Artículo de método

Proyección de biblioteca sobreexpresión basado en apareamiento en levaduras

DOI:

10.3791/57978

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6 de julio de 2018

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1Department of Biological Sciences, Wright State University

En este artículo

Resumen

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Este artículo presenta un método basado en el acoplamiento para facilitar la detección de sobreexpresión en levadura de florecimiento utilizando una biblioteca de plásmidos vestida.

Resumen

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Levadura de florecimiento ha sido ampliamente utilizada como modelo en el estudio de proteínas relacionadas con enfermedades humanas. Investigación genética genoma es una poderosa herramienta de uso general en estudios de levadura. La expresión de un número de proteínas asociada a enfermedad de neurodegenerative en levadura causa citotoxicidad y formación de agregados, recapitulando los resultados vistos en pacientes con estos trastornos. Aquí, describimos un método para la detección de un modelo de la levadura de la proteína asociada a la Esclerosis Lateral Amiotrófica FUS para modificadores de su toxicidad. En lugar de usar la transformación, esta nueva plataforma de proyección se basa en el acoplamiento de la levadura para introducir una matriz biblioteca de plásmidos en el modelo de la levadura. El método de apareamiento tiene dos claras ventajas: en primer lugar, es muy eficiente; en segundo lugar, la biblioteca matriz previamente transformada de plásmidos puede almacenarse a largo plazo como un stock de glicerol, y rápidamente aplicada a otras pantallas sin el paso intensivo de transformación en el modelo de levadura cada vez. Nos demuestran cómo se puede utilizar con éxito este método para detectar genes que modifican la toxicidad de FUS.

Introducción

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La levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae ha sido ampliamente utilizada en la investigación científica básica1 para entender procesos celulares relacionados directamente con enfermedades humanas. Por otra parte, se ha utilizado como organismo modelo para estudiar proteínas humanas asociadas a la enfermedad, tales como los relacionados con las enfermedades neurodegenerativas más comunes, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington y amiotrófica Esclerosis lateral (ALS)2. Una ventaja del modelo de la levadura es la facilidad con que se puede realizar una pantalla de genoma para identificar vías celulares relacionados con la toxicidad de las proteínas relacionadas con la enfermedad, dando la penetración en el mecanismo de su toxicidad. Una tal pantalla se llama una pantalla de biblioteca de sobreexpresión, en la que cada uno de los 5.500 genes de la levadura en una biblioteca matriz se transforma en un modelo de levadura a identificar qué genes pueden modificar la toxicidad cuando overexpressed. Este método de cribado se ha aplicado con éxito en los modelos de la levadura de múltiples neurodegenerative enfermedad proteínas asociadas, incluyendo huntingtina para la enfermedad de Huntington3, α-sinucleína para la enfermedad de Parkinson4,5 , Aβ para la enfermedad de Alzheimer6y FUS y TDP-43 para ALS7,8,9. Mientras que generalmente se realiza en un modo de alto rendimiento de10, el paso más trabajo de la pantalla está transformando individualmente 5.500 genes de la levadura de una biblioteca vestida. Este paso debe realizarse cada vez que la proyección se repite, y cada vez que un modelo de nueva levadura necesita ser estudiado. Es importante encontrar una manera más eficiente para llevar a cabo esta tarea.

Las células de levadura estable pueden existir en formas haploides y diploides. Hay dos opuestos tipos de células haploides, acoplamiento tipo de apareamiento a y α. células haploides de cada apareamiento tipo producir y secretan su propia feromona apareamiento específico, que sólo las células de tipo acoplamiento opuesto responden. Esto permite el acoplamiento entre una y las células α producen células diploides estables, a/α. Este proceso es espontáneo y altamente eficaz11. Podemos aprovechar este ciclo de vida único de S. cerevisiae para presentar la biblioteca de plásmido. Más específicamente, cada gen en la biblioteca de plásmido vestida se transformarán en células haploides de un tipo de cruzamiento, es decir, la célula α. Estas células que contienen los genes de la biblioteca se almacenará en stock de glicerol en un formato matriz de 96 pocillos. Para cada modelo de levadura que necesita ser defendido, las células de levadura que contiene los genes de la biblioteca pueden ser descongeladas del stock de glicerol, y la proyección puede realizarse a través de acoplamiento con el modelo de levaduras de interés en el acoplamiento tipo opuesto, es decir, tipo de cruzamiento una. Esta idea de la utilización de apareamiento para reunir a dos genes en la levadura no es nueva. Se ha aplicado con éxito en la levadura de alto rendimiento, proyección de dos híbridos, en que un cebo construir (es decir, fusiones de dominio Gal4-DNA-que atan) en un tipo de cruzamiento se reúne a través de apareamiento con una construcción de la presa de una biblioteca vestida 12. sin embargo, esta estrategia no se ha aplicado nunca en proyecciones de la biblioteca de sobreexpresión, que siempre han utilizado métodos de transformación tradicional.

