Method Article

Análisis transcriptómico de unicelular de células endocrinas pancreáticas de ratón

DOI:

10.3791/58000

⸱

September 30th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Sciences, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Peking University, 2Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University, 3PKU-Tsinghua-NIBS Graduate Program, Peking University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se describe un método para el aislamiento de las células endocrinas del páncreas embrionarios, neonatales y postnatales seguidos por la secuencia de RNA unicelular. Este método permite el análisis del desarrollo del linaje endocrino pancreático, de células dinámicas heterogeneidad y transcriptómicos.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células endocrinas pancreáticas, que se agrupan en islotes, regulan la estabilidad de la glucosa sanguínea y el metabolismo energético. Los tipos de células distintos en islotes, incluyendo células β secretoras de insulina, se distinguen de los comunes progenitores endocrinos durante la fase embrionaria. Inmaduras células endocrinas amplían a través de la proliferación celular y maduran durante un periodo de desarrollo postnatal largo. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a estos procesos no están claramente definidos. Sola célula secuenciación del RNA es un enfoque prometedor para la caracterización de poblaciones celulares distintas y las vías de diferenciación de seguimiento celular linaje. Aquí, describimos un método para la secuenciación del RNA unicelular de células β pancreáticas aisladas de páncreas embrionarios, neonatales y postnatales.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El páncreas es un órgano vital metabólico en mamíferos. El páncreas está compuesto por compartimientos endocrinos y exocrinos. Las células endocrinas pancreáticas, incluyendo las células β productoras de insulina y células productoras de glucagón α, se agrupan juntos en los islotes de Langerhans y coordinadamente regulan la homeostasis de la glucosa sistémica. Resultados de la disfunción de las células endocrinas en la diabetes mellitus, que se ha convertido en un problema de salud pública importante en todo el mundo.

Las células endocrinas pancreáticas derivan de Ngn3+ progenitores durante embriogénesis1. Más tarde, durante el período perinatal, las células endocrinas proliferan a islotes inmaduro forma. Estas células inmaduras continúan desarrollar y gradualmente se convierten en islotes de madurados, que se convierten en ricamente vascularizados para regular la homeostasis de la glucosa de sangre en adultos2.

Aunque se ha identificado un grupo de factores transcripcionales que regulan la diferenciación de la célula β, el camino preciso de la maduración de las células β es todavía confuso. Además, el proceso de maduración de la célula β implica también la regulación de la célula número expansión3,4 y la generación de heterogeneidad celular5,6. Sin embargo, los mecanismos de regulación de estos procesos no han sido bien estudiados.

Sola célula secuenciación del RNA es un enfoque potente perfil subpoblaciones celulares y traza de vías del desarrollo de linaje celular7. Tomando ventaja de esta tecnología, la clave de los eventos que ocurren durante el desarrollo de islotes pancreáticos pueden ser descifrados en el nivel unicelular8. Entre los protocolos de la secuencia de RNA unicelular, Smart-Sec2 permite la generación de cDNA de larga duración con mejor sensibilidad y precisión y el uso de reactivos estándar en menor costo9. Smart-Sec2 tarda aproximadamente dos días para construir una biblioteca de cDNA de la secuencia10.

Aquí proponemos un método para el aislamiento de las células β marcados con fluorescencia desde el páncreas del feto adulto Ins1 RFP ratones transgénicos11usando celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación, y el rendimiento de transcriptómicos analiza en el sola célula nivel, usando la tecnología Smart-Sec2 (figura 1). Este protocolo puede extenderse para analizar los transcriptomas de todos los tipos de células endocrinas pancreáticas en Estados normales, patológicos y el envejecimiento.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Pekín.

