Artículo de método

Extracción rápido, seguro y sencillo Manual cabecera de ácido nucleico para la detección del Virus en muestras de sangre entera

DOI:

10.3791/58001

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30 de junio de 2018

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1Virus Research & Development Laboratory, Statens Serum Institut, 2Infectious Disease Research Unit, University of Southern Denmark

En este artículo

Resumen

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Aquí, presentamos un protocolo para la extracción de ácidos nucleicos de virus rápido de la sangre virus inactivado. La extracción se realiza directamente en los tubos para recogida de sangre y no requiere equipo ni electricidad. El método no es dependiente de laboratorios y puede ser utilizado en cualquier lugar (por ejemplo, en hospitales).

Resumen

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El diagnóstico rápido de infección es esencial para el manejo de brote, contención del riesgo y atención al paciente. Previamente hemos demostrado un método para la rápida inactivación cabecera del virus Ebola durante la muestra de sangre para las pruebas de ácido nucleico seguro (NA) mediante la adición de un tampón de lisis/enlace comercial directamente en los tubos de colección de sangre vacío. Usando este método de inactivación de cabecera, hemos desarrollado un seguro, rápido y simplificado cabecera NA método de extracción para la posterior detección de virus en sangre entera inactivado con buffer de lisis/enlace. La extracción de NA se realiza directamente en los tubos para recogida de sangre y no requiere equipo ni electricidad.

Después se recoge la sangre en el buffer de lisis/vinculante, el contenido se mezcla poniendo el tubo con la mano, y la mezcla se incuba durante 20 min a temperatura ambiente. Partículas de vidrio magnético (MGP) se agregan al tubo, y los contenidos son mezclados por el tubo de recogida de los bancos a mano. Los pop son recogidos luego en el lado del tubo de la colección de sangre utilizando un soporte magnético o un imán y una banda de caucho. El pop se lavan tres veces, y después de la adición de tampón de elución directamente en el tubo de colección, NAs están listos para pruebas de NA, como qPCR o amplificación isotérmica lazo (lámpara), sin el retiro de los pop de la reacción. El método de extracción de NA no es dependiente en las instalaciones de laboratorio y puede fácilmente ser utilizado en cualquier lugar (por ejemplo, en hospitales y salas de aislamiento del hospital). Cuando se combina este método de extracción de NA con lámpara y un instrumento portátil, puede obtenerse un diagnóstico dentro de 40 min de la colección de sangre.

Introducción

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En situaciones de brote de virus, cuando los pacientes están confinados a las salas de aislamiento del hospital o cuando se necesita un rápido diagnóstico, una diagnosis molecular del punto de atención de segura, sencilla y precisa es imprescindible para la contención del cuidado y el riesgo del paciente. Dos brotes recientes virales del virus de Ebola (EBOV) en África del oeste (2013) y el virus Zika en América del Sur (2015), han aumentado el interés en el mayor punto de atención moleculares pruebas diagnósticas, como isotérmico de reversa de la transcripción mediada por el lazo amplificación (RT-LAMP)1,2 y recombinase polimerasa amplificación (RPA)3,4. RT-LAMP y RPA son rápidas, sensibles y específicas pruebas moleculares que pueden realizarse sobre los preparativos de la muestra simplificada. Para el virus Zika, RT-LAMP se ha combinado con un análisis de flujo lateral (LFA), que puede detectar el virus Zika en muestras de sangre no purificados dentro de 30 min1; sin embargo, para EBOV, que está clasificado como un patógeno del grupo 4 de riesgo y es altamente contagiosa, las muestras necesitan manejarse bajo bioseguridad nivel 4 (BSL-4) condiciones e inactivado antes de cualquier procedimiento diagnóstico seguro se puede realizar.

Se utilizaron métodos de inactivación simplificada de EBOV, tales como la adición de buffer de lisis a la muestra de2,3,4,5, durante el brote; sin embargo, estos métodos requieren un manejo bajo condiciones BSL-4 con equipo de laboratorio, tales como gabinetes de bioseguridad BSL-3, centrifugadoras, bloques de calentamiento y pipetas, en un mínimo. Este equipo normalmente no está presente en salas de aislamiento o en hospitales. Para superar este reto, se ha intentado realizar diagnósticos en maletas3, y varios dispositivos portátiles y las máquinas han sido desarrolladas [por ejemplo, un dispositivo portátil para la extracción de ácidos nucleicos (NA)]6. Sin embargo, las muestras positivas de EBOV aún necesitan ser inactivado antes de que estos dispositivos se pueden utilizar.