Nuestro laboratorio había establecido previamente un modelo de levadura de la proteína asociada a ALS FUS7. A través de la proyección de la biblioteca de sobreexpresión utilizando el método de transformación descubrieron cinco genes de levadura (NAM8, SBP1, ECM32, SKO1y VHR1) que rescatan toxicidad de FUS cuando overexpressed. Estos resultados fueron confirmados independientemente con un estudio similar realizado por otro grupo8. hUPF1, un homólogo humano de ECM32, más adelante fue demostrado que suprimen la toxicidad en las células neuronales primarias13 y en un modelo animal de ALS14 así. Utilizando estos cinco genes como prueba del principio, demostramos que todos los cinco genes asimismo rescatar toxicidad FUS cuando se introducen en el modelo de la levadura FUS por apareamiento. Puesto que las células de levadura que contiene los genes de la biblioteca pueden ser almacenadas permanentemente en stock de glicerol y revivió cuando sea necesario, este método basado en apareamiento eliminará el paso lento de transformación cada vez que necesita ser defendido contra la biblioteca. Apareamiento es altamente eficiente con ninguna transformación del plásmido involucrado, esta estrategia disminuye también significativamente el costo asociado con la purificación y transformación de una biblioteca de plásmidos grandes. Con éxito se aplicará este método en una biblioteca de investigación contra el modelo de la levadura de FUS.

El procedimiento basado en el acoplamiento se describe brevemente en la figura 1. Inicialmente, la biblioteca de plásmido vestida se transforma en una cepa de levadura haploide de acoplamiento tipo α mediante un protocolo de transformación de levaduras de alto rendimiento en el que cada pocillo de una placa de 96 pocillos contiene levadura transformada con un plásmido de la biblioteca específica. Esta colección de levadura transformada se guarda como un stock de glicerol que puede ser descongelado y revivido para el uso más adelante. El modelo de levaduras de interés, en este caso toxicidad FUS, debe generarse en una cepa de levadura haploide con el tipo de apareamiento opuesto (acoplamiento tipo a). En alto rendimiento forma con estériles replicadores de 96 pines la cepa FUS cepas de levadura que contiene la biblioteca de plásmido transferidas a placas de 96 pocillos que contienen medios enriquecidos y permitió a mate. Tras el apareamiento, un pequeño volumen de cada bien de la cultura de acoplamiento se transfiere a placas de 96 pocillos que contienen medios sintéticos deserción que levadura sólo diploide que contiene tanto las FUS y genes biblioteca pueden crecer. Una máquina telescopio robótica entonces se utiliza para transferir la cultura de la levadura de cada pozo en placas de agar donde se induce la expresión de los genes de la biblioteca y FUS.  Además, cultura de la levadura es descubierta para controlar las placas de agar donde FUS y los biblioteca los genes no se expresan. Después de crecimiento en placas de agar, se identificarán genes que rescataran o exacerban la toxicidad FUS.

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Protocolo

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Nota: El protocolo descrito aquí está diseñado para la detección de plásmidos de la biblioteca contenidas en placas de 96 pocillos diez pero se pueden escalar hacia arriba o hacia abajo en consecuencia. El protocolo tiene que repetir para completar el tamizaje de toda biblioteca. Por lo general, proyección contra 10 placas de genes biblioteca cada vez que puede ser cómodamente manejado por 1 persona.

1. preparación para la transformación de la levadura de 96 pocillos

Nota: Este paso se realiza anteriormente descrito7,10.

  1. Alícuota de 5 μl (aproximadamente 50-100 ng) del plásmido ADN desde una biblioteca de plásmidos vestida en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo.
    Nota: Un ejemplo de tal una biblioteca sería un gen de levadura sobreexpresión biblioteca10.
  2. Sembrar 150 mL de levadura peptona dextrosa (YPD) los medios de comunicación en un matraz de 500 mL con una colonia (2-3 mm de diámetro) de la cepa de levadura haploide W303α. Incúbelos durante la noche a 30 ° C con agitación (200 rpm).
  3. A la mañana siguiente, medir OD600 de la cultura durante la noche y diluir la cultura de la levadura a OD600 = 0.1 en (hasta) 2 L de YPD. Incubar a 30 ° C con agitación (200 rpm) durante ~ 5 h hasta que la cultura llegue a OD600 = 0,4 – 0,6.