1. páncreas aislamiento

  1. Para embriones E17.5 (día embrionario 17.5):
    1. Estimar embrionario día 0.5 basado en el momento cuando aparece el tapón vaginal.
    2. Sacrificar a los ratones embarazados por la administración de CO2 . Rocíe la piel abdominal con alcohol al 70%.
    3. Haga una incisión en forma de V con tijera de la ampliación de la zona genital a las costillas. Este proceso abrirá completamente la cavidad abdominal.
    4. Disecar el útero fuera de la cavidad abdominal y colocar en un plato de 10 cm que contiene PBS frío.
    5. Diseccionar los embriones del útero con pinzas con punta fina bajo un estereomicroscopio, eliminación de otros tejidos, como la placenta y del cordón umbilical. Coloque todos los embriones en un plato de 10 cm que contiene PBS frío.
    6. Rasgar abierto la cavidad abdominal de los embriones y sacar el tejido visceral con una pinza de codo. Transferir el tejido visceral en un plato de fondo negro de 6 cm que contiene PBS frío.
    7. El páncreas está situado en la parte superior izquierda del abdomen y se conecta al estómago, el bazo y el duodeno (línea amarilla punteada en la figura 2A)12. Separar el páncreas de los tejidos viscerales con unas pinzas y el tejido pancreático de la piscina juntos en un frasco de 20 mL que contiene 5 mL de solución de colagenasa frío 0,5 mg/mL: colagenasa de 0.5 mg/mL P en tampón de aislamiento (HBSS conteniendo 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2 5 mM de glucosa, pH 7.4).
  2. Para los ratones de la P0-P15 (día postnatal 0-15):
    1. Sacrificio y fijar el ratón adhiriendo a las extremidades a un pedazo de banco protector con cinta. Rocíe la piel abdominal con alcohol al 70%.
    2. Abrir completamente la cavidad abdominal como se describe en el paso 1.1.3. Tire el intestino hacia fuera y al lado izquierdo del ratón. Este procedimiento expone los lóbulos esplénicos, gástricos y duodenales del páncreas. Diseccionar todos los lóbulos del páncreas (figura 2B)12 y piscina el tejido pancreático juntos en un frasco de 20 mL que contiene 5 mL de solución de colagenasa frío 0,5 mg/mL.
  3. Para los ratones P18-P60 (día postnatal 18-60):
    1. Preparar la solución de la colagenasa. Mantenga en hielo hasta que esté listo para su uso.
    2. Sacrificar el ratón y abrir la cavidad abdominal, como se mencionó anteriormente (paso 1.1.2 y 1.1.3).
      Nota: No hacen daño al hígado, cualquier herida en el hígado se reduzca la presión de flujo en el conducto biliar y reducir la eficacia de la perfusión del siguiente paso.
    3. Retire el xifoides. Tire el intestino y a la derecha del ratón y empuje los lóbulos mediales derecho e izquierdos del hígado a cada lado para exponer la vesícula biliar (flecha blanca en la figura 2) y el conducto biliar común.
    4. Sujete el duodeno con un par de vasos de abrazaderas en la posición superior e inferior, que flanquean el sitio donde el conducto biliar entra en el duodeno (Figura 2D).
      Nota: No fije los lóbulos del páncreas gástricos o esplénicos. La solución de colagenasa no fluirá en el lóbulo gástrico y esplénico del páncreas en el paso siguiente si la sujeta.
    5. Llene una jeringa con 5 mL de 0.5 mg/mL de solución de colagenasa frío e inserte una aguja de 30 G en la vesícula biliar. Con cuidado y suavemente, manipular la aguja a través del conducto biliar común.
    6. Perfusión del páncreas mediante la inyección de 1 – 5 mL de solución fría colagenasa de 0.5 mg/mL, dependiendo del tamaño del ratón. La inyección debe ser lenta y constante para evitar que la aguja se deslice fuera del conducto y para evitar que el intestino reviente bajo alta presión de líquido. La inyección es completa cuando el páncreas se expande completamente.
    7. Diseccionar el páncreas (la línea amarilla punteada en la Figura 2D) fuera de la cavidad abdominal utilizando fórceps inmediatamente después de la perfusión. Coloque el tejido en un frasco de 20 mL que contiene 5 mL de solución de colagenasa frío 0,5 mg/mL. Si manipular más de un ratón a la vez, inundar los ratones uno por uno y los tejidos de la piscina en solución de colagenasa frío en un frasco de 20 mL hasta que todos los ratones han sido disecados.