Hemos divulgado previamente un método de inactivación de virus rápido de cabecera de EBOV7, virus de la Vaccinia y vacuna virus8 por adición de un tampón de lisis/enlace comercial para tubos para colección de sangre vacío ordinario, lo que permite la directa transferencia de sangre del paciente en la inactivación buffer7. Esta inactivación directa e inmediata en un sistema cerrado elimina la necesidad para el manejo de las muestras utilizando cualquier contención rigurosa, como BSL-4 condiciones7, y las muestras pueden ser manejadas bajo condiciones normales de BSL-2. Este método de inactivación es compatible con varios sistemas de extracción de NA, como robots y kits de purificación7de mano; sin embargo, estos métodos requieren equipos de laboratorio, tales como robots, centrifugadoras y la electricidad, que no siempre están presentes sobre el terreno o dentro de pabellones de aislamiento hospitalarios.

En este informe, describimos un seguro, rápido y simplificado NA extracción método manual para la posterior detección molecular de virus en sangre entera inactivado con buffer de lisis/obligatorio. El método de extracción de NA no requiere cualquier dispositivo distinto de un imán magnético soporte. No centrifugadoras, bloques, o la electricidad de la calefacción son necesarios para la extracción de NA. Por lo tanto, este método no es dependiente de laboratorios y fácilmente puede ser utilizado en cualquier lugar (por ejemplo, en hospitales, en las salas de aislamiento del hospital, o con escasos recursos). El método de extracción de NA es rápida y sencilla y puede ser utilizado directamente en pruebas NA aguas abajo, como qPCR, RT-qPCR, lámpara, lámpara de RT. Cuando se combina este método de extracción de NA con lámpara y un instrumento isotermo portátil impulsado por batería, puede obtenerse un diagnóstico cabecera dentro de 40 min de la colección de sangre.

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Protocolo

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La Comisión de ética de investigación biomédica, región de la Capital ha dado consentimiento informado, y todos los métodos aquí descritos han sido exentos de revisión por el sistema de Comité de ética, conforme a la ley danesa sobre proyectos de desarrollo de ensayo.

1. preparación de tubos de vacío sangre colección para inactivación de Virus y NA rápida extracción

PRECAUCIÓN: El búfer utilizado para este protocolo contiene tiocianato de guanidinio (GITC) y un surfactante no iónico, que son irritantes. Tomar medidas de seguridad de laboratorio adecuadas, utilizar una campana de flujo y guantes al manipularlo. Evitar cualquier piel y contacto con los ojos. Si el búfer se derrama, la superficie contaminada no se debe nunca desinfectar directamente con cloramina o hipoclorito de sodio (los ingredientes activos en "bleach") ya que esta mezcla puede conducir a la formación de cianuro tóxicos. En primer lugar, limpiar el búfer derramado con papel absorbente. A continuación, limpie la superficie con etanol al 70% y luego con agua y por último, usar cloramina o hipoclorito de sodio.

  1. Para preparar los tubos de vacío de colección de sangre, inyectar 1,6 mL de la solución de lisis comercial específico en un tubo de vacío con EDTA 4 mL pinchando la tapa del tubo con una aguja de 25 x 1 y una jeringa de 3 mL.
    Nota: No retire la tapa del tubo de vacío. El vacío debe mantenerse.
  2. Almacenar los tubos de vacío que contiene el buffer a temperatura ambiente hasta su uso.
    Nota: Los tubos son estables durante al menos 1 año después de su preparación.

2. preparación de tampones de extracción de NA

  1. Para preparar los amortiguadores para una extracción de NA, coloque dos 1.8 mL, dos 4,5 mL y una 3.6 mL tubos en un rack.
  2. Añadir, mediante pipeteo, 960 μl de cristal magnético partículas (MGP) a un tubo de 1.8 mL limpia y etiqueta con MGPs. Resuspender la suspensión pop totalmente antes de pipetearlo.
    Nota: Los pop tienden a recoger rápidamente en la parte inferior del tubo.
  3. Añadir, mediante pipeteo, 4 mL de tampón de lavado I a un tubo de 4,5 mL limpia y etiqueta como WB-1.
    PRECAUCIÓN: El tampón de lavado I contiene cloruro de guanidinio, que es irritante. Tomar medidas de seguridad de laboratorio adecuadas, utilizar una campana de flujo y guantes al manipularlo. Evitar cualquier piel y contacto con los ojos.
  4. Añadir, mediante pipeteo, 1,5 mL de tampón de lavado II a un tubo limpio 3.6 mL y etiquetar como WB-2.
  5. Añadir, mediante pipeteo, 3 mL de buffer de lavado III a un tubo de 4,5 mL limpia y etiqueta como WB-3.
  6. Añadir, mediante pipeteo, 100 μl de tampón de elución a un tubo de 1.8 mL limpia y etiqueta como EB.
  7. Almacenar los buffers alícuotas a temperatura ambiente hasta su uso.
    Nota: Los tubos son estables durante al menos 1 mes después de su preparación.

