Aquí, presentamos un protocolo para determinar la temperatura ambiente preferida de larvas de Drosophila usando un gradiente térmico continuo.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Un análisis de gradiente de temperatura para determinar las preferencias térmicas de larvas de Drosophila
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Muchos animales, incluyendo la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, son capaces de discriminantes diferencias minutos en temperatura ambiente, que les permite buscar su paisaje termal preferido. Para definir las preferencias de la temperatura de las larvas sobre un rango lineal definido, hemos desarrollado un ensayo utilizando un gradiente de temperatura. Para establecer un gradiente solo bidireccional, dos bloques de aluminio están conectados con baños independientes, cada una de ellas controla la temperatura de bloques individuales. Los dos bloques establece los límites inferiores y superiores del gradiente. El gradiente de temperatura se establece mediante la colocación de una placa de aluminio recubierto de agarosa sobre los dos bloques de agua controlada para que la placa extiende la distancia entre ellos. Los extremos de la placa de aluminio que se encuentra en la parte superior de los bloques de agua define las temperaturas mínimas y máximas, y las regiones entre los dos bloques forman un gradiente lineal de la temperatura. El análisis de gradiente puede ser aplicado a las larvas de diferentes edades y puede ser usado para identificar a mutantes que exhiben fenotipos, como aquellas con mutaciones que afectan a genes que codifican los canales TRP y opsins, que se requieren para la discriminación de temperatura.
Introducción
Thermotaxis es empleado por los animales móviles para seleccionar un entorno con las condiciones más favorables1,2,3. Si el clima es excesivamente frío o caliente, este comportamiento es vital para la supervivencia. Además, muchos animales son sensibles a diferencias muy pequeñas de temperatura en la gama cómoda y buscan un entorno con una temperatura ideal. Esto es de particular importancia para los organismos poiquilotérmicas como moscas de la fruta, que equilibre su temperatura corporal con el medio ambiente. Ensayos para controlar larvas thermotaxis han sido instrumentale....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. equipo fabricación y montaje aparatos para ensayos de gradiente
- Fabricar las placas de ensayo de aluminio para el análisis de gradiente direccional solo.
- Cortar y moler cada placa de ensayo de aluminio (figura 1A) de una sola pieza de aluminio con una sierra de banda y sharp molino vertical con las siguientes dimensiones: el tamaño exterior es de 140 x 100 x 9 mm y el tamaño interior es de 130 x 90 x 8 mm (figura 1B). Anodice el interior de cada placa de análisis con pintura negra para que sea más fácil visualizar las larvas y evitar que se oxiden.
Nota: Fabricación de las placas de en....
- Cortar y moler cada placa de ensayo de aluminio (figura 1A) de una sola pieza de aluminio con una sierra de banda y sharp molino vertical con las siguientes dimensiones: el tamaño exterior es de 140 x 100 x 9 mm y el tamaño interior es de 130 x 90 x 8 mm (figura 1B). Anodice el interior de cada placa de análisis con pintura negra para que sea más fácil visualizar las larvas y evitar que se oxiden.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Para establecer un solo-direccionales de 18 ° C - 28 ° C gradiente, fijamos las temperaturas de los dos baños de agua a 16,8 ° C y 31 ° C. Obtenemos las temperaturas a 13 puntos por la medición de la temperatura en 26 posiciones dentro de las porciones superiores e inferiores de todas las 6 zonas, las líneas de frontera entre las zonas y en los extremos de la superficie del gel de agarosa (figura 2, 2E). La distribución de temperaturas a lo l.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Para asegurar el éxito de este protocolo, es importante que tome medidas para obtener el número suficiente de larvas para realizar los experimentos. Estos incluyen la alimentación de las moscas en viales que contienen pasta de levadura para 2-3 d mejorar la puesta de huevos. Los viales necesitan ser colocados en una bandeja que contiene frascos de agua y dentro de una bolsa de plástico transparente, que mantiene la humedad de los alimentos y promueve la efectiva de alimentación por las larvas permitiendo la exposición a .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
C.M. es apoyado por fondos de la NEI (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278) y el NIAID (1DP1AI124453).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| ensayo de gradiente fuerte | |||
| PolyScience 9106, Baño de circulación refrigerado/calefactado de 6 L | Thomas Scientific | 9106 | Este modelo está descatalogado. Los modelos de reemplazo actualizados incluyen: 1186R00 y 1197U04 para 120 V, 60 Hz, o 1184L08 y 1197U04 para 240 V, 50 Hz. |
| Placa de ensayo de aluminio (para gradiente direccional simple) | Tamaño exterior: 14 x 10,1 x 0,9 cm, tamaño interior: 12,9 x 8,7 x 0,8 cm, anodizado negro. | ||
| Placa de aluminio (para degradado bidireccional) | 25 x 22 x 0,2 cm, anodizado negro. | ||
| Bloque | de aluminio Tamaño exterior: 25,5 x 5 x 1,4 cm, los parámetros de los canales internos se muestran en la Figura 1D. | ||
| Conector para bloques y tubos de aluminio | McMaster-Carr | 91355K82 | |
| Tygon Tubo de silicona sanitaria | Tygon | 57296 | 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" |
| paredName | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| Artículos y reactivos para ensayo | |||
| Mortle | USA Scientific | 17361 | Mortero para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL |
| Termómetro | Fluke | 51II | |
| Termopar | Fluke | K tipo | |
| microplaca | Corning | 6980A77 | |
| Plato de 35 mm | Corning | 9380D40 | |
| Cinta de etiquetado (para gradiente bidireccional) | Fisher Scientific | 15-951 | Cinta de etiquetado Fisherbrand 2 pulgadas x 14 yardas |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | Prepare la solución al 1% |
| Sacarosa | Sigma | S0389-5KG | Prepare la solución al 18% justo antes de comenzar el ensayo |
| Pincel | Fisher Scientific | 11860 | |
| Tubos de centrífuga de | 50 mLDenville | C1062-P | |
| Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| 500 mL frasco redondo de boca ancha | Pyrex | 1395-500 | |
| Colador de células (poro de 300 mm) | PluriSelect | 43-50300 | Artículo opcional para el lavado de larvas |
| Caja de cartón (bandeja de viales) | Genesee Scientific | FS32-124 | |
| Name | >Company | Número de catálogo | Comments |
| >Drosophila alimentos | |||
| NC0535320 | 1,609 g | ||
| Levadura de cerveza 100 lbs | MP Biomedicals | ICN90331280 | 379 g |
| NutriSoy® Harina de soja (10 kg/unidad) | Genesee Scientific | 62-115 | 221 g |
| Drosophila Agar, Tipo II (5 kg) | Genesee Scientific | 66-103 | 190 g |
| Karo jarabe de maíz ligero Karo | 1.700 mL | ||
| 4-hidroxibenzoato de metilo (suspender en etanol de 200 grados) | Sigma Aldrich | H5501-5KG | 72 g/240 mL |
| Puris de ácido propiónico. p.a.,>99.5% (GC) | Sigma Aldrich | 81910-1 L | 108 mL |
| Ácido fosfórico Reactivo ACS, ≥ 85 % en peso en H2O | Sigma Aldrich | 438081-500 mL | 8.5 mL |
Referencias
- Fowler, M. A., Montell, C. Drosophila TRP channels and animal behavior. Life Sci. 92, 394-403 (2013).
- Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals. Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).
- Vriens, J., Nilius, B.....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