2. levadura transformación

  1. Cosecha de la cultura de la levadura por llenado 8 botellas de centrífuga estériles de 250 mL y centrifugar a temperatura ambiente a 3.000 x g durante 10 minutos retirar el sobrenadante sin perturbar el pellet.
    Nota: Llevar a cabo todos los pasos de centrifugación a temperatura ambiente.
  2. Lavado de la levadura con agua destilada estéril H2O. Para esto, añadir 100 mL de estéril de H2O para cada botella de centrífuga y agitar para Resuspender el precipitado de células. Combinar las células lavadas en 2 botellas y centrifugar a 3.000 x g durante 5 minutos retirar el sobrenadante.
  3. Lavar las células en cada frasco en 100 mL de 0.1 M LiOAc/1XTE (LiOAc de 100 mM, 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA) y centrifugar a 3.000 x g durante 5 minutos verter fuera el sobrenadante.
  4. Centrifugación, hervir 5 mL de esperma de salmón ADN (10 mg/mL) a 100 ° C con un calentador del bloque por 3 min y luego enfriarlo con hielo.
  5. Resuspender el precipitado de células en 25 mL de 0.1 M LiOAc/1XTE en cada botella, combinar las células resuspendidas y transferirlos a un matraz de 150 mL. Añadir 5 mL de la esperma de salmón previamente enfriado ADN e incubar a 30 ° C con agitación (225 rpm) durante 30 minutos.
  6. Vierta la mezcla de células en un reservorio de reactivo desechable estéril y, usando una pipeta multicanal, transferir 35 μl de la mezcla de células en cada pocillo de la placa de 96 pocillos de fondo redondo que contiene el ADN del plásmido de biblioteca. Placas de Vortex 96-bien con un Vortex de la placa durante 1 min a 1.000 rpm. Incubar las placas durante 30 min a 30 ° C sin agitación.
    Nota: No apile las placas, por lo que el calor puede transferir de manera más eficiente. Hemos encontrado que Vortex no hace líquido se derrame de los pozos de las placas de 96 pozos a 1.000 rpm y una velocidad del vórtice seguro debe probarse antes de realizar el paso.
  7. En un matraz, preparar 200 mL de la solución de transformación que contiene una concentración final de 40% PEG3350, 10% DMSO y 0.1 M LiOAc. Preparar el tampón de transformación inmediatamente antes del uso y homogeneizar por agitación.
  8. Quitar 96 pocillos placas de la incubadora de 30 ° C y mezclar durante 30 s en 1.000 rpm mediante el Vortex de la placa. Añadir 125 μl del buffer de transformación a cada pozo y luego vórtice las placas durante 1 min a 1.000 rpm.
  9. Incubar las placas a 30 ° C durante 30 minutos y luego calor choque la levadura mediante la colocación de las placas en una incubadora de 42 ° C durante 15 minutos.
    Nota: No apile las placas.
  10. Centrifugue las placas durante 5 min a 3.000 x g. Eliminar el tampón de transformación de los pozos por invertir las placas sobre un cubo de basura y con fuerza descarga el buffer de las placas. Rápidamente secar las placas invertidas en una toalla de papel limpia para eliminar cualquier líquido en la parte superior de las placas.
  11. Enjuague las células añadiendo a los platos 200 μL de deserción mínimo media correspondiente al marcador seleccionable en el plásmido de la biblioteca.
    Nota: Se utilizó un medio sintético de Ura.
  12. Centrifugue las placas durante 5 min a 3.000 x g y eliminar el sobrenadante con un cubo de basura como en el paso 2.10.
  13. Añadir 160 μl de mínimo medio Ura que contiene 2% de glucosa. Vórtice de las placas durante 1 min a 1.000 rpm e incúbelos a 30 ° C por 48 h sin agitar. Después de 48 h, tenga en cuenta que una pelotilla de levadura transformada es visible en la parte inferior de cada pocillo.
  14. Mediante un dosificador de líquido, añada 100 μl de glucosa que contiene medios de Ura en cada pocillo de una nueva serie de placas de 96 pocillos.
  15. Vórtice de las placas que contiene la levadura transformada (de paso 2.13) a 1.000 rpm durante 30 s. con un duplicador de 96 pines de plástico estéril, coloque los pernos en los pozos que contiene la levadura transformada y entonces los inocule en los pocillos correspondientes de las placas nuevas llenado con medios de comunicación. Incubar las placas nuevas a 30 ° C durante 24 h.
    Nota: Si trabaja con placas de 10, el medio puede también dispensar manualmente utilizando pipetas de varios canales.
  16. Después de 24 h, un sedimento de levadura debe ser visible en la parte inferior de cada pocillo que contenga levadura transformada con éxito. Para guardar estas levaduras como las poblaciones de glicerol, añada 50 μl de glicerol al 50% a cada pocillo, vórtice las placas durante 30 s a 1.000 rpm, sellar las placas con cinta y congelar a-80 ° C.
    Nota: Los pasos anteriores sólo tiene que realizarse una vez. Futuras proyecciones de modelos diferentes de levadura contra el depósito de reactivo disponible biblioteca misma pueden iniciar desde las poblaciones de glicerol y proceden inmediatamente los pasos a continuación.

