Inducción quirúrgica simple de pérdida auditiva conductiva con verificación mediante la visualización del otoscopio y la respuesta de golpe de golpe conductual en Rata

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para establecer una inducción de pérdida auditiva conductiva replicable a través de la punción quirúrgica de la membrana timpánica y la verificación por visualización del otoscopio y evaluación del comportamiento por golpe de aplauso.

Resumen

La hipoacusia conductiva (CHL) es una deficiencia auditiva prevalente en los seres humanos. El objetivo del protocolo es describir un procedimiento quirúrgico simple para inducir CHL en roedores. El protocolo demuestra CHL por punción de membrana timpánica. La verificación de la cirugía de CHL fue por examen de otoscopio y evaluación del comportamiento por respuesta de sobrescopio de aplausos, replicable y confiable, y son métodos simples para demostrar que se ha producido pérdida auditiva. El sencillo procedimiento de CHL es ventajoso debido a su reproducibilidad y flexibilidad para diferentes actividades en la investigación de pérdida auditiva. Las limitaciones de inducir CHL por un enfoque quirúrgico se asocian con la curva de aprendizaje para realizar el procedimiento quirúrgico y la confianza en el examen audiológico. Inducir una discapacidad auditiva por CHL permite estudiar fácilmente las manifestaciones neuronales y los resultados conductuales de la pérdida auditiva.

Introducción

La prevalencia de la pérdida auditiva en niños y adultos es de aproximadamente 19,5%¹ y 15,2%² respectivamente. Sin embargo, aproximadamente el 39,3% de todos los recién nacidos con un examen auditivo anormal no reciben tratamiento corrector según lo informado por los Centros para el Control de Enfermedades³. La pérdida auditiva es una condición ampliamente estudiada, y el roedor es un modelo robusto para estudiar trastornos normales relacionados con la audición y la audición^{4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15}. Los trastornos auditivos como la hipoacusia conductiva (CHL) conducen a un aumento de la depresión sináptica a corto plazo en la corteza auditiva^4,lo que da lugar a pendientes psicométricas más superficiales asociadas con umbrales de detección de modulación de frecuencia ⁵. Los modelos de pérdida auditiva conductiva por extracción quirúrgica/desplazamiento del malleus, la punción de la membrana timpánica (TM) o el tapón para los oídos se emplean fácilmente y permiten la inducción rápida del modelo de pérdida auditiva^{5,14 ,15,16,17,18}. El objetivo del protocolo y método actual es demostrar un modelo CHL simple y reproducible en roedores.

El protocolo actual es barato (USD$300 con todas las herramientas), y fácilmente modificable para diferentes actividades de investigación. La rata ha tenido evaluaciones detalladas de la anatomía del oído medio^{19,20,21,22,23}, enfoques quirúrgicos²⁴, modelos en otitis media^{25, 26,27} y TM regeneración de pinchazos^{16,17,18,28,29,30}, por lo que es un modelo ideal para estudiar pérdida auditiva. Aquí, un procedimiento de inducción de CHL simple se describe con la verificación por otoscopio y evaluación del comportamiento con respuesta de sobregolpe de aplausos en rata, que luego se puede utilizar para explorar secuencias adicionales de pérdida auditiva. El procedimiento de CHL es inducido por punción quirúrgica de la TM. La verificación del procedimiento CHL se realiza mediante visualización de otoscopio para determinar la ausencia de la TM. La evaluación del comportamiento se realiza mediante un aplauso manual de alto nivel de presión sonora (SPL) de decibelios (dB). Este método se ha aplicado previamente en una variedad de roedores. Es fácil de replicar, produce fuertes diferencias psicométricas y cambios en las respuestas fisiológicas neuronales^4,5,16,17,18.

Protocolo

El presente estudio y procedimientos fueron aprobados por los comités de ética de investigación animal de la Universidad de la Ciudad de Hong Kong, la Universidad de Hong Kong y el Departamento de Salud de la Región Administrativa Especial de Hong Kong.