2. colagenasa digestión y aislamiento de islotes pancreáticos

  1. Coloque el frasco de 20 mL que contiene el tejido pancreático en un baño de agua de 37 ° C e incubar durante 3 minutos equilibrar la temperatura.
  2. Agitar suavemente el tubo para otros 3 a 5 minutos. Si el tejido pancreático está totalmente inflado, poco a poco se disocian en pedazos pequeños de tejido hasta que finalmente se dispersa uniformemente. El tiempo de digestión varía dependiendo del tamaño del páncreas y la eficacia de la perfusión.
  3. Filtrar el producto digerido a través de un filtro de nylon de 0.25 mm en un nuevo tubo de centrífuga de 50 mL. Fondo Lave el filtro usando una jeringa de 20 mL con PBS helado.
  4. Para páncreas E17.5-P15, vaya al paso 3.1.
  5. P18-P60 páncreas, centrifugar a 200 x g durante 1 min y descartar el sobrenadante. Vuelva a suspender el tejido con PBS frío.
  6. Vierta 5 mL de la suspensión de tejido en un fondo negro 6 cm. Los islotes pancreáticos son estructuras blanco lechosas, pequeño y compactas y tejido acinar es flojo y translúcido blanco. Elegir islotes con pipeta 200 μL y transferirlos a un tubo de 1,5 mL que contiene una pequeña cantidad de PBS frío.

3. tripsina digestión de tejidos pancreáticos o islotes

  1. Centrifugar el tubo que contiene el tejido pancreático o islotes a 200 x g durante 1 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante sin perturbar el pellet.
  2. Resuspender el sedimento con 0.25% tripsina-EDTA e incubar en un baño de agua de 37 ° C. Después de 4 min de incubación, suavemente y de vez en cuando aspire (pipeta) durante 1 min, utilizando 200 μL puntas.
    Nota: Para el páncreas E17.5-P3, añadir 1 mL de tripsina-EDTA. Para páncreas P4-P15, añadir 3 mL de tripsina-EDTA. 100-300 islotes, añadir 1 mL de tripsina-EDTA. Ajustar el volumen de tripsina-EDTA según la cantidad de tejido.
  3. Detener la digestión mediante la adición de volumen de x 0,4 de frío suero bovino fetal (FBS) y mezclar por vortex suave.
  4. Centrifugar a 250 x g durante 3 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante sin perturbar el pellet.
  5. Resuspender las células con tampón FACS frío de 200 μL (HBSS conteniendo 1% FBS, pH 7,4). Transferir las células a un tubo de 5 mL FACS.
  6. Rápidamente gira el tubo de FACS para permitir la suspensión de células a pasar por el filtro para eliminar los restos de tejido grandes sin digerir. La suspensión de células individuales en el tubo ya está lista para la clasificación de FACS.