3. acoplamiento entre las células que contienen Genes de biblioteca y consulta de levadura

  1. Para reactivar las cepas biblioteca del stock de glicerol, sacar las placas de 96 pocillos el congelador de-80 ° C, retirar la cinta de sellado y dejar que la levadura se descongelación a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos.
  2. Una vez descongelado la levadura, usar un duplicador de 96 pines de plástico estéril para inocular las cepas de glicerol a 160 μl de fresco Ura-medios de comunicación que contiene 2% de glucosa en placas de 96 pocillos e incúbelos a 30 ° C por 24 h. inmediatamente después de las tensiones de la biblioteca se utilizan , sellar las placas con cinta y volver al congelador de-80 ° C.
  3. El mismo día se descongelan las cepas de la biblioteca (W303α), inocular la cepa de levadura de consulta (aquí, FUS en W303a) a 50 mL de YPD y crecer durante la noche a 30 ° C con agitación a 250 rpm.
  4. A la mañana siguiente, vierte la cepa de levadura de consulta para un reservorio de reactivo desechable estéril y alícuota 160 μl de la cepa de consulta en cada pocillo de una placa de 96 pozos utilizando una pipeta multicanal.
  5. Utilizando el dispensador líquido, dispensar 160 μl de medio YPD en cada pozo de diez placas de 96 pocillos. Use estas placas más tarde para el apareamiento de la cepa de levadura de consulta con la levadura de la biblioteca.
  6. Brevemente vórtice la placa de 96 pocillos que contienen la cepa consulta y usar un replicador estéril de 96 pines para transferir la consulta tensión a las placas YPD.
  7. Brevemente vórtice la biblioteca cepa placas y para cada placa de la cepa de biblioteca, use un nuevo replicador estéril de 96 pines para transferir las cepas de la biblioteca a las placas YPD que han sido inoculadas con la cepa de la consulta.
    Nota: Las células en glicerol pierden su viabilidad después de varios ciclos de congelación descongelación. Volviendo a las cepas de biblioteca para el almacenamiento a largo plazo (congelador de-80 ° C) tan pronto como sea posible mantener la biblioteca en buena calidad y listo para su uso futuro. Se mantiene apropiadamente, el stock de glicerol puede ser congelado y descongelado al menos 10 veces. Nosotros también recomendamos mantener una copia de trabajo y copias de seguridad de la población de glicerol. Cuando el stock de trabajo no funciona, inmediatamente hacer un nuevo trabajo copia de la copia de seguridad.
  8. Incubar las placas YPD en 30 ° C por 24 h. Nota que una pelotilla de la levadura será visible en la parte inferior de cada pocillo después de 24 h.
  9. Placas de relleno 96 pocillos con un medio de salida mínima que contienen rafinosa 2%, correspondiente a los marcadores seleccionables en el plásmido en la cepa de consulta así como en el plásmido de la biblioteca (p. ej., aquí Ura - su-).
  10. Usar un replicador estéril de 96 pines para transferir levadura de YPD apareamiento culturas a los medios selectivos. Incubar las placas de 96 pozos a 30 ° C por 48 h; sólo la levadura las células que se han acoplado y diploide formado de células y, por lo tanto, contienen tanto el plásmido de la consulta y el plásmido de biblioteca serán capaces de crecer en este medio. Después de 2 días, observar que un diábolo es visible en la parte inferior de los pozos.

