1 μL de TGF-β por pozo (1 mg/mL en la acción, 1 ng/μL como la concentración final) y en la presencia o ausencia de 0.17 μL de inhibidor del TGF-β por pozo (7 mg/mL en stock 12 ng/μL como concentración final) (obra inédita una novela proteína TGF-β ligando trampa, Chen et al.,).
  6. Coloque la placa en la incubadora a 37 ° C con 10% de CO2 durante 24 h.
  7. Descongele el sustrato de sistema de ensayo de luciferasa y preparar 1 x celular cultura reactivo de lisis en agua bidestilada (DDW).
  8. Quitar los medios de comunicación de 96 pocillos y lyse pozos con 50 μL de 1 x celular cultura tampón de lisis en hielo con agitación suave durante 30 min con un agitador orbital.
  9. Transferencia 30 μL de lisado de cada bien en una placa opaca luciferase y permiten que la placa a temperatura ambiente.
  10. En el software del luminómetro, crear un nuevo protocolo. Seleccione para 1 inyector con mediciones antes y después de la inyección. Ajustar las mediciones antes de la inyección en 1 s por retraso en la medición y Tiempo de integración. Para después de la medición de inyección, ajuste el Volumen de inyección 40 μl con un retraso en la medición de 1 s después de la inyección y 5 s Tiempo de integración. Confirmar la configuración seleccionando OK.
  11. Coloque el tubo de inyector en DDW y haga clic en el botón inyector 1 bajo la configuración de primer para limpiar el tubo del inyector antes de su uso. Luego retire el tubo del inyector del DDW y lugar seguido de otros dos primos del inyector 1 para eliminar toda la solución del tubo de aire. Coloque el tubo de inyector en sustrato de Firefly y otra vez primer dos veces para preparar el sustrato.
  12. Coloque la placa de luciferase opaco con las muestras en el luminómetro y seleccione Opciones en el software. Destacar los pozos de interés y haga clic en aplicar. Presione Inicio para medir señal de luciferasa.
  13. Una vez medidas, quitar y lavar la placa con agua. Recuperar cualquier substrato restante en el tubo del inyector colocando el tubo en el aire y el primer inyector 1 en tubo del substrato de firefly. Coloque el tubo de inyector en DDW y realizar otros dos primos para limpiar el tubo inyector de cualquier sustrato restante.

6. célula preparación para vivo señalización de proyección de imagen In Vivo

  1. 48 h antes de la implantación del tumor, de la semilla 2-3 x 106 MDA-MB-231 células en frascos de 175 cm2 (10 frascos en total). Cultivo de células en 20 mL de medio DMEM que contenía 5% SBF a 37 ° C, 10% CO2.
  2. 24 h más tarde, añadir 300 μL de Ad-CAGA12- Luc (título = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500) en cada matraz. Mantener las células en cultura por otro 24 h.
  3. En el día de implantación, quitar los viejos medios de comunicación y lavar las células adenovirus infectadas una vez con 20 mL de PBS, pH 7,4. Añadir 2 mL de tripsina 0,05%-EDTA en el matraz y agite el matraz ligeramente para permitir que la tripsina cubrir toda la superficie del frasco. Coloque el matraz en a la incubadora de 37 ° C, 10% CO2 durante 3 minutos.
  4. Saciar la tripsina por adición de 8 mL de medio DMEM que contiene FBS en frascos. Transferencia de suspensiones celulares todo en un frasco de reactivo.
  5. Contar el número de celular utilizando un hemocitómetro y transferencia de 4.8 x 107 células en dos tubos de centrífuga de 50 ml.
  6. Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente para eliminar tripsina y resuspender las células en 720 mL de medio de FBS-DMEM fresco.
  7. Transfiera las suspensiones de células en un tubo estéril 5 mL y añadir 160 μL Matrigel (matrigel total 10% suspensión).
  8. Mantener las células en hielo hasta la implantación.

7. ortotópico implantación

  1. Pesan 12 ratones de SCID y asignar al azar ratones en grupos control y tratamiento (6 ratones/grupo).
  2. Realizar la implantación en un gabinete de bio estéril para mantener un ambiente estéril. Anestesiar el ratón utilizando isoflurano 2.5-4.5% con una tasa de flujo de oxígeno de 1 L/min Coloque el ratón sobre una almohadilla de calor y colocar una gota de lubricante pomada ocular en ambos ojos para evitar el daño de la córnea. Fijar el ratón a la almohadilla de calor en una posición supina mientras mantener anestesia colocando el hocico en un cono de nariz conectado para el isoflurano.
  3. Confirman el éxito de la anestesia por la falta de reacción a los pies, pizca. Reducir el isoflurano a una dosis de mantenimiento de 1.5-2.5% de oxígeno de 1 L/min para el recordatorio de la implantación.
  4. Utilizando la torunda de algodón sumergida en etanol al 80% para limpiar la piel del pezón cuarto en ambos lados de la línea media.
  5. Encontrar la 4 almohadilla grasa mamariath a través de la palpación y apriete la almohadilla de grasa para exponer más el tejido.
  6. Mezclar la suspensión de células bien transfiriendo hacia arriba y hacia abajo. Suavemente Aspire 50 μl de mezcla de célula en una jeringa de insulina 27G e inyectar en la almohadilla de grasa mamaria en ambos lados del ratón.
  7. Para confirmar una inyección acertada sensación de inflamación de la almohadilla de grasa. Suelte suavemente la almohadilla de grasa y coloque el ratón en la jaula.
  8. Salir de las jaulas sobre la almohadilla de calor durante al menos 30 minutos permitir que los ratones ganar conciencia y luego volver a colocar las jaulas en la sala de celebración durante 3 días.

