Artículo de método

Extracción de ADN de alto rendimiento y genotipificación de 3dpf larvas de pez cebra por recorte de aleta

DOI:

10.3791/58024

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29 de junio de 2018

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1Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute, 2Department of Biology, University of Ottawa

En este artículo

Resumen

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Pez cebra se han utilizado como organismos modelo genética fiable en la investigación biomédica, especialmente con el advenimiento de las tecnologías de edición de gene. Cuando se esperan fenotipos larvales, identificación de extracción y genotipo de ADN puede ser difícil. Aquí, describimos un procedimiento eficiente de genotipado para larvas de pez cebra, por cola de recorte, tan pronto como 72 h post fertilización.

Resumen

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Pez cebra (Danio rerio) poseen orthologues 84% de los genes conocidos por estar asociados con enfermedades humanas. Además, estos animales tienen un tiempo de generación corto, son fáciles de manejar, mostrar una alta tasa reproductiva, bajo costo y son fácilmente susceptibles de manipulaciones genéticas por microinyección de ADN en embriones. Los avances recientes en gene de herramientas de edición permiten precisa introducción de mutaciones y los transgenes en el pez cebra. Modelado en el pez cebra a menudo la enfermedad conduce a fenotipos larvas y muerte temprana que puede ser difícil de interpretar si genotipos son desconocidos. Esta temprana identificación de genotipos es también necesaria en los experimentos que requieren muestra puesta en común, como en estudios de gene expresión o masa espectrometría. Sin embargo, amplia selección genotípica está limitada por los métodos tradicionales, que en la mayoría de los laboratorios se realizan sólo en pez cebra adulto o larvas post mortem. Abordamos este problema mediante la adaptación de un método para el aislamiento de ADN genómico de PCR-listo de larvas de pez cebra vivo que se puede lograr tan pronto como fertilización después de 72 h (hpf). Esta vez y técnica rentable, mejoró a partir de un protocolo de genotipificación publicados anteriormente, permite la identificación de genotipos procedentes de biopsias de fin microscópica. Las aletas se regeneran rápidamente como desarrollan de las larvas. Los investigadores entonces son capaces de seleccionar y criar los genotipos deseados a la edad adulta mediante la utilización de este procedimiento de genotipificación basada en PCR de alto rendimiento.

Introducción

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El pez cebra (rerio del Danio) es un organismo vertebrado, ampliamente utilizado como modelo para la investigación de la enfermedad así como para ensayos preclínicos de hipótesis terapéuticas1,2,3. Estos animales tienen un tiempo de generación corto, son fáciles de manejar, mostrar una alta tasa reproductiva, bajo costo y son fácilmente susceptibles de manipulaciones genéticas por microinyección de ADN en embriones4. A través del desarrollo creciente de novela transgénico y genes edición tecnologías como Zinc-Finger nucleasas (ZFN)5, TAL como efectoras nucleasas (TALENs)6,7y el cluster regularmente otro corto Palindrómico repite (CRISPR) / CRISPR asociados 9 (Cas9) sistema8, el pez cebra va a mejorar sustancialmente la comprensión de varias condiciones patológicas. Estas tecnologías se han utilizado para crear knockouts dirigidas tanto somáticas y células germinales en el pez cebra, eficientemente engendrar genéticamente modificación animales8. Ejemplos recientes en la literatura incluyen el desarrollo de modelos genéticos de la epilepsia y trastornos metabólicos en el pez cebra3,9,10,11,12 .

Con los progresos realizados en la edición del genoma del pez cebra, genotipificación rápida y confiable se ha convertido en un indiscutible paso de limitación de velocidad. Identificación de mutaciones de ADN específicas junto al sitio de destino prevista-edición genómica es una etapa esencial del protocolo. Técnicas de genotipado por recorte de aleta son tradicionalmente, generalmente sólo en juveniles o adultos pez cebra. Sin embargo, el tiempo invertido en pez cebra aumento a la edad adulta (> 2 meses) retrasa considerablemente los avances en la investigación. En muchos casos, la edad adulta no puede lograrse por el knockout de genes esenciales (por ejemplo, en el modelado de la enfermedad) o ganar-de-función mutaciones conducen a efectos fenotípicos perjudiciales. Además, diversos estudios requieren la puesta en común de las larvas, tales como extracción de ARN o metabolito y así involucran previa identificación de los genotipos, que puede ser difícil cuando se dispone de técnicas de genotipado único post hoc . Estos ejemplos mencionados destacan la importancia de las técnicas de Genotipado de larvas que son al mismo tiempo precisa y permitir la recuperación completa y el desarrollo normal de las larvas. Genotipificación de pez cebra de etapa temprana actualmente parece no ser utilizado; Esto se refleja en publicaciones recientes de modelos de la enfermedad en la que genotipos larvarios se identifican mediante Genotipado de post-mortem en lugar de genotipado antes de la ejecución del experimento12,13,14. En este trabajo, se presenta una estrategia de clip de larvas de aleta con el objetivo de mejorar los procedimientos de genotipado previamente establecidas.