3. colección de sangre de pacientes con signos y síntomas de una infección de Virus

PRECAUCIÓN: Tomar medidas de seguridad de laboratorio adecuadas al recoger sangre de la paciente. Use guantes y gafas. Si el paciente está en aislamiento, por favor siga los procedimientos de nivel 4 de bioseguridad.

  1. Para recolectar sangre intravenosa al paciente, utilizar una aguja mariposa con tubo de extensión de pequeño calibre y un tubo de vacío de colección de sangre que contiene un tampón de lisis/obligatorio. Descansar el brazo del paciente en una posición hacia abajo y coloque el tubo de colección más bajo que la aguja de la mariposa. Inserte la aguja de la mariposa en la vena del paciente y sujete el tubo de vacío sangre colección la extensión de pequeño calibre.
    Nota: Esto evitará el reflujo.
  2. Después de la recolección de la sangre, mezclar el contenido del tubo poniendo el tubo de 5 - 10 veces.
    Nota: Debido al vacío restante en el tubo de colección de sangre 1,6 ml de tampón de lisis/enlace, el volumen de la muestra recogida automáticamente será de 1,6 mL.
  3. Desinfectar el exterior del tubo con etanol al 70%.
  4. Incubar los tubos durante 20 min a temperatura ambiente.
    Nota: Puede detener aquí el protocolo y los tubos de colección de sangre completa pueden ser almacenados a-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C o 37 ° C durante al menos 1 mes7.
  5. Seguir directamente el método simplificado de extracción de NA.

4. simplificado NA extracción de la sangre

  1. Para purificar el NA de la lisis/enlace inactivado con buffer recoge sangre, mezcla el contenido del tubo por el vacío de los bancos de tubo a mano 5-10 x.
  2. Retire con cuidado la tapa del tubo y la tapa de descarga.
  3. Vierta el preparado alícuota de MGP (1 mL) directamente en el tubo de colección de sangre.
  4. Colocar una nueva tapa de un tubo de colección de sangre no utilizadas en el tubo que contiene la muestra.
  5. Coloque un dedo sobre la tapa para asegurar que el tubo está firmemente cerrado y mezclar el contenido del tubo por el tubo de la colección de sangre los bancos a mano 5 - 10 veces.
  6. Coloque el tubo en el soporte magnético y mantenga un dedo sobre la tapa para que el tubo es cerrado herméticamente.
  7. Dar la vuelta el soporte magnético con el tubo un par de veces en mano para asegurarse de que todos los pop se recogen en el lado del tubo con el imán.
    Nota: El soporte magnético puede reemplazarse por un imán alargado y una banda de caucho.
  8. Retire la tapa del tubo y deseche el contenido del tubo utilizando una pipeta desechable o simplemente vertiendo el contenido en un tubo de recogida de 50 mL.
    Nota: Evite aerosoles desde el tubo de la colección de 50 mL por el tubo con una tapa de cierre.
  9. Vierta el preparado alícuota de WB-1 (4 mL) directamente en el tubo de colección de sangre.
  10. Coloque la tapa en el tubo y coloque un dedo sobre la tapa para que el tubo es cerrado herméticamente.
  11. Retire el tubo del soporte magnético, mantener la tapa bien apretada con un dedo.
    Nota: Si usa un imán y una banda de caucho, simplemente retire la goma y el imán del tubo.
  12. Resuspender el pop por el tubo de la colección de sangre los bancos a mano 5 - 10 veces.
  13. Repita los pasos 4.6-4.8.
  14. Vierta el preparado alícuota de WB-2 (1.5 mL) directamente en el tubo de colección de sangre.
  15. Coloque la tapa en el tubo y retire el tubo del soporte magnético.
    Nota: Si usa un imán y una banda de caucho, simplemente retire la goma y el imán del tubo.
  16. Coloque un dedo sobre la tapa para que el tubo es cerrado herméticamente.
  17. Resuspender los pop poniendo el tubo de la colección de sangre durante unos segundos a mano.
  18. Repita el paso 4.6-4.8.
  19. Vierta el preparado alícuota de WB-3 (3 mL) directamente en el tubo de colección de sangre.
  20. Coloque la tapa en el tubo y retire el tubo del soporte magnético.
    Nota: Si usa un imán y una banda de caucho, simplemente retire la goma y el imán del tubo.
  21. Coloque un dedo sobre la tapa para que el tubo es cerrado herméticamente.
  22. Resuspender el pop por el tubo de la colección de sangre los bancos a mano 5 - 10 veces.
  23. Repita los pasos 4.6-4.8.
  24. Vierta el preparado alícuota de EB (100 μL) directamente en el tubo de colección de sangre.
  25. Coloque la tapa en el tubo y retire el tubo del soporte magnético.
    Nota: Si usa un imán y una banda de caucho, simplemente retire la goma y el imán del tubo.
  26. Resuspender el POPS en el EB golpeando suavemente el tubo de la colección de sangre 5 - 10 veces con un dedo.
    Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí y los tubos pueden ser almacenados a-20 ° C.
  27. Transferencia una gotita (5-8 μL) de la MGP resuspendido a la mezcla de reacción de amplificación de NA aguas abajo con una pipeta desechable 1,5 mL (cualquier amplificación de NA diagnóstico aguas abajo ensayo como pueden utilizar RT-lámpara o ensayos de qPCR/RT-qPCR).
    Nota: El NAs se adhieren a los pop, así que asegúrese de usar el POPS en la posterior reacción de amplificación de NA. Mezclar la suspensión de pop antes de su uso. Después de mezclar, la MGP se acumulará en la parte inferior del tubo.

