Azul de toluidina tinción de secciones embebido en resina para la evaluación de la morfología del nervio periférico

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para visualizar estructuras finas de los nervios periféricos de obtención y tinción de secciones de 1-2 μm con toluidina azul

Resumen

Los nervios periféricos se extienden por todo el cuerpo, inervan los tejidos diana con axones motores o sensoriales. Debido a la amplia distribución, los nervios periféricos con frecuencia se dañan debido a trauma o enfermedad. Métodos y estrategias se han desarrollado para evaluar lesiones de nervios periféricos en modelos animales, la función y regeneración, análisis de la morfometría de los nervios periféricos se ha convertido en una medida esencial resultado terminal. La coloración del nervio Cruz azul de la toluidina secciones de secciones de resina incrustada del nervio es un método reproducible para la evaluación cualitativa y cuantitativa de los nervios periféricos, lo que permite la visualización del número de axones de morfología y grado de myelination. Esta técnica, como con muchos otros métodos histológicos, puede ser difícil de aprender y dominar mediante protocolos estándar escritos. La intención de esta publicación es por lo tanto acentúan protocolos escritos para la coloración de los nervios periféricos con videografía del método, con los nervios ciático de ratas azul de toluidina. En este protocolo se describe en vivo fijación del nervio periférico y colección del tejido y la fijación con tetróxido de osmio 2%, incrustación de nervios en la resina de epoxy y ultramicrótomo secciones de nervios a 1-2 μm de espesor. Secciones del nervio luego transfirieron a un portaobjetos de vidrio y teñidas con azul de toluidina, después de lo cual ellos son cuantitativa y cualitativamente evaluados. Se muestran ejemplos de los problemas más comunes, así como medidas para mitigar estos problemas.

Introducción

Los nervios periféricos se extienden por todo el cuerpo, inervan los tejidos diana con axones motores o sensoriales¹. Defectos de los nervios periféricos causaron por trastornos y traumas representan un problema de salud pública importante y tiene grandes repercusiones económicas^2,3. A pesar de los avances en la evaluación de los resultados de las lesiones de nervio periférico y la comprensión de la regeneración del nervio, los métodos tradicionales tales como nervio histología y técnicas de tinción son herramientas esenciales evaluar cualitativa y cuantitativamente la salud del nervio como una medida de resultado terminal en modelos animales o tejido humano suprimido. Esto a menudo es acompañado de medidas electrofisiológicas de la función de nervio periférico, donde morfometría puede revelar por qué regeneración nerviosa funcional hizo o no ocurrió.

Azul de toluidina tinción de secciones semi-delgadas periférica del nervio de resina incrustada es un método especializado de fibras de nervio myelinated, proporcionando la alta calidad de imagen y detalladas imágenes claras del nervio estructuras^4,5,6 . Azul de toluidina es una tinción metacromática acidófilas, descubierta por William Henry Perkin en⁷de 1856 y ha sido utilizado en varias aplicaciones médicas⁸. Secciones de nervio periférico teñido de azul de toluidina de segmentos nerviosos embebido en resina permite la clara visualización de las estructuras nerviosas. Visualización de la estructura de la vaina de mielina puede ser mejorado por el uso de tetróxido de osmio posteriores a la fijación^4,9. Tetróxido de osmio es un oxidante y los lípidos fijador agente tóxico que interactúa con los enlaces dobles en lípidos, resultando claramente definidas las envolturas de myelin ricos en lípidos¹⁰. Sin embargo, tetraóxido de osmio es tóxico, caro, requiere una incubación más larga de segmentos nerviosos y no se utiliza siempre.

Se han desarrollado métodos alternativos de procesamiento y tinción para visualización de la morfología del nervio periférico; Parafina, secciones criogénico y seccionamiento de nervio embebido en resina epoxi seguida de tinción con azul de toluidina o solución fenilenodiamina se ha utilizado para cuantificar los cambios morfológicos de la regeneración del nervio periférico ^11,12 . Cada uno de estos métodos tienen sus ventajas y rendimiento de datos esenciales sobre el número de axones, mielina grosor, diámetro de axón y diámetro del axon myelinated fibra diámetro (cociente de g) ^11,13,14,15 .