En el pasado, estrategias que emplea digestión proteinasa K a genotipo viven pez cebra larvas han llevado a polimerasa variable de eficiencia de la reacción en cadena (PCR)15. Aunque más recientemente publicaron la técnica de biopsia de cola microscópica proporcionada resultados más prometedores16, nosotros y otros grupos no fueron capaces de reproducir la alta eficiencia y recuperación de ADN, reportado por los autores. Un retroceso importante del protocolo descrito por Wilkinson et al. 16 podría ser la transferencia del tejido de la cola en el tubo PCR. Debido a su tamaño microscópico, es difícil para que la aleta fue debidamente recopilada y dispensada por pipeteo. Para hacer frente a esta barrera, hemos desarrollado un protocolo mejorado para un gran número de Genotipado de larvas de pez cebra vivo con casi 100% de eficiencia9. Con un microscalpel, la punta de la cola de la aleta se retira y coloca en un pedazo de papel de filtro. El pedazo de papel de filtro que contiene el tejido puede ser fácilmente visualizado y correctamente colocado en un tubo PCR. Se realiza la extracción de ADN genómica, seguido de la amplificación por PCR de la región de interés a genotipo la muestra. Las ventajas de este método incluyen una alta eficiencia PCR, un bajo índice de falsos positivos y una tasa de mortalidad baja. Además, Genotipado de un gran número de embriones es posible usando este protocolo. El protocolo descrito en el presente documento permite aleta-recorte de cientos de larvas dentro de 2-3 h con este enfoque y la correcta identificación de peces genotipo y regeneración de la cola dentro de dos días.

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Protocolo

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Procedimientos relacionados con temas de animales han sido aprobados y están de acuerdo con las pautas de cuidado de los animales proporcionan por el Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal y la Universidad de Ottawa comités de cuidado de los animales.

1. preparación

  1. Preparación de la superficie de disección con cinta adhesiva una tapa de caja Petri de 9 cm con cinta de autoclave en toda su superficie interior. Colocarlo bajo un microscopio estéreo.
  2. Lugar de fertilización después de 3-5 días (PD) larvas de pez cebra en una Petri dish y anestesiar en ˜1.5 mM Metanosulfonato de 1 medio de x E3 de embriones (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM de MgSO4, pH 7,2).
  3. Corte el extremo de una punta de pipeta P1000 con un par de tijeras o una cuchilla de afeitar a un diámetro de 2 mm para dar cabida a una larva 3 de PD con el mínimo esfuerzo.

2. aleta recorte de larvas de pez cebra

  1. Recoger una larva anestesia con la micropipeta P1000 modificada y colocar la larva del pez cebra en la cinta de autoclave situado sobre la tapa de la caja de Petri.
  2. Eliminar el exceso de solución de Metanosulfonato que rodea la larva mediante una micropipeta. El área debe ser tan seco como sea posible con éxito la sección y recoger la aleta pero todavía húmedo para garantizar la supervivencia.
  3. Con un bisturí micro, sección de la aleta caudal con un microscopio estéreo como se indica en la figura 1, como se describe en Wilkinson et al16. Durante la incisión, aplique una presión constante hacia abajo dentro del sitio de la brecha de pigmento de la aleta caudal, distal al límite de la circulación de la sangre (figura 1A). Aplique presión suave para evitar dañar el notocordio.
  4. Visualizar la aleta seccionada bajo el microscopio y coloque la pieza sobre la punta de la hoja de microscalpel (figura 2A). Coloque el microscalpel que contiene la aleta sobre la superficie de un pedazo pequeño de papel de filtro.
    Nota: Debido a la presencia de melanocitos en el tejido seccionado, este paso permite la visualización de la aleta como un pequeño punto negro (figura 2B).
  5. Usando tijeras y pinzas (figura 2) transfiera el papel de filtro que contiene la aleta a una placa PCR de 96 pocillos, conteniendo 25 μL de solución de NaOH de 50 mM por pozo (Figura 2D).
  6. Preparar una placa de 96 pocillos de fondo plano, numeración del pozo según la etiqueta de la placa de la polimerización en cadena. Con la modificada pipeta P1000 con 200 μL de fresco 1 x E3 embrión los medios de comunicación, recoger cuidadosamente la larva de pez cebra con una presión suave. Dispensar la larva en la placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos, en el mismo número así como la placa PCR (Figura 2E).
  7. Asegúrese de que el papel de filtro es bien sumergido en la solución (figura 2F). Limpiar la cuchilla de los microscapel y pinzas entre cada corte para evitar la contaminación cruzada por inmersión en solución EtOH al 70%. Limpie la cuchilla con tejido/toallita de papel limpia.
  8. Repita los pasos 2.1-2.7 hasta que todos los embriones han sido recortados.
  9. Guardar las larvas en la placa de 96 pozos a 28 ° C hasta que los genotipos han sido identificados.
    Nota: Los medios de comunicación de embrión no necesitan ser cambiado, puesto que el protocolo se puede realizar fácilmente en menos de 2 días. Si se necesita más tiempo, se recomienda un cambio de los medios de comunicación.