4. sola célula Lysis

  1. Preparar el tampón de lisis celular.
    Nota: Realizar todos los experimentos bajo una campana de esterilización UV con flujo laminar. Todos los tubos, placas y puntas de pipeta deben ser Rnasa DNasa- libre. Descontamine la campana y pipetas solución lejos de Rnasa antes de su uso.
    1. Descongelar los reactivos en el hielo: dNTP (10 mM), cartilla de oligo-dT (10 μM) y ERCC stock solución (1:20).
    2. Diluir la ERCC 1:5 x 105 con agua libre de nucleasa.
    3. Calcular el volumen de tampón de lisis de la célula necesitada. Agregar 0.1 μL de inhibidor de Rnasa (40 U/μL), 1.9 μL de 0.2% (vol/vol) Tritón X-100, 1 μL de dNTP, 1 μL de cebador oligo-dT y 0.05 μL de ERCC diluido a un volumen final de 4.05 μL de cada celda.
    4. Alícuota del tampón de lisis celular en tubos de PCR de 0.2 mL pared delgada 8 rayas o placas de 96 pocillos. Centrifugar los tubos o placas para 30 s a 4 ° C.
      Nota: Centrifugar tubos de PCR de 0.2 mL pared delgada raya 8 a 7500 x g y placas de 96 pocillos en 800 g de x en los siguientes pasos.
  2. Sola célula cosecha y lisis.
    1. Manualmente pick FACS clasifica las células Ins1-RFP+ en tampón FACS en tira de 8 tubos PCR con una pipeta capilar de 30 a 40 μm, u ordenar directamente las células Ins1-RFP+ en placas de 96 pocillos. El volumen que contiene una sola célula se considera menos de 0,3 μL.
      Nota: Uso forward scatter (FSC-H) de altura vs avance área de scatter (FSC-A) bloquea estrategia de discriminación de doblete, FSC-H vs lado área de dispersión (SSC-A) para la ruina y fluorescencia gating Ins1-RFP+ celular (Figura 3A-3C) clasificación. Para el método de cosecha, clasificar las células blanco en un tubo de 1,5 mL con 300 μL tampón de FACS. La concentración final adecuada es 5-10 células/μL. Ayuste el volumen de tampón. Para el método de colección de placa, ordenar una sola celda en cada pocillo de una placa de 96 pocillos siguiendo el manual del instrumento. 7 , 13
    2. Vórtex los tubos o placas para lyse las células y liberar el ARN. Centrifugar los tubos o placas para 30 s a 4 º C e inmediatamente coloca en hielo.
      Nota: Las células pueden almacenarse a-80 ° C durante una semana.