1. Animales

1. Utilice ratas Sprague-Dawley (SD) de dos meses (N .90, 200-250 g).
   NOTA: Los roedores fueron proporcionados por la Unidad de Animales de Laboratorio acreditada de la Universidad de Hong Kong.
2. Mantener las ratas bajo una temperatura constante de 25oC y 60-70% de humedad en la Unidad de Investigación Animal de Laboratorio.
3. Casa de roedores en ciclos de luz/oscuridad de 12/12 h con acceso a alimentos y agua potable, ad libitum.
4. Aclimatar a los roedores al entorno de la vivienda durante al menos un día antes de la cirugía de CHL.
5. Recoger el roedor por el escruff y anestesiar al roedor con un cóctel de ketamina y xilazina (80-100 mg/kg: 5-10 mg/kg, respectivamente) a través de inyección intraperitoneal (combinar 1,0 ml de ket de amina con 0,5 ml de xilazina como concentración final).
   NOTA: Utilice una jeringa de 1 ml con una aguja de 23-25G. Inyectar aproximadamente 0,2 ml por 100 g de peso corporal de la rata durante 30 minutos de anestesia.
6. Realice el pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del rallado para verificar la sensación de dolor y para corroborar la anestesia adecuada. Una reacción al pellizco profundo del dedo del pies (por abstinencia de la extremidad posterior) indica anestesia insuficiente.

2. Configuración quirúrgica

1. Esterilice todos los equipos en un esterilizador de cuentas de autoclave o vidrio caliente antes de comenzar la cirugía. Limpie el área quirúrgica con 70% de etanol.
2. Use guantes de látex y bata de laboratorio antes de iniciar el procedimiento.
3. Coloque una cortina quirúrgica estéril en el banco limpio(Figura 1A).
4. Esterilizar microtijeras y un otoscopio antes de la cirugía para minimizar la infección del oído(Figura 1B).
5. Coloque las microtijeras y el otoscopio en el área estéril.
6. Coloque el roedor en el campo quirúrgico y alineado con el cirujano.
7. Proceder con la inducción quirúrgica de CHL.

3. Inducción quirúrgica de la hipoacusia conductiva

1. Coloque la cola y la cabeza del roedor alineados en una posición propensa, la cabeza más cercana al cirujano.
2. Visualizar el oído izquierdo y derecho del roedor bajo el otoscopio para asegurar una membrana timpánica saludable(Figura 2a). Evalúe el oído derecho e izquierdo de cada roedor para verificar la condición saludable antes de la inducción de CHL.
3. Agarre la hélice del oído y extienda el canal auditivo externo (es decir, canal auditivo, carnoso auditivo externo, canal auditivo aquí) para hacer que el interior se oscurezca y ennegrezca por la profundidad. Aquí, el canal auditivo se hace perpendicular a la superficie de la TM.
   NOTA: Asegúrese de que el cannel auditivo sea directamente paralelo ahora y que la TM forme un ángulo recto con el eje de inserción de las microtijeras. Se visualizará como un tubo negro sin luz. A veces, el canal auditivo necesita ser inclinado en un ángulo leve, aproximadamente 15o a la superficie plana del cráneo. Esto garantiza que la mano del cirujano sea perpendicular a la superficie de la TM.
4. Introducir las microtijeras en el centro del canal auditivo prestando atención a no desnatar o rasgar el tejido del canal auditivo y proceder ligeramente, aproximadamente a 5 mm del centro de la oscuridad, empujando hacia adelante suavemente a través del centro de la TM.
   NOTA: La punción TM puede ser confirmada por un sonido pop cuando las puntas de la micro-tijera perforan la TM. El sonido de estallido se puede escuchar a aproximadamente 2 min 52 s en el video. Esto no es un sonido de tijera; este es un sonido de punción TM. Como se mide el post-análisis, el "pop" es aproximadamente 20 dB SPL mayor que el sonido de fondo grabado por un micrófono de alta frecuencia. No hay necesidad de verificar el sonido "pop" en esta medida, la visualización del otoscopio es suficiente. Es posible que el investigador tenga que practicar para asegurarse de que se escucha un "pop" durante cada procedimiento de CHL.
5. Abra inmediatamente las microtijeras de resorte y gire tres veces después de puntuar la TM para asegurar el desplazamiento de la cabeza del malleus lejos de la TM (sólo si se desea desplazamiento de malleus).
6. Retire las microtijeras y coloque el roedor debajo del otoscopio para su visualización.
   NOTA: Es importante tener en cuenta que no debe producirse ningún sangrado significativo después del procedimiento quirúrgico. Eutanasia al roedor y no proceda a la evaluación del comportamiento si se produce sangrado.
7. Inducir chL bilateral procediendo como arriba en el oído opuesto.