3. extracción de ADN genómica

  1. Sellar la placa de PCR de 96 pocillos y centrifugar las muestras a 1.000 x g durante 1 min para asegurarse de que todos los papeles de filtro están sumergidas en la solución de NaOH.
  2. Para la lisis del tejido, calentar las muestras en un termociclador a 95 ° C por 5 min seguido de un enfriamiento a 4 ° C durante 10 minutos.
  3. Añadir 6 μL de 500 mM Tris-HCl, pH 8,0 para cada muestra. Vortex.
  4. Centrifugar brevemente la placa a 1.500 xg por 5 min a temperatura ambiente.
  5. Utilizar 1,5 μL del sobrenadante de DNA por la reacción de PCR.
  6. Preparar una PCR genotipo las larvas, como se muestra en la tabla 1-2.
    Nota: Este protocolo fue probado para dos aplicaciones: multiplexar reacciones de PCR, revela el genotipo utilizando geles de agarosa9y heteroduplex fusión ensayo (HMA) revelando los genotipos usando poliacrilamida gel electroforesis (PAGE)17.

4. alternativa extracción Genomic usando una resina quelante

  1. Paso completa 2.5 añadiendo filtro de papel con la aleta recortada a una placa PCR de 96 pocillos, con 30 μL de 5% quelantes de resina (copolímero de estireno-divinilbenceno que contienen iminodiacetate pares de iones).
    Nota: Este tipo de resina se utiliza comúnmente para la lisis de tejido y la preparación de ADN PCR-listo en una manera rápida y eficiente18.
  2. Siga los pasos 2.6-2.8 como se indica.
  3. Sellar la placa PCR de 96 pocillos y centrifugar brevemente las muestras para asegurarse de que todo el papel filtro se sumerge dentro de la resina quelante.
  4. Para la lisis del tejido, calentar las muestras en un termociclador a 95 ° C durante 15 min, seguido de un enfriamiento a 4 ° C durante 10 minutos.
    Nota: Este paso permite lisis y posterior unión de los granos de resina polar a componentes celulares mientras que el ADN y el ARN permanecen en solución.
  5. Centrifugar brevemente las muestras para los granos de la resina de la pelotilla y obtener el ADN de la suspensión.
  6. Siga los pasos 3.5-3.6 trámite de genotipificación.

5. aplicación 1: Multiplex PCR seguida por análisis del Gel de agarosa

  1. Siguiente tabla 1, establecer una reacción de PCR multiplex para permitir la discriminación entre mutantes homocigotos, heterocigotos y larvas WT. Utiliza a un termociclador 96 pocillos para llevar a cabo las reacciones de PCR utilizando el ciclismo condiciones descritas en la tabla 3.
    Nota: Las reacciones de PCR se pueden realizar también en cualquier otro convencional PCR termociclador. Este ejemplo describe la estrategia PCR utilizada por Peña, et al. 9 identificar aldh7a1 WT y alelos mutantes de inserción 5-puntos de ebullición en la misma reacción multiplex.
  2. Preparar un gel de agarosa al 1% en tampón borato de sodio, con 1 x GelRed.
    Nota: 20 x stock de buffer de borato de sodio se hace de 40 mL de 10 M NaOH, 1800 mL de ddH2O, pH ajustado a 8.5 con 76 g de ácido bórico y luego completar a volumen final de 2 L con ddH2O.
  3. Correr el gel en solución tampón de borato de sodio 1 x min 15 a 250 V. Para facilitar el proceso, si es posible, utilice un sistema de gel que es compatible con pipetas multicanales para permitir mayor capacidad de rendimiento al reducir el tiempo para cargar las muestras.
  4. El gel bajo luz ultravioleta (UV) para permitir la discriminación de los diferentes genotipos de la imagen.