4. localización del ensayo

  1. Después de 48 h de crecimiento en los medios selectivos que contienen rafinosa, ver la levadura en las placas de agar.
    1. Preparar 2 juegos de placas, Ura su abandono con agar al 2% utilizando placas de poliestireno transparente, una galactosa que contiene de 2% y el otro que contiene 2% de glucosa.
    2. Placas Vortex 96-bien durante 1 min a 1.000 rpm, punto entonces la levadura a las placas de Ura su deserción que contiene galactosa 2% y 2% de agar (genes de FUS y biblioteca inducidos) y a las placas de Ura su deserción que contiene 2% de glucosa y 2% de agar (genes FUS y biblioteca reprimido) usando una máquina de telescopio robótica, por el cual la cultura en cada bien es descubierta en las placas de agar por cuadruplicado (es decir, la cultura en 1 bien es descubierta a 4 puntos en la placa de agar).
    3. Después de detectar, que las placas de agar seco y colocar boca abajo en una incubadora de 30 ° C. Fotografiar las placas de agar cada 24 h para registrar un crecimiento más rápido y más levadura que la toxicidad a la cepa de consulta es rescatada o para registrar un crecimiento más lento, menos en que se exacerba la toxicidad a la cepa de la consulta. Incubar las placas durante 4 días.
      Nota: La cultura en cada bien se puede observar en placas de agar 1 a 1, como se muestra en un método basado en la transformación anterior de10. Sin embargo, la 1-a-4 manchas aquí (que puede ser situado usando la máquina de telescopio robótica) aumenta significativamente la robustez del análisis al reducir el número de falsos positivos. Resultados positivos se consideran solamente cuando todas las 4 colonias de la misma bien muestran un fenotipo similar.

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Resultados

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La proteína asociada a ALS FUS, una proteína de unión de ARN/ADN fue estudiada previamente en levadura haploide7,8. Genéticos de detección utilizando el método basado en la transformación descubrió varios genes de levadura que suprimen la toxicidad de FUS. El homólogo humano de uno de los genes de la levadura más adelante fue demostrado para ser eficaz en suprimir la toxicidad en un modelo de rata de ALS13y...

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Discusión

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Aquí, describimos un protocolo para realizar una pantalla de sobreexpresión de plásmido en la levadura mediante apareamiento para introducir la biblioteca del plásmido en el modelo de la levadura. Usando este acercamiento, pueden proyectará varios modelos de levadura de la toxicidad de la proteína enfermedad neurodegenerativas utilizando la misma colección de levadura transformada con una biblioteca de plásmidos. El laborioso proceso de transformación sólo necesita realizarse una vez, después de que levadura altamente ef...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Estamos agradecidos por las discusiones reflexivas con miembros del laboratorio Ju y laboratorio de Zhong y el apoyo financiero de la Universidad de estado de Wright.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
salmón Esperma ADN (SS-DNA)Sigma-Aldrich  D1626
YPD caldoProducts International (RPI)Y20090
Agar granuladoFisher SciBP97445
D-(+)-GlucoseResearch Products International (RPI)G32040
D-(+)-GalactoseResearch Products International (RPI)G33000
D-(+)-Rafinosa PentahidratoProductos de investigación Internacional (RPI)R20500
Sulfato de AmonioFisher SciA702-500
Sintético Ura- medio de caídaClontech630416
Suplemento de caída de aminoácidos de levadura -Histidina/-UraciloClontech630422
Base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos y sulfato de amonioResearch Products International (RPI)Y20060
Dimetilsulfóxido (DMSO)Fisher SciS67496
Acetato de litio, anhidroFisher SciAC268640010
Polietilenglicol 3350 (PEG-3350)Espectro Químico PO125-12KG
Replicador de 96 pines ScinomixSCI-5010-OS
Nunc OmniTrayThermo Sci140156
Corning Costar 96 placa de ensayo de pocillos, fondo redondo con tapaFisher Sci07-200-760sin tratar, estéril
Eppendorf  Investigación plus Pipeta multicanalEppendorfTI1369005230-300ul volumen
Fisherbrand  Isotemp Digital Baños Secos/Calentadores de BloqueFisher Sci88-860-023
Eppendorf  MixMateEppendorf21-379-00
Centrífuga Eppendorf 5810RFisher Sci05-413-112
Centrífuga Avanti J-26 XPI Beckman393127
MultiFlo FX Dispensador multimodoBioTek
Rotor HDA   Instrumentos cantantes
Research

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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