Este artículo presenta un método basado en el acoplamiento para facilitar la detección de sobreexpresión en levadura de florecimiento utilizando una biblioteca de plásmidos vestida.
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Artículo de método
Proyección de biblioteca sobreexpresión basado en apareamiento en levaduras
En este artículo
Resumen
Resumen
Levadura de florecimiento ha sido ampliamente utilizada como modelo en el estudio de proteínas relacionadas con enfermedades humanas. Investigación genética genoma es una poderosa herramienta de uso general en estudios de levadura. La expresión de un número de proteínas asociada a enfermedad de neurodegenerative en levadura causa citotoxicidad y formación de agregados, recapitulando los resultados vistos en pacientes con estos trastornos. Aquí, describimos un método para la detección de un modelo de la levadura de la proteína asociada a la Esclerosis Lateral Amiotrófica FUS para modificadores de su toxicidad. En lugar de usar la transformación, esta nueva plataforma de proyección se basa en el acoplamiento de la levadura para introducir una matriz biblioteca de plásmidos en el modelo de la levadura. El método de apareamiento tiene dos claras ventajas: en primer lugar, es muy eficiente; en segundo lugar, la biblioteca matriz previamente transformada de plásmidos puede almacenarse a largo plazo como un stock de glicerol, y rápidamente aplicada a otras pantallas sin el paso intensivo de transformación en el modelo de levadura cada vez. Nos demuestran cómo se puede utilizar con éxito este método para detectar genes que modifican la toxicidad de FUS.
Introducción
La levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae ha sido ampliamente utilizada en la investigación científica básica1 para entender procesos celulares relacionados directamente con enfermedades humanas. Por otra parte, se ha utilizado como organismo modelo para estudiar proteínas humanas asociadas a la enfermedad, tales como los relacionados con las enfermedades neurodegenerativas más comunes, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington y amiotrófica Esclerosis lateral (ALS)2. Una ventaja del modelo de la levadura es la facilidad con que se puede realizar una pan....
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Protocolo
Nota: El protocolo descrito aquí está diseñado para la detección de plásmidos de la biblioteca contenidas en placas de 96 pocillos diez pero se pueden escalar hacia arriba o hacia abajo en consecuencia. El protocolo tiene que repetir para completar el tamizaje de toda biblioteca. Por lo general, proyección contra 10 placas de genes biblioteca cada vez que puede ser cómodamente manejado por 1 persona.
1. preparación para la transformación de la levadura de 96 pocillos
Nota: Este paso se realiza anteriormente descrito7,10.
- Alícuota de 5 μl (aproximadamente 50-100 ng) ....
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Resultados
La proteína asociada a ALS FUS, una proteína de unión de ARN/ADN fue estudiada previamente en levadura haploide7,8. Genéticos de detección utilizando el método basado en la transformación descubrió varios genes de levadura que suprimen la toxicidad de FUS. El homólogo humano de uno de los genes de la levadura más adelante fue demostrado para ser eficaz en suprimir la toxicidad en un modelo de rata de ALS13y.......
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Discusión
Aquí, describimos un protocolo para realizar una pantalla de sobreexpresión de plásmido en la levadura mediante apareamiento para introducir la biblioteca del plásmido en el modelo de la levadura. Usando este acercamiento, pueden proyectará varios modelos de levadura de la toxicidad de la proteína enfermedad neurodegenerativas utilizando la misma colección de levadura transformada con una biblioteca de plásmidos. El laborioso proceso de transformación sólo necesita realizarse una vez, después de que levadura altamente ef.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Estamos agradecidos por las discusiones reflexivas con miembros del laboratorio Ju y laboratorio de Zhong y el apoyo financiero de la Universidad de estado de Wright.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| salmón Esperma ADN (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD caldo | Products International (RPI) | Y20090 | |
| Agar granulado | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Rafinosa Pentahidrato | Productos de investigación Internacional (RPI) | R20500 | |
| Sulfato de Amonio | Fisher Sci | A702-500 | |
| Sintético Ura- medio de caída | Clontech | 630416 | |
| Suplemento de caída de aminoácidos de levadura -Histidina/-Uracilo | Clontech | 630422 | |
| Base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos y sulfato de amonio | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Acetato de litio, anhidro | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polietilenglicol 3350 (PEG-3350) | Espectro Químico | PO125-12KG | |
| Replicador de 96 pines | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 placa de ensayo de pocillos, fondo redondo con tapa | Fisher Sci | 07-200-760 | sin tratar, estéril |
| Eppendorf Investigación plus Pipeta multicanal | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volumen |
| Fisherbrand Isotemp Digital Baños Secos/Calentadores de Bloque | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Centrífuga Eppendorf 5810R | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Centrífuga Avanti J-26 XPI Beckman | 393127 | ||
| MultiFlo FX Dispensador multimodo | BioTek | ||
| Rotor HDA | Instrumentos cantantes |
Referencias
- Dujon, B. A., Louis, E. J. Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina). Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's ye....
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Reimpresiones y permisos