8. proyección de imagen de IVIS

  1. Abra el software de Imagen de vida .
  2. Inicializar el sistema IVIS haciendo clic en el botón Inicializar IVIS sistema en el panel de control. Espere hasta que la señal de temperatura se vuelve verde.
  3. Seleccione el modo de proyección de imagen de luminiscente en el panel de control.
  4. Encienda la anestesia isoflurano a la cámara y sistema IVIS.
  5. Anestesiar los ratones mediante el uso de 2.5-4.5% isoflurano con oxígeno de 1 L/min. Una vez anestesiado, establecer isoflurane 1.5-2.5% para el mantenimiento. Inyecte 150 mg/kg de peso corporal de D-luciferin en ratones por inyección intraperitoneal (i.p.).
  6. Inmediatamente transferir ratones en el sistema IVIS, colocar en la plataforma de proyección de imagen con control de temperatura y su nariz en el cono de nariz.
  7. Haga clic en el botón Configuración de la secuencia en el panel de control y seleccione Medio Binning.
  8. Establecer el proyección de imagen tiempo de exposición como sigue: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s, 120 s. Inicio de aproximadamente 3 minutos después de la inyección de luciferin y continúan hasta que la señal empiece a caer la imagen (normalmente esto le llevará alrededor de 20 minutos).
  9. Retirar los ratones del IVIS isoflurane anestésico a través de un cono de la nariz y tratar a los ratones con 50 μl PBS o inhibidor de la señalización de la TGF-β 50 μl (50 μg/tumor) vía la inyección intra-tumor.
  10. Vuelva a colocar los ratones en la jaula y dejarlos en la almohadilla de calor durante al menos 30 minutos. Luego vuelva a colocar la jaula en la sala de celebración.
  11. Repita IVIS imagen procedimiento como se describe anteriormente el día después del tratamiento.

9. Análisis de datos

  1. Abrir archivos guardado en Imagen de vida software.
  2. Encontrar la información de la imagen usando la vista | Información de la imagen.
  3. Seleccione fotos tomadas en un momento similar con el mismo tiempo de exposición. Cargar fotos como grupo.
  4. Desmarque la casilla Individual de Ajuste de la imagen a normalizar la intensidad.
  5. Seleccione el modo de fotones para analizar la intensidad. Cuantificar la intensidad de la señal seleccionando el botón Región de interés (ROI) en Herramientas de ROI.
  6. Arrastre el círculo de retorno de la inversión a la región que contiene la señal bioluminiscente y haga clic en el botón de la medida para adquirir la intensidad de la señal.

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Resultados

Vivo sola célula en vitro

Evaluar con precisión la activación de TGF-β/Smad de señalización en las células adenovirus basado en reactivos, es importante primero determinar el óptimo multiplicidad de infección (Ministerio del interior) para cada línea celular. El Ministerio del interior óptima se determina cuando 100% de las células son positivas para infección adenoviral sin efectos citopáticos o citotóxicos presentes. Par...

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Discusión

Hemos desarrollado una técnica para permitir la proyección de imagen en tiempo real de señalización de TGF-β/Smad3 en células vivas individuales. Mediante este novedoso método, previamente hemos identificado una subpoblación de células con actividad transcripcional del TGF-β/Smad3 dinámico que se asoció con mayor invasión y migración8. Este método mejora los análisis tradicionales de señalización de TGF-β, como manchas blancas /negras occidentales de fosforilación del Smad3 y TGF-β dirigida de la ...

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Divulgaciones

Los autores no divulgan conflictos de interés.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la salud nacional y el Consejo de investigación médica (NHMRC) a H-JZ. TMBW es un recipiente de un premio de postgrado Australia del gobierno australiano y la beca de Top-Up de Ann Henderson de Australian Health de Rotary en pareja con Rotary de Alicante y Cene una cura.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEMThermoFisher1881024Warm en 37 &° C Baño de agua antes de usar
Suero Fetal BovinoScientifix LifeFBS500-SInactivado por calor antes de usar
TGF-&beta humano recombinante; 1PEPROTECH100-21Alícuota en DDW para hacer la concentración final a 10 mg/mL
Hoechst-33258Tocris Bioscience5117Diluir en PBS para hacer la concentración final a 1 μ L/mL
Kit de ensayo indicador de luciferasaPromega197897Diluir 5 veces en PBS antes de usar
LuminómetroPromega9100-002
Microscopía de fluorescencia de contraste de faseOLYMPUSIX50
Centrífugaeppendorf5810 R
VivoGl LuciferinaPromegaP1041
IVIS Lumina III In Vivo Sistema de imagenPerkinElmerCLS136334
0,5% Trypsin-EDTA (10x)ThermoFisher15400-054Diltue al 0,05% (1x) en PBS
Cell Culture Lysis 5x ReactivoPromegaE153ADiluido a 1x en DDW
10% FormalinaSigma-AldrichF5554-4L
HEK 293AThermoFisherR70507
MDA-MB-231ATCCCRM-HTB-26
PRKDC-SCIDCentro de Recursos AnimalesSCIDF6
MatrigelCorning354234
IsofluranoZoetis26675-46-7
Etanol Chem-supplyEA043-10L-P
Refresh Night TimeAllergan1750DUngüento Lubricante para los Ojos
SoluciónComposición
salina tamponada >con fosfato fuerte (PBS)NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M)
FBS-DMEM 5% FBS inactivado por calor; 10 μ g/mL de penicilina; 100 μ g/mL de estreptomicina
solución

Referencias

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