Las proteasas son fuertemente reguladas las enzimas implicadas en procesos biológicos fundamentales y desajuste proteasa actividad unidades progresión de enfermedades complejas como el cáncer. Este método pretende crear nanosensores que miden actividad proteasa en vivo produciendo una señal de escote que es detectable de la orina de host y discrimina la enfermedad.
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Artículo de método
Nanosensores para detectar actividad proteasa en Vivo para el diagnóstico no invasivo
En este artículo
Resumen
Resumen
Las proteasas son enzimas multifuncionales que se especializan en la hidrólisis de enlaces peptídicos y controlan amplios procesos biológicos incluyendo homeostasis y Alostasis. Por otra parte, actividad de las proteasas altera unidades patogenesia y es un biomarcador funcional de enfermedades como el cáncer; por lo tanto, la capacidad de detectar actividad proteasa en vivo puede proporcionar información clínicamente relevante para el diagnóstico biomédico. El objetivo de este protocolo es crear nanosensores que probe para actividad proteasa en vivo produciendo una señal cuantificable en la orina. Estos nanosensores de proteasa consisten en dos componentes: una nanopartícula y sustrato. Las funciones de nanopartículas para aumentar la entrega de Half-Life y el substrato de la circulación a sitios de enfermedad de destino. El sustrato es una secuencia de péptido corto (6-8 AA), que está diseñada para ser específicos de una proteasa de destino o grupo de las proteasas. El substrato se conjuga a la superficie de la nanopartícula y se termina por un reportero, como un marcador fluorescente para la detección. Como existen proteasas desdoblan el sustrato del péptido, el reportero se filtra en orina para cuantificación como un biomarcador de actividad de la proteasa. Adjunto describimos la construcción de un nanosensor de matriz metaloproteinasa 9 (MMP9), que se asocia con progresión del tumor y la metástasis, para detección de cáncer colorrectal en un modelo murino.
Introducción
Las proteasas son enzimas multifuncionales que se especializan en la hidrólisis de enlaces peptídicos y tener un control significativo sobre muchos procesos biológicos, incluyendo homeostasis, Alostasis y enfermedad1. Un estado alterado de la actividad de la proteasa se ha correlacionado a una variedad de enfermedades, incluyendo cáncer y enfermedades cardiovasculares, que los candidatos atractivos proteasas para desarrollo de biomarcadores clínicos2,3. Por otra parte, actividad de las proteasas es pathogeneses funcionalmente vinculados a distintas, los resultados del paciente y pronóst....
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Protocolo
Aprobación institucional institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en la institución del investigador es necesaria llevar a cabo los siguientes experimentos animales. Además, son necesarios adecuadamente para llevar a cabo estos centros de atención animal estándar (por ejemplo, cámaras, campanas animales estériles, cámaras de isofluorane para anestesia y CO2 cámaras para euthanization ético extremo de la vivienda) experimentos. Entrenamiento especial y ayuda con estas instalaciones se pueden proporcionar por el laboratorio de investigación fisiológica (PRL) en la institución. Todos los trabajos de animales fue aprobado por el IACUC en Ge....
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Resultados
La mayoría de la población de las IONPs es alrededor del media de diámetro, que oscila entre 40-50 nm. Después de la pegilación, esta gama del tamaño tiene una vida media de circulación de aproximadamente 6 horas13 en vivo (ver Figura 2a). Si quiere seleccionar un rango de tamaño especial, uno puede utilizar cromatografía por exclusión de tamaño para aislar fracciones IONP con diferentes diámetros. Las nanopartículas por TEM .......
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Discusión
Este método describe el desarrollo de nanosensores basados en la actividad de proteasa sustratos conjugados a un núcleo de nanopartículas. El evento de clivaje proteolítico es apodado el interruptor"farmacocinético", porque los productos de peptide hendido son más pequeños que el límite de tamaño renal filtración de 5 nm23 y filtro en orina para producir una señal no invasiva. Por lo tanto, es importante utilizar nanopartículas o portadores con un radio hidrodinámico que es más grande que 5 nm, co.......
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Divulgaciones
Dr. Kwong es co-fundador y sirve como consultor para otras Bio, que está desarrollando productos relacionados con la investigación descrita en este artículo. Este estudio podría afectar su situación financiera personal. Los términos de este acuerdo han sido revisados y aprobadas por Georgia Tech conforme a sus políticas de conflicto de intereses
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por un Director de NIH nuevo innovador Award (premio no. DP2HD091793). Q.D.M. es apoyado por la NSF investigación becas postgrado (Grant no. DGE-1650044). B.A.H es apoyado por el nacional institutos de salud GT BioMAT beca de formación bajo la concesión número 5T32EB006343, así como la beca del Presidente de Tech de Georgia. G.A.K. tiene un premio de carrera en la interfaz científica desde el fondo de la recepción de Burroughs. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,2 y micro; m filtros de jeringa | VWR | 4652 | |
| aguja 18G | VWR | 89134-024 | |
| 15 mL cónicos VWR | 89039-670 | ||
| 250 mL matraz Erlenmeyer | VWR | 89000-362 | |
| Barra agitadora | VWR | 58949-006 | |
| Placa calefactora/agitador magnético | VWR | 97042-634 | |
| Ácido | acético glacialVWR | 97064-482 | |
| Albúmina de suero bovino (BSA) | Thermo Fisher | A13100 | |
| Cloruro de hierro (III) hexahidratado | Sigma | 236489 | |
| Cloruro de hierro (II) tetrahidratado | Sigma | 44939 | |
| Epiclorhidrina | Sigma | 45340-500ML-F | |
| DMF | Sigma | D4551 | |
| Amonio Hidróxido Sigma | 320145-500ML | ||
| Pellets de hidróxido de sodio | Sigma | 221465-500G | |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Borato de sodio | Sigma | B9876 | |
| L-cisteína | Sigma | 168149-100G | |
| Tris-HCl | Sigma | T5941 | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| PBS comprimidos | Sigma | P4417 | |
| Dextran | Pharmacosmos | 5510 0020 9006 | |
| Amicon 15 mL 10k filtros, 24 pk | Millipore | UFC901024 | |
| Amicon 15 mL filtros 30k, 24 pk | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon 15 mL 100k filtros, 24 pk | Millipore | UFC910024 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | NanoZS | |
| Slide-A-Lyzer Cassette de diálisis | LifeTech | 66130 | |
| Dynabeads MyOne Tosylactivated | LifeTech | 65501 | |
| SIA | Life Tech | 22349 | |
| PEG 20k | Laysan Bio | MPEG-SH-20K-1g | |
| Anticuerpo de fluoresceína [2A3] | GeneTex | GTX10257 | |
| Hiload 16/600 superdex 200 | GE Healthcare | 45-002-490 | |
| Lector de placas | Fisher | BTCYT5M | |
| BD Jeringas de insulina Fisher | NC0872854 |
Referencias
- Lopez-Otin, C., Bond, J. S. Proteases: Multifunctional enzymes in life and disease. Journal of Biological Chemistry. 283 (45), 30433-30437 (2008).
- Hua, Y., Nair, S. Proteases in cardiometabolic diseases: Pathophysiology....
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Reimpresiones y permisos