5. unicelular cDNA amplificación

  1. Transcripción reversa (RT).
    1. Descongelar los reactivos de RT (tabla 1) en el hielo.
    2. Incubar las muestras a 72 ° C por 3 min y poner de inmediato los tubos o placas de hielo durante al menos 1 min brevemente Centrifugue los tubos o placas para 30 s a 4 ° C.
      Nota: Utilice un termociclador con una tapa de 105 ° C calentado para incubaciones todos.
    3. Preparar la mezcla de RT para todas las reacciones, como se describe en la tabla 1.
    4. Dispense 5.7 μL de mezcla de RT a cada muestra para llevar el volumen a un total de 10 μL. Suavemente la mezcla de vortex y centrifugar durante 30 s a 4 ° C.
    5. Coloque las muestras en un termociclador e inicia el programa de RT como sigue: 42 ° C por 90 min, 10 ciclos (50 ° C por 2 min, 42 ° C por 2 min), 70 ° C por 15 minutos y mantenga a 4 º C.
  2. La amplificación por PCR.
    1. Descongelar los reactivos de PCR (tabla 2) en el hielo.
    2. Preparar la mezcla PCR para todas las reacciones, como se describe en la tabla 2.
    3. Dispensar 15 μL de la mezcla PCR para cada muestra, que contiene las reacciones de primera línea. Suavemente la mezcla de vortex y centrifugar durante 30 s a 4 ° C.
    4. Coloque las muestras en un termociclador y comenzar el siguiente programa PCR: 98 ° C por 3 min, 18 ciclos (98 ° C por 20 s, 67 ° C por 15 s, 72 ° C durante 6 min.), 72 ° C por 5 min y mantener a 4 ° C.
      Nota: El producto PCR puede almacenarse a 4 ° C durante menos de una semana o a-20 ° C /-80 ° C hasta por 6 meses.
  3. Purificación de la polimerización en cadena.
    1. Añadir 25 μL de suspende de nuevo cuentas de purificación de ADN (1 x) para cada muestra del paso anterior y mezclar bien por vortex. Entonces, rápidamente hacer girar el tubo o placas a temperatura ambiente para recoger el líquido, pero evite la solución de los abalorios.
      Nota: Equilibrar cuentas de purificación de ADN a temperatura ambiente durante 15 minutos y agitar bien antes de usar.
    2. Incubar por 5 min a temperatura ambiente.
    3. Lugar el tubo o placa en un magnética hasta que la solución es clara, entonces cuidadosamente retire y descarte el sobrenadante.
    4. Añadir 200 μL de etanol de 80% recién preparado para lavar los granos mientras que en el soporte magnético, incube durante 30 s, luego retire con cuidado y deseche la solución de etanol.
      Nota: La solución de etanol 80% (vol/vol) debe estar preparada fresco cada vez.
    5. Repita el paso 5.3.4 para un total de dos lavados.
    6. Cuidadosamente retire y deseche el resto de solución de etanol y aire secan los granos mientras que el tubo o placa es en soporte magnético.
      Nota: Evitar que se sequen demasiado los granos para asegurar la eficacia máxima de la elución.
    7. Añadir 11 μL de agua libre de nucleasa para eluir el destino del ADN de los granos y mezclar por vortex. Entonces, rápidamente hacer girar el tubo o placa y colocarlo en un soporte magnético hasta que la solución es clara. Transferir 10 μL de la muestra a un nuevo tubo PCR.
      Nota: Si existen dímeros después de una sola ronda de purificación, basado en la detección de distribución de tamaño de cDNA, purificar nuevamente para eliminar totalmente los dímeros. Los dímeros pueden influir en el cálculo de la producción de cDNA si permanecen en la muestra.
  4. Control de calidad del cDNA.
    1. Elegir al azar las muestras para detectar la producción total de cDNA usando un fluorómetro.
    2. Evaluar los niveles de expresión del gen marcador por PCR en tiempo real (qPCR) (figura 4E). Quitar 1 μL de la muestra y diluir 40 veces y realizar qPCR utilizando una placa de 384 pozos. Preparar la mezcla de qPCR como se describe en la tabla 3. Condiciones de ciclismo: 95 ° C durante 10 min, 45 ciclos (95 ° C durante 10 s, 60 ° C durante 15 s, 72 ° C por 15 s).
    3. Elegir al azar las muestras para detectar la distribución de tamaño utilizando un instrumento de electroforesis capilar en paralelo.