La principal distinción de la incrustación de resina en este protocolo es que facilita la obtención de secciones transversales de espesor de 1-2 μm debido a la dureza de la resina mientras que mantiene las cualidades histológicas del nervio. Estas secciones finas, en comparación con el 4-5 μm espesor secciones de parafina inclusión, proporcionan secciones periféricas del nervio con mayor resolución, lo que permite una cuantificación más precisa de la mielinización del axón, como la relación de g, que no puede ser obtenidos de las secciones más gruesas¹⁶. Mientras que la sección criogénica puede utilizarse para obtener secciones de 1-2 μm, ha sido nuestra experiencia que es más difícil obtener secciones sin numerosas fisuras grandes. Dichas secciones agrietadas pueden causar conteo inexacto del número de axones y aspectos del myelination.

Además de azul de toluidina¹⁷la coloración, una tinción método¹⁸ y tinción tricrómica de Masson⁴ de plata también puede utilizarse para demostrar axones nerviosos. Sin embargo, utilizando resina, incrustación de secciones del nervio mediano de rata teñido con hematoxilina y eosina o Masson trichrome mostró débil las envolturas de myelin y estructuras desconocidas, considerando que la tinción de azul de toluidina demostró imagen clara de la mielina y puede fácilmente ser cuantificados⁴. A pesar de algunas limitaciones, los nervios de toluidina azul de resina incrustada la coloración periférica es una técnica valiosa que puede utilizarse cuando se necesitan imágenes de alta resolución de la morfología del nervio.

La principal desventaja para la incrustación de resina es que consume mucho tiempo y no permite el immunostaining del tejido del mismo debido a la dificultad de recuperación de antígeno en comparación con la parafina y las secciones congeladas incrustado técnicas. Por lo tanto, no es generalmente posible utilizar el mismo tejido para la inmunotinción que se procesa mediante incrustación de resina para la tinción de azul de toluidina. Aunque no utilizado aquí, si se desea immunohistochemistry en resina secciones embebidas, el uso de metacrilato de glicol incorporar resinas permite immunohistochemistry ser realizadas en las secciones de tejido, pero es relativamente caro¹⁹. Esto puede mitigarse un poco cortando el nervio periférico en segmentos, algunos para incrustación de resina y otros para la inmunotinción directamente después de la fijación.

El proceso de tinción de toluidina azul de resina incrustados los nervios periféricos, como con el análisis histopatológico más, puede dividirse en cinco etapas, incluyendo fijación, deshidratación, inclusión, seccionamiento y tinción²⁰. Aquí pretendemos proporcionar un protocolo y guía práctica para el uso de las secciones de nervio ciático de rata incrustado manchadas de resina con imágenes de alta calidad para la adquisición de azul de toluidina.

Protocolo

Ratas Sprague Dawley adultas fueron utilizadas en este proyecto y todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de uso y cuidado de los animales institucional Universidad de Wyoming.

1. cirugía y fijación del nervio Vivo

Nota: Información del vendedor para todos los materiales y equipos utilizados en el presente Protocolo se enumeran en la Tabla de materiales.

Nota: En vivo fijación del nervio se utiliza para preservar el tejido y reducir la degradación estructural que puede ocurrir entre el momento de la muerte y colección de los nervios. Fijación del tejido in vivo es una práctica estándar para preparación de tejido del sistema nervioso histología, donde la perfusión es a menudo un precursor a esto. La colocación y el tamaño de los nervios periféricos permitidos para la fijación in situ. No se recomienda recolección y fijación del tejido después de la eutanasia debido a la posibilidad de degradación de tejido.