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Resultados

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El protocolo presentado aquí es simple y eficiente y puede aplicarse ampliamente a cualquier análisis molecular para ser realizadas en muestras de sangre infecciosa inactivadas con el tampón de lisis/obligatorio. El flujo de trabajo para la inactivación de la sangre y la extracción de NA se muestra en la figura 1, incluida la preparación de sangre colección tubos de vacío7 (figura 1A), la colección de sang...

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Discusión

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En este informe, describimos un seguro, rápido y simple cabecera NA extracción método manual para la detección molecular aguas abajo de un virus en sangre entera inactivado con buffer de lisis/enlace. El método de extracción descrito NA fue desarrollado para llevar a cabo directamente en muestras de sangre recogidas en vacío sangre colección tubos la lisis/enlace buffer (Tabla de materiales)7. Este búfer específico inactiva EBOV7 y es el componente crítico ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos a Susanne Lopes Rasmussen y Solvej Kolbjørn Jensen por su asistencia técnica y para el manejo de las muestras clínicas. Este proyecto forma parte del consorcio EbolaMoDRAD, que ha recibido financiación de la empresa de común innovadora medicina iniciativa 2 bajo subvención Convenio N ° 115843. Esta empresa común recibe el apoyo del investigación de horizonte 2020 de la Unión Europea y el programa de innovación y la EFPIA.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos Vacutainer K2 EDTA (4 mL)Becton Dickinson368861
Plus AgujaBecton Dickinson362725
23G x 1 JeringaBecton Dickinson300800
LUER LOK (3 mL)Becton Dickinson309658
Aguja de mariposa con tubo de extensión de pequeño diámetro Jø rgen Kruuse A/S121714
1% VirkonNomeco A/S849265
MagNA Pure LC Kit de aislamiento de ADN I - Tampón de lisis/unión - RecambioRoche Diagnostics A/S03246752001
MagNA Pure LC Kit de aislamiento de ácidos nucleicos totalesRoche Diagnostics A/S3038505001
Nunc™ Tubos criogénicos para biobancos y cultivos celulares (1,8 mL)Thermo Fisher Scientific375418
Nunc™ Tubos criogénicos de biobancos y cultivos celulares (3,6 mL)Thermo Fisher Scientific379189
Nunc™ Tubos criogénicos para biobancos y cultivos celulares (4,5 mL)Thermo Fisher Scientific379146
DynaMag™-5 MagnetThermo Fisher Scientific12303D
Pipeta de transferencia (3,5 mL)Sarstedt86.1171.010
Thermo Scientific™ Samco&comercio; Pipetas de transferencia de punta fina (1,5 mL)Thermo Fisher Scientific231
Thermo Scientific™ Nunc&comercio; Tubos de centrífuga de polipropileno estéril cónicos de 50 mLThermo Fisher Scientific339652
Recolección de sangre

Referencias

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