6. construcción de la biblioteca de cDNA

  1. Reacción de Tagmentation por el Tn5 transposasa.
    1. Detectar el rendimiento total de cDNA de células seleccionadas de qPCR de paso 5.4.2 con un fluorómetro. Uso 2 ng de cDNA como material de partida.
    2. Descongelar los reactivos de la reacción de tagmentation (tabla 4) en el hielo.
    3. Preparar la reacción de tagmentation en un tubo PCR 0.2 mL pared delgada 8-raya, como se describe en la tabla 4y mezclar cuidadosamente en el vórtex. Luego, girar rápidamente por la solución a temperatura ambiente.
    4. Incubar las muestras a 55 ° C durante 10 minutos y mantener a 4 ° C.
    5. Inmediatamente añadir 2 μL de TS x 5 para cada muestra que contiene el tagmented ADN para detener la reacción. Mezclar cuidadosamente por vortex y luego girar rápidamente por la solución a temperatura ambiente.
    6. Incubar la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente. El ADN debe procesarse inmediatamente para el enriquecimiento final PCR.
  2. Amplificación de fragmentos de ligarse por el adaptador.
    1. Descongelar los reactivos de PCR (tabla 5) en el hielo.
    2. Preparar la mezcla PCR de enriquecimiento, como se describe en la tabla 5y mezclar cuidadosamente en el vórtex. Luego, girar rápidamente por la solución a temperatura ambiente.
    3. Llevar a cabo la polimerización en cadena con el siguiente programa: 72 ° C por 10 min, 98 ° C por 30 s, 8 ciclos (98 ° C por 15 s, 60 ° C durante 30 s, 72 ° C por 3 min), 72 ° C por 5 min y mantener a 4 ° C.
      Nota: El número de ciclos depende de la cantidad de ADN de la biblioteca prevista.
  3. Purificación de PCR con selección de tamaño.
    1. Añadir 14 μL de granos de purificación de ADN suspendidos de nuevo (x 0.7) para cada muestra del paso anterior y mezclar bien por vortex. Entonces, rápidamente hacer girar el tubo a temperatura ambiente para recoger el líquido, pero evite la solución de los abalorios.
      Nota: Equilibrar cuentas de purificación de ADN a temperatura ambiente durante 15 minutos y agitar bien antes de usar.
    2. Incubar por 5 min a temperatura ambiente.
    3. Coloque el tubo sobre un soporte magnético apropiado hasta que la solución es clara, cuidadosamente transferir el sobrenadante a una nueva tira de tubo y descartar la anterior banda de tubo.
    4. Agregar 3 μL de suspende de nuevo cuentas de purificación de ADN (0.15 x) a cada muestra en la banda tubo y mezcle bien por vortex. Entonces, rápidamente hacer girar el tubo a temperatura ambiente.
    5. Incubar por 5 min a temperatura ambiente.
    6. Lugar el tubo o placa en un magnética hasta que la solución es clara, entonces cuidadosamente retire y descarte el sobrenadante.
    7. Añadir 200 μL de etanol de 80% recién preparado para lavar los granos mientras que en el soporte magnético, incube durante 30 s, luego retire con cuidado y deseche la solución de etanol.
      Nota: La solución de etanol 80% (vol/vol) debe estar preparada fresco cada vez.
    8. Repita el paso 6.3.7 para un total de dos lavados.
    9. Cuidadosamente retire y deseche el resto de solución de etanol y aire secan los granos mientras que el tubo o placa es en soporte magnético.
      Nota: Evitar que se sequen demasiado los granos para asegurar la eficacia máxima de la elución.
    10. Añadir 11 μL de agua libre de nucleasa para eluir el destino del ADN de los granos y mezclar por vortex. Entonces, rápidamente hacer girar el tubo o placa y colocarlo en un soporte magnético hasta que la solución es clara. Transferir 10 μL de la muestra a una banda nueva de tubo.
  4. Control de calidad de la biblioteca del cDNA final.
    1. Medir la concentración de cada biblioteca con un fluorómetro y verificar la distribución de tamaño utilizando un instrumento de electroforesis capilar en paralelo.
      Nota: El rendimiento de ADN es normalmente entre 15-25 ng de cada biblioteca. Los fragmentos que van desde 250 bp a 450 bp se observará. Si dímeros permanecen después de la purificación, según lo confirmado por el control de la distribución de tamaño, purificar con 1 x granos de purificación de ADN una vez más.
  5. Agrupación de biblioteca
    1. Basado en el tamaño del fragmento aproximado, de cantidades iguales de la piscina del ADN de cada muestra, asegurándose que ninguno de ellos contiene las mismas combinaciones de adaptadores N6XX y N8XX.

7. secuencia de ADN

  1. Tema bibliotecas de código de barras para 51 secuencia de fin single bp utiliza un sistema de secuenciación de alto rendimiento. Realizar la secuenciación siguiendo el protocolo del fabricante. La profundidad de la secuencia de cada célula es aproximadamente 1 millón en promedio Lee8, Lee al menos 0,5 millones por celular14.