6. aplicación 2: Heteroduplex ensayo de fusión

  1. Preparar página 12% geles con la placa del separador de 1,5 mm y los peines de 15 muestras. Preparar dos geles de la página 12,21 ml de ddH2O, 2,52 mL de 10 x 10 mL de acrilamida 30%, borato/Tris/EDTA (TBE), 250 μL de persulfato de amonio 10% (APS) y 20 μL de tetramethylethylenediamine (TEMED). Utilizar 1 buffer x TBE (0.089 M Tris-HCl, 0,089 M el ácido bórico y 0.002 M ácido etilendiaminotetracético (EDTA)) como almacenador intermediario de funcionamiento.
  2. Calentar los productos PCR a 94 ° C durante 5 minutos.
  3. Enfríe los tubos en hielo o en el termociclador durante 10 min a 4 ° C.
  4. Cargar 10 μL por muestra PCR y 8 μL de marcador de peso molecular.
  5. Ejecutar la página de 150 V en 1 x TBE utilizando un sistema de electroforesis vertical durante 1 hora o hasta que el marcador de peso molecular casi alcanza la línea de pie de la placa de vidrio.
  6. El gel bajo luz UV para permitir la discriminación de los diferentes genotipos de la imagen.

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Resultados

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La eficiencia de la protocolo fue demostrada por genotipificación la descendencia de un cruce heterocigoto (aldh7a1+ ot100, aquí se muestra como aldh7a1+-) ()Figura 3A- C)9. El alelo mutante aldh7a1ot100tiene una inserción de par 5-bajo (bp) en el primer exón de codificación del gene aldh7a1 del pez cebra que conduce a mutágeno ' fram...

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Discusión

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Gen se han empleado herramientas de edición precisamente introducir mutaciones y los transgenes en el pez cebra en los últimos años5,6,7,8. Cuando se realiza la enfermedad en pez cebra, primeros fenotipos larvales o juveniles a menudo se observan9,12,13,14. El protoco...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

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Los autores desean agradecer a los modelos raros de la enfermedad y mecanismo (RDMM) red (financiada por los institutos canadienses de investigación de salud (CIHR) y genoma Canadá). CK es apoyada por una beca de la UROP (Universidad de Ottawa). DLJ es apoyado por una beca postgrado Vanier Canadá. IAP es apoyado por un premio de beca postdoctoral de institutos canadienses de investigación de salud (CIHR). Los autores agradecen la Genetics Society of America para la concesión de permiso para publicar este protocolo y utilizar una adaptación de la figura 5 suplementarios de Pena, et al.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
PlacaPetri Microbisturí430167
Corning World Precision Instruments 500249
Microscopio estereoscópicoNikonSMZ1500
Tricaína/3-aminobenzoato de etilo metanosulfonatoSigma-AldrichE10521
Placa de cultivo de tejidos de 96 pocillosCostar3595
PCR de 96 pocillos placaFisher14230232
NaOHFisherS25548A 
Tris base Sigma-AldrichT1503
NaClFisherBP358-10
KClSigma-AldrichP3911
MgSO4Sigma-Aldrich230391
5% Chelex 100 forma de sodioSigma-AldrichC7901
GelRed 1xBiotium41003
Ácido BóricoSigma-AldrichB6768
Sistema Sub-Cell Modelo 192Bio-Rad 
Solución de acrilamida/Bis al 30 %, 37,5: 1Bio-Rad 
GoTaq Green Master Mix, 2XPromegaM7123
(Kimwipes® toallitas desechables)Sigma-AldrichZ188956
marcador de peso de más de 1kb-molecylar Thermo ScientificSM1343
Agua libre de nucleasasa Sistema Sigma-AldrichW4502
Sub-Cell Modelo 192 (sistema de gel de agarosa de alto rendimiento)Bio-Rad 
sistema de electroforesis vertical en gel Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 
de 17045081610158 Toallitas de papel 17045081658004

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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