Pez cebra se han utilizado como organismos modelo genética fiable en la investigación biomédica, especialmente con el advenimiento de las tecnologías de edición de gene. Cuando se esperan fenotipos larvales, identificación de extracción y genotipo de ADN puede ser difícil. Aquí, describimos un procedimiento eficiente de genotipado para larvas de pez cebra, por cola de recorte, tan pronto como 72 h post fertilización.
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Artículo de método
Extracción de ADN de alto rendimiento y genotipificación de 3dpf larvas de pez cebra por recorte de aleta
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Resumen
Resumen
Pez cebra (Danio rerio) poseen orthologues 84% de los genes conocidos por estar asociados con enfermedades humanas. Además, estos animales tienen un tiempo de generación corto, son fáciles de manejar, mostrar una alta tasa reproductiva, bajo costo y son fácilmente susceptibles de manipulaciones genéticas por microinyección de ADN en embriones. Los avances recientes en gene de herramientas de edición permiten precisa introducción de mutaciones y los transgenes en el pez cebra. Modelado en el pez cebra a menudo la enfermedad conduce a fenotipos larvas y muerte temprana que puede ser difícil de interpretar si genotipos son desconocidos. Esta temprana identificación de genotipos es también necesaria en los experimentos que requieren muestra puesta en común, como en estudios de gene expresión o masa espectrometría. Sin embargo, amplia selección genotípica está limitada por los métodos tradicionales, que en la mayoría de los laboratorios se realizan sólo en pez cebra adulto o larvas post mortem. Abordamos este problema mediante la adaptación de un método para el aislamiento de ADN genómico de PCR-listo de larvas de pez cebra vivo que se puede lograr tan pronto como fertilización después de 72 h (hpf). Esta vez y técnica rentable, mejoró a partir de un protocolo de genotipificación publicados anteriormente, permite la identificación de genotipos procedentes de biopsias de fin microscópica. Las aletas se regeneran rápidamente como desarrollan de las larvas. Los investigadores entonces son capaces de seleccionar y criar los genotipos deseados a la edad adulta mediante la utilización de este procedimiento de genotipificación basada en PCR de alto rendimiento.
Introducción
El pez cebra (rerio del Danio) es un organismo vertebrado, ampliamente utilizado como modelo para la investigación de la enfermedad así como para ensayos preclínicos de hipótesis terapéuticas1,2,3. Estos animales tienen un tiempo de generación corto, son fáciles de manejar, mostrar una alta tasa reproductiva, bajo costo y son fácilmente susceptibles de manipulaciones genéticas por microinyección de ADN en embriones4. A través del desarrollo creciente de novela transgénico y genes edición tecnologías como Zinc-Finger nucleasas (ZFN)
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Protocolo
Procedimientos relacionados con temas de animales han sido aprobados y están de acuerdo con las pautas de cuidado de los animales proporcionan por el Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal y la Universidad de Ottawa comités de cuidado de los animales.
1. preparación
- Preparación de la superficie de disección con cinta adhesiva una tapa de caja Petri de 9 cm con cinta de autoclave en toda su superficie interior. Colocarlo bajo un microscopio estéreo.
- Lugar de fertilización después de 3-5 días (PD) larvas de pez cebra en una Petri dish y anestesiar en ˜1.5 mM Metanosulfonato de 1 medio de x E3 de embriones (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM C....
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Resultados
La eficiencia de la protocolo fue demostrada por genotipificación la descendencia de un cruce heterocigoto (aldh7a1+ ot100, aquí se muestra como aldh7a1+-) ()Figura 3A- C)9. El alelo mutante aldh7a1ot100tiene una inserción de par 5-bajo (bp) en el primer exón de codificación del gene aldh7a1 del pez cebra que conduce a mutágeno ' fram.......
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Discusión
Gen se han empleado herramientas de edición precisamente introducir mutaciones y los transgenes en el pez cebra en los últimos años5,6,7,8. Cuando se realiza la enfermedad en pez cebra, primeros fenotipos larvales o juveniles a menudo se observan9,12,13,14. El protoco.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a los modelos raros de la enfermedad y mecanismo (RDMM) red (financiada por los institutos canadienses de investigación de salud (CIHR) y genoma Canadá). CK es apoyada por una beca de la UROP (Universidad de Ottawa). DLJ es apoyado por una beca postgrado Vanier Canadá. IAP es apoyado por un premio de beca postdoctoral de institutos canadienses de investigación de salud (CIHR). Los autores agradecen la Genetics Society of America para la concesión de permiso para publicar este protocolo y utilizar una adaptación de la figura 5 suplementarios de Pena, et al.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa | Petri Microbisturí | 430167 | |
| Corning World Precision Instruments 500249 | |||
| Microscopio estereoscópico | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaína/3-aminobenzoato de etilo metanosulfonato | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos | Costar | 3595 | |
| PCR de 96 pocillos placa | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 forma de sodio | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Ácido Bórico | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sistema Sub-Cell Modelo 192 | Bio-Rad | ||
| Solución de acrilamida/Bis al 30 %, 37,5: 1 | Bio-Rad | ||
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| (Kimwipes® toallitas desechables) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| marcador de peso de más de 1kb-molecylar | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Agua libre de nucleasasa | Sistema Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Modelo 192 (sistema de gel de agarosa de alto rendimiento) | Bio-Rad | ||
| sistema de electroforesis vertical en gel Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad |
Referencias
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Stewart, A. M., Kalueff, A. V. Developing better and more valid animal models of brain disorders. Behav Brain Res. 276....
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Reimpresiones y permisos