8. bioinformática análisis

  1. Evaluación de la calidad de la secuencia y la alineación.
    1. Evaluar la calidad de la secuencia Lee con FastQC (v0.11.3)15 de los siguientes parámetros: "fastqc - extracto -o output_dir input_fastq".
    2. El genoma del ratón se funden con las secuencias de la ERCC mediante el comando "cat mm10.fa ERCC.fa > mm10_ERCC.fa".
    3. Construir bowtie2 (v2.2.5)16 índice con los siguientes parámetros: "construir bowtie2 mm10_ERCC.fa mm10_ERCC".
    4. Alinear utilizando tophat2 Lee (2.1.0)17 con los siguientes parámetros: "tophat2 -o output_dir -G gene.gtf - transcriptoma-index trans_index mm10_ERCC input_fastq".
  2. Cuantificar los niveles de expresión génica.
    1. Lee cuenta asignada para cada gen usando HTSeq (v 0.6.0)18 con los siguientes parámetros: '' htseq-Conde - f bam - r pos -s no - a 30 gene.gtf de accepted_hits.bam > read_count.txt''.
    2. Normalizar los niveles de expresión génica de las transcripciones por millones (TPM)19.
  3. Control de calidad de las células.
    1. Excluir las células con menos de 0,5 millones de lecturas asignadas o menos de 4.000 genes (TPM > 1).
      Nota: el criterio de exclusión depende de los tipos de la célula y la profundidad de la secuencia.
    2. Conservar las células que expresan marcadores endocrinos (por ejemplo, Ins1 para las células β, Gcg para células α) y excluir las células que expresan marcadores no-endocrina (e.g., Spi1 para leucocitos).
  4. Análisis de componentes principales (PCA)
    1. Identificar genes altamente variables según ERCC punto-ins, como se describió anteriormente20.
    2. Realizar PCA usando la función "PCA" en la R paquete FactoMineR (v1.31.4)21, con el log2(TPM + 0.1) de genes altamente variables.
    3. Visualizar los resultados PCA con ggplot2 (v2.0.0)22.
  5. Jerárquico de agrupamiento.
    1. Identificar genes con las más altas cargas de componentes principales (PC) utilizando la función "dimdesc" FactoMineR (v1.31.4)21.
    2. Realizar clustering jerárquico con la función "heatmap.2" en el paquete de R gplots (v3.0.1)23, log2 (TPM + 1) valores relativos de PC alta carga de genes.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se disecaron páncreas de ratones embrionarios, neonatales y postnatales (figura 2A y 2B). Para los ratones mayores de postnatal día 18, el efecto digestivo depende del grado de perfusión; por lo tanto, la inyección es el paso más importante para el aislamiento de islotes pancreáticos (figura 2-2E y tabla 6). Se inyectó tanto colagenasa como fue posible llenar el...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este protocolo, hemos demostrado un método efectivo y fácil de usar para el estudio de los perfiles de expresión de la sola célula de las células β pancreáticas. Este método podría utilizarse para aislar las células endocrinas del páncreas embrionarios, neonatales y postnatales y realizar análisis transcriptómico de unicelulares.