4. Visualización del otoscopio

1. Confirme una cirugía exitosa de CHL con un otoscopio utilizando un espéculo de diámetro pequeño para visualizar el oído medio del roedor.
2. Evalúe cada roedor antes y después del procedimiento quirúrgico de CHL debajo del otoscopio. Asegurar la confirmación de TM normal(Figura 2a)y TM dañada después de la inducción de CHL(Figura 2b).
3. Cuidado postoperatorio para el roedor
   1. Coloque el roedor en la jaula de casa bajo una lámpara caliente.
   2. Observe la inducción posterior a CHL del roedor hasta que el roedor se eniture.
   3. Inyectar el roedor con suero de glucosa (dextrosa/salina) para recuperar la conciencia y colocar el roedor en la jaula natal para su recuperación.
      NOTA: Utilice una aguja de 23G con una jeringa de 10 ml para inyectar 5 ml de salina después de la cirugía de CHL.
   4. Inyectar el roedor a través de intramuscular con Enrofloxacino antibacteriano 0,05 mg/kg dos veces durante el período de recuperación de 24 horas.
   5. Observe al roedor regularmente para ver si el comportamiento o los síntomas del dolor después de la cirugía.

5. Evaluación del comportamiento (validación de la inducción de CHL) - respuesta de sobresmáxima de aplausos

1. Corroborar CHL (después de la confirmación del otoscopio) 24 h después de la cirugía con la evaluación conductual que consiste en la prueba de aplauso-arranque.
2. Coloque la rata inducida por CHL junto a una rata normal en dos jaulas adyacentes separadas.
3. Coloque a los roedores en una habitación silenciosa.
4. Permanecer de pie aproximadamente a 0,5 m de distancia de los roedores y proceder a aplaudir en duraciones igualmente espaciadas un número de veces (5 aplausos fueron elegidos y espaciados más de 1 segundo).
   NOTA: El sobresalto de aplausos producido por el aplauso de mano medido a 40 dB SPL mayor que el sonido de fondo grabado por un micrófono de alta frecuencia.

Resultados

El sencillo procedimiento de CHL se realizó en 90 ratas y de este grupo 2 tuvo sangrado significativo y 2 no tuvieron pérdida de audición al día siguiente, según lo evaluado por el contragolpe de aplausos conductuales. Estas cuatro ratas fueron descartadas. Las ratas deben descartarse como se describe por las razones en la discusión debido a complicaciones. Inducir la punción y/o el desplazamiento/eliminación de la TM (Figura 2B) provoca CHL, lo que resulta e...

Discusión

Describimos una simple inducción quirúrgica de CHL con verificación utilizando la visualización del otoscopio y la respuesta de sobregolpe de aplausos conductuales en rata. Aquí demostramos el método en rata y anteriormente este método se ha aplicado a jerbos y ratones. El método se puede adoptar fácilmente a otros roedores. La inducción de CHL permite el estudio de una forma sutil de pérdida auditiva que se manifiesta en alteraciones corticales auditivas y hallazgos psicofísicos del comportamiento⁴

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Guantes de látex, polivinilo o nitrilo	AMMEX		Utilice guantes sin polvo Tijeras Micro Spring de 8 milésimas de pulgada
(ver Fig. 1b)	RWD Life Science	S11035-08	8.0 cm de longitud total, con filo de corte de 3.5 mm, o micro pinzas similares. Las pinzas estándar con acción de resorte serán suficientes
Otoscopio mini 3000	HEINE	D-008.70.120M El	otoscopio LED estándar será suficiente
Rata o ratón	JAX labs		Cualquier roedor pequeño
Jaula para roedores pequeña	Tecniplast	1284L	Necesita dos jaulas para separar el roedor CHL del roedor oyente. Si los roedores están en contacto directo entre sí, se asustarán entre sí. Dimensiones de la jaula 365 x 207 x 140 mm, superficie del suelo: 530 cm2/82,15 in2