1. Preparar la rata para la anestesia general colocando en una cámara de inducción con isoflurano 2-3%, luego colocar la rata anestesia en la posición prona en la parte superior de una estera de disección y mantener 1-2% de isoflurano vía cono anestésica. Para garantizar la adecuada profundidad de la anestesia, animales para la retirada de pedal en los pies traseros de prueba y Compruebe la ausencia de los reflejos palpebrales en los ojos tocando el canto medial del ojo.
   Nota: Inyección Intraperitoneal de la ketamina es una alternativa comúnmente usada para isoflurano inhalado.
2. Para exponer el nervio ciático, afeita el pelo de la hind limb(s) y limpie las áreas afeitadas con etanol al 70%. Con un bisturí o tijeras, haga una incisión de 2-3 cm en la piel a lo largo de las extremidades desde la rodilla hasta el trocánter mayor, donde la palpación del fémur con el bisturí estéril para asegurar la correcta ubicación de la incisión. El fémur se encuentra justo proximal al segmento más accesible del nervio ciático. A pesar de que esta es una cirugía no supervivencia, mantienen técnicas estériles.
3. Después de hacer la incisión en la piel, localizar el plano entre el músculo bíceps femoral y el glúteo y con unas tijeras de microdisección separar la fascia subyacente y exponer 2-3 cm del nervio ciático subrayado. Para exponer una clara sección del nervio ciático, usar un retractor para ensanchar la brecha entre los dos músculos (figura 1A). Con finas pinzas y tijeras de iris, cuidadosamente separar el nervio que rodea el tejido conectivo, teniendo mucho cuidado de no comprimir o cortar el nervio.
4. Añadir fijador de Trump suficiente (formaldehído al 4%, glutaraldehído al 1% en PBS 1 x (tamponada fosfato salino) 1,16 g de NaH2PO4· H2O / 100 mL) en la cavidad que contiene el nervio expuesto para cubrir el nervio y dejar reposar durante 10 minutos. Si necesario, lugar de gasa en las traseras de la pierna para mejorar el ángulo para que el fijador más puede añadirse en la cavidad. Retirar el fijador después de 10 min y repita este paso dos veces más.
5. Utilizando un microscopio de disección, cortar los nervios de ambos lados con unas tijeras de disección fina, procurando no estirar o pellizcar el nervio ciático y poner inmediatamente las secciones del nervio en tubos de 15 mL que contiene fijador de Trump a 4 ° C durante una semana, cambiando el fijador cada 48 h.
6. No descuide los animales durante cualquier parte del procedimiento quirúrgico. Después del retiro del nervio, eutanasia animales por dislocación cervical bajo anestesia.

2. el tetróxido de osmio tratamiento e incrustación de resina

1. Post fijación, con cuidado quite cualquier resto grasa y los tejidos conectivos del nervio y use un bisturí afilado para cortar el nervio en segmentos de aproximadamente 5 mm de largo (nervio segmentos pueden ser separados y etiquetados en diferentes tubos). Preparar fresco el tetróxido de osmio 2% diluido en solución fijadora de Trump y guardar en un tubo de vidrio. Sumerja los segmentos nerviosos en tetróxido de osmio 2% durante 2 h, que puede ser en tubos de plástico para este corto periodo de tiempo.
   Nota: Algunos tubos plásticos reaccionan con tetróxido de osmio, que causan un oscurecimiento de la solución, por lo que no se recomienda el almacenamiento prolongado de tetróxido de osmio en tubos de plástico.
2. Con una resina de incrustación kit mediano, preparar la fórmula final de empotrar:
   1. Mezclar el epoxi incrustar medio con solución DDSA (anhídrido dodecenylsuccinic; mezcla A) y mezclar el epoxi incrustar medio con solución NMA (anhídrido methylnadic; mezcla B). Que ambas mezclas A y B por lo menos 20 minutos la mezcla por agitación con un agitador magnético.
   2. Inmediatamente antes del uso, mezcla de A y B de la mezcla y agregar el acelerador DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) de la proporción de 1.5 a 2.0% del volumen total de la mezcla. Tenga en cuenta que se debe medir la solución DPM 30 precisamente para evitar que el bloque de color oscuro y quebradizo. Los productos químicos de la resina son tóxicos; tener especial cuidado para evitar contacto con la piel o inhalación.
3. Utilizando tubos de 1,5 mL, lavar segmentos nerviosos con PBS e iniciar el proceso de deshidratación mediante la colocación de los segmentos del nervio en acetona/agua destilada diferentes pasajes del agua: 30%, 60%, 90%, las concentraciones de 10 minutos cada uno, entonces en acetona al 100% durante 10 minutos 3 veces.  Tenga en cuenta que el etanol puede ser utilizado en lugar de acetona.
4. Para infiltración de resina, poner 1 parte de acetona 100% por 30 min, luego en una mezcla de 2 partes de la mezcla final de empotrar y 1 parte de acetona 100% por 30 min y los segmentos del nervio en una mezcla de 1 parte de la mezcla final de empotrar , y finalmente lugar el nervio segmentos en la final incorporar mezcla durante 30 minutos.
5. Poner los segmentos nerviosos en caucho de silicona moldes de inclusión (han utilizado la longitud 106 mm x 71 mm de ancho x 7 mm de profundidad; bloquear tamaño 11 mm de longitud x 6 mm de ancho x 3 mm de profundidad). Añadir suavemente la resina encima de los nervios, asegurándose de cubrir los segmentos de todo nