Aquí, presentamos un protocolo para la extracción de ácidos nucleicos de virus rápido de la sangre virus inactivado. La extracción se realiza directamente en los tubos para recogida de sangre y no requiere equipo ni electricidad. El método no es dependiente de laboratorios y puede ser utilizado en cualquier lugar (por ejemplo, en hospitales).
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Artículo de método
Extracción rápido, seguro y sencillo Manual cabecera de ácido nucleico para la detección del Virus en muestras de sangre entera
En este artículo
Resumen
Resumen
El diagnóstico rápido de infección es esencial para el manejo de brote, contención del riesgo y atención al paciente. Previamente hemos demostrado un método para la rápida inactivación cabecera del virus Ebola durante la muestra de sangre para las pruebas de ácido nucleico seguro (NA) mediante la adición de un tampón de lisis/enlace comercial directamente en los tubos de colección de sangre vacío. Usando este método de inactivación de cabecera, hemos desarrollado un seguro, rápido y simplificado cabecera NA método de extracción para la posterior detección de virus en sangre entera inactivado con buffer de lisis/enlace. La extracción de NA se realiza directamente en los tubos para recogida de sangre y no requiere equipo ni electricidad.
Después se recoge la sangre en el buffer de lisis/vinculante, el contenido se mezcla poniendo el tubo con la mano, y la mezcla se incuba durante 20 min a temperatura ambiente. Partículas de vidrio magnético (MGP) se agregan al tubo, y los contenidos son mezclados por el tubo de recogida de los bancos a mano. Los pop son recogidos luego en el lado del tubo de la colección de sangre utilizando un soporte magnético o un imán y una banda de caucho. El pop se lavan tres veces, y después de la adición de tampón de elución directamente en el tubo de colección, NAs están listos para pruebas de NA, como qPCR o amplificación isotérmica lazo (lámpara), sin el retiro de los pop de la reacción. El método de extracción de NA no es dependiente en las instalaciones de laboratorio y puede fácilmente ser utilizado en cualquier lugar (por ejemplo, en hospitales y salas de aislamiento del hospital). Cuando se combina este método de extracción de NA con lámpara y un instrumento portátil, puede obtenerse un diagnóstico dentro de 40 min de la colección de sangre.
Introducción
En situaciones de brote de virus, cuando los pacientes están confinados a las salas de aislamiento del hospital o cuando se necesita un rápido diagnóstico, una diagnosis molecular del punto de atención de segura, sencilla y precisa es imprescindible para la contención del cuidado y el riesgo del paciente. Dos brotes recientes virales del virus de Ebola (EBOV) en África del oeste (2013) y el virus Zika en América del Sur (2015), han aumentado el interés en el mayor punto de atención moleculares pruebas diagnósticas, como isotérmico de reversa de la transcripción mediada por el lazo amplificación (RT-LAMP)1,2 y ....
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Protocolo
La Comisión de ética de investigación biomédica, región de la Capital ha dado consentimiento informado, y todos los métodos aquí descritos han sido exentos de revisión por el sistema de Comité de ética, conforme a la ley danesa sobre proyectos de desarrollo de ensayo.
1. preparación de tubos de vacío sangre colección para inactivación de Virus y NA rápida extracción
PRECAUCIÓN: El búfer utilizado para este protocolo contiene tiocianato de guanidinio (GITC) y un surfactante no iónico, que son irritantes. Tomar medidas de seguridad de laboratorio adecuadas, utilizar una campana de flujo y guantes al manipularlo. Evit....
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Resultados
El protocolo presentado aquí es simple y eficiente y puede aplicarse ampliamente a cualquier análisis molecular para ser realizadas en muestras de sangre infecciosa inactivadas con el tampón de lisis/obligatorio. El flujo de trabajo para la inactivación de la sangre y la extracción de NA se muestra en la figura 1, incluida la preparación de sangre colección tubos de vacío7 (figura 1A), la colección de sang.......
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Discusión
En este informe, describimos un seguro, rápido y simple cabecera NA extracción método manual para la detección molecular aguas abajo de un virus en sangre entera inactivado con buffer de lisis/enlace. El método de extracción descrito NA fue desarrollado para llevar a cabo directamente en muestras de sangre recogidas en vacío sangre colección tubos la lisis/enlace buffer (Tabla de materiales)7. Este búfer específico inactiva EBOV7 y es el componente crítico .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Susanne Lopes Rasmussen y Solvej Kolbjørn Jensen por su asistencia técnica y para el manejo de las muestras clínicas. Este proyecto forma parte del consorcio EbolaMoDRAD, que ha recibido financiación de la empresa de común innovadora medicina iniciativa 2 bajo subvención Convenio N ° 115843. Esta empresa común recibe el apoyo del investigación de horizonte 2020 de la Unión Europea y el programa de innovación y la EFPIA.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos Vacutainer K2 EDTA (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Aguja | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 Jeringa | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Aguja de mariposa con tubo de extensión de pequeño diámetro J | ø rgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC Kit de aislamiento de ADN I - Tampón de lisis/unión - Recambio | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Kit de aislamiento de ácidos nucleicos totales | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Tubos criogénicos para biobancos y cultivos celulares (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Tubos criogénicos de biobancos y cultivos celulares (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Tubos criogénicos para biobancos y cultivos celulares (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Pipeta de transferencia (3,5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco&comercio; Pipetas de transferencia de punta fina (1,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc&comercio; Tubos de centrífuga de polipropileno estéril cónicos de 50 mL | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
Referencias
- Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).
- Benzine, J. W., Brown, K. M., et al.
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Reimpresiones y permisos
