Aquí, presentamos un protocolo para obtener imágenes de células vivas de la actividad de señalización de TGF-β/Smad3 utilizando un adenovirus reportero sistema. Este sistema rastrea actividad transcripcional en tiempo real y puede ser aplicado a ambas células en vitro y en animales vivosmodelos.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Proyección de imagen de células del TGF-β/Smad3 señalización vía In Vitro y In Vivo utilizando un Adenovirus reportero sistema en vivo
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Transformación de Factor de crecimiento β (TGF-β) señalización regula muchas funciones importantes para la homeostasis celular y se encuentra comúnmente sobre expresa en muchas enfermedades, incluyendo cáncer. TGF-β está implicado fuertemente en metástasis durante la progresión del cáncer de etapa tardía, activando un subconjunto de las células del tumor invasivo y migratorias. Los métodos actuales de análisis de la vía de señalización se centran en modelos de punto final, que a menudo tratan de medir señales post-hoc del evento biológico y no reflejan la naturaleza progresiva de la enfermedad. Aquí, demostramos un adenovirus novela reportero sistema específico para la vía de señalización de TGF-β/Smad3 que puede detectar la activación transcripcional en células vivas. Utilizando un reportero Ad-CAGA12-Td-Tom , podemos lograr una tasa de infección del 100% de las células MDA-MB-231 dentro de 24 h in vitro. El uso de un reportero fluorescente permite la proyección de imagen de células vivas en tiempo real con identificación directa de las células transcripcionalmente activas. Estimulación de las células infectadas con TGF-β muestra sólo un subconjunto de las células que son transcripcionalmente activas y participan en funciones biológicas específicas. Este enfoque permite alta especificidad y sensibilidad a un nivel unicelular para mejorar la comprensión de las funciones biológicas relacionadas con TGF-β señalización en vitro. Smad3 actividad transcripcional puede ser también registrados en vivo en tiempo real a través de la aplicación de un Ad-CAGA12- Luc reportero. Ad-CAGA12- Luc puede medirse de la misma manera que las líneas celulares de luciferase estable transfected tradicional. Smad3 actividad transcripcional de las células implantadas en vivo se puede analizar a través de la proyección de imagen convencional de IVIS y seguimiento directo durante la progresión del tumor, proporcionando una visión única en la dinámica de la vía de señalización de TGF-β. Nuestro protocolo describe un sistema reportero ventajosa que permite proyección de imagen de alto rendimiento rápido de vías de señalización de células vivas in vitro e in vivo. Este método puede ser ampliado a una gama de análisis de imagen basado y presenta como un enfoque sensible y reproducible para la biología básica y desarrollo terapéutico.
Introducción
Factor de crecimiento de transformación β (TGF-β) es una citoquina fundamental implicado en el desarrollo humano que las señales a través de un complejo de tipo II heterodiméricos y tipo de receptores1. Unión a receptor II tipo resultados en el reclutamiento y la fosforilación del tipo I del receptor, que a su vez fosforila Smad2/3 aguas abajo proteínas de2,3. Estos activan bind Smad2/3 de proteínas a Smad4, formando un complejo que se transloca en el núcleo y regula la transcripción de gen4. Condiciones homeostáticas de TGF-β/Smad signaling es estrictamente regu....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los experimentos en animales fueron aprobados por la Universidad de Melbourne Comité de ética Animal.
Nota: El protocolo de secuencia, la construcción y la generación para el adenoviral vectores pAd-CMV-Td-Tom, pAd-CMV-GFP y pAd-CAGA12- Luc/Td-Tom se han descrito previamente11,12, 13. Los vectores están disponibles en el mercado.
1. virus título determinación utilizando dosis infectiva de cultivo de tejidos 50% (TCID50)
- Preparar 1 x 106 células ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Vivo sola célula en vitro
Evaluar con precisión la activación de TGF-β/Smad de señalización en las células adenovirus basado en reactivos, es importante primero determinar el óptimo multiplicidad de infección (Ministerio del interior) para cada línea celular. El Ministerio del interior óptima se determina cuando 100% de las células son positivas para infección adenoviral sin efectos citopáticos o citotóxicos presentes. Par.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Hemos desarrollado una técnica para permitir la proyección de imagen en tiempo real de señalización de TGF-β/Smad3 en células vivas individuales. Mediante este novedoso método, previamente hemos identificado una subpoblación de células con actividad transcripcional del TGF-β/Smad3 dinámico que se asoció con mayor invasión y migración8. Este método mejora los análisis tradicionales de señalización de TGF-β, como manchas blancas /negras occidentales de fosforilación del Smad3 y TGF-β dirigida de la .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no divulgan conflictos de interés.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la salud nacional y el Consejo de investigación médica (NHMRC) a H-JZ. TMBW es un recipiente de un premio de postgrado Australia del gobierno australiano y la beca de Top-Up de Ann Henderson de Australian Health de Rotary en pareja con Rotary de Alicante y Cene una cura.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM | ThermoFisher | 1881024 | Warm en 37 &° C Baño de agua antes de usar |
| Suero Fetal Bovino | Scientifix Life | FBS500-S | Inactivado por calor antes de usar |
| TGF-&beta humano recombinante; 1 | PEPROTECH | 100-21 | Alícuota en DDW para hacer la concentración final a 10 mg/mL |
| Hoechst-33258 | Tocris Bioscience | 5117 | Diluir en PBS para hacer la concentración final a 1 μ L/mL |
| Kit de ensayo indicador de luciferasa | Promega | 197897 | Diluir 5 veces en PBS antes de usar |
| Luminómetro | Promega | 9100-002 | |
| Microscopía de fluorescencia de contraste de fase | OLYMPUS | IX50 | |
| Centrífuga | eppendorf | 5810 R | |
| VivoGl Luciferina | Promega | P1041 | |
| IVIS Lumina III In Vivo Sistema de imagen | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 0,5% Trypsin-EDTA (10x) | ThermoFisher | 15400-054 | Diltue al 0,05% (1x) en PBS |
| Cell Culture Lysis 5x Reactivo | Promega | E153A | Diluido a 1x en DDW |
| 10% Formalina | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| HEK 293A | ThermoFisher | R70507 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | CRM-HTB-26 | |
| PRKDC-SCID | Centro de Recursos Animales | SCIDF6 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Isoflurano | Zoetis | 26675-46-7 | |
| Etanol Chem-supply | EA043-10L-P | ||
| Refresh Night Time | Allergan | 1750D | Ungüento Lubricante para los Ojos |
| Solución | Composición | ||
| salina tamponada >con fosfato fuerte (PBS) | NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M) | ||
| FBS-DMEM | 5% FBS inactivado por calor; 10 μ g/mL de penicilina; 100 μ g/mL de estreptomicina |
Referencias
- Massague, J., Like, B. Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines. The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).
- Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