El paso más crítico es el aislamiento de las células β solo en buen estado. Páncreas totalmente inundadas responden mejor a la digestión subsiguiente. Insuficiente...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos el Centro Nacional de Ciencias de la proteína, Beijing (Universidad de Pekín) y el centro Tsinghua de Pekín para la plataforma de computación de Ciencias de la vida. Este trabajo fue financiado por el Ministerio de ciencia y tecnología de China (2015CB942800), la nacional Ciencias naturales Fundación de China (31521004, 31471358 y 31522036) y financiación del centro Tsinghua de Pekín para Ciencias de la vida a C. R.X.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Colagenasa PRoche11213873001
Tripsina-EDTA (0,25 %), rojo fenolThermo Fisher Scientific25200114
Suero fetal bovino (FBS)HycloneSH30071.03
Pinzas Dumont #4 RobozRS-4904
Pinzas Dumont #5RobozRS-5058
30 G Aguja BD 1/2" LongitudBD305106
Microscopio estereoscópicoZeissStemi DV4
Microscopio estereoscópico de fluorescenciaZeissStereo Lumar V12
CentrífugaEppendorf5810R
Eppendorf5424R
Tubo de poliestireno de fondo redondo con tapa de filtro de celdasBD-Falcon352235
Microplaca de PCR de 96 pocillosAxygenPCR-96-C
Estera de sellado de siliconaAxygenAM-96-PCR-RD
Tubo de PCR de pocillo finoExtrageneP-02X8-CF
Clasificador de célulasBD BiosciencesBD FACSAria
Pipeta capilarSutterB100-58-10
RNaseZapAmbionAM9780
ERCC RNA Spike-In MixLife Technologies 4456740
Agua destiladaGibco10977
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
dNTPmix New England BiolabsN0447
Inhibidor de ARNasa recombinanteTakara2313
Superscript II transcriptasa inversaInvitrogen18064-014
Tampón de primera cadena (5x)Invitrogen18064-014
DTTInvitrogen18064-014
BetaínaSigma-Aldrich107-43-7
MgCl2Sigma-Aldrich7786-30-3
Agua sin nucleasasInvitrogenAM9932
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)KAPA BiosystemsKK2601
VAHTS DNA Clean Beads XP beadsVazymeN411-03
Qubit dsDNA HS Kit de ensayoInvitrogenQ32854
AceQ qPCR SYBR Green Master MixVazymeQ121-02
TruePrep DNA Library Prep Kit de preparación V2 para IlluminaVazymeTD502Incluye 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE
TruePrep Index Kit V3 para IlluminaVazymeTD203Incluye 16 N6XX y 24 N8XX
Kit de análisis de fragmentos NGS de alta sensibilidadAnalytical TechnologiesDNF-474
1x HBSS sin Ca2+ y Mg2+138 mM de NaCl; 5,34 mM KCl
4,17 mM NaHCO3; 0,34 mM Na2HPO4
0,44 mM KH2PO4
Tampón1 y veces; HBSS que contiene 10 mM de HEPES, 1 mM de MgCl2, 5 mM de glucosa, pH 7,4
tampón1 y veces; HBSS que contiene 15 mM de HEPES, 5,6 mM de glucosa, 1% de FBS, pH 7,4
NaClSigma-AldrichS5886
KClSigma-AldrichP9541
NaHCO3Sigma-AldrichS6297
Na2HPO4Sigma-AldrichS5136
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
D-(+)-GlucosaSigma-AldrichG5767
HEPESSigma-AldrichH4034
MgCl2Sigma-AldrichM2393
Oligo-dT30VN cebador5'-AAGCAGTGGTATCAA
CGCAGAGTACT30 VN-3'TSO
5'-AAGCAGTGGTATCAAC
GCAGAGTACATrGrG+G-3'ISPCR
cebadores5'-AAGCAGTGGTAT
CAACGCAGAGT-3'
Gapdh Imprimación5'-ATGGTGAAGGTC
GGTGTGAAC-3'
Gapdh Imprimación5'- GCCTTGACT
GTGCCGTTGAAT-3'
Ins2 Imprimación5'-TGGCTTCTTC
TACACACCCA-3'
Ins2 Imprimación5'-TCTAGTTGCA
GTAGTTCTCCA-3'
Advanced de aislamiento FACS directa inversa directa inversa

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
  2. Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. On the origin of the beta cell. Genes & Development. 22 (15), 1998-2021 (1998).
  3. Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
  4. Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).
  5. Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756(2016).
  6. Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
  7. Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
  8. Qiu, W. L., et al. Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level. Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).
  9. Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
  10. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  11. Piccand, J., et al. Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice. Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).
  12. Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling. Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).
  13. Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single cell isolation and analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116(2016).
  14. Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75(2017).
  15. Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  16. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  17. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), (2013).
  18. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), Oxford, England. 166-169 (2015).
  19. Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples. Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).
  20. Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).
  21. Le, S., Josse, J., Husson, F. FactoMineR: An R package for multivariate analysis. Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).
  22. Hadley, W. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Springer Science & Business Media. (2009).
  23. Warnes, G., Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Huber, W., Liaw, A., Lumley, T., Mächler, M., Magnusson, A., Möller, S. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data. , Available from: https://cran.r-project.org/package=gplots (2016).
  24. Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
  25. Li, L., et al. Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions. Cell Stem Cell. , (2017).
  26. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  27. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  28. Teo, A. K. K., et al. Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures. Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).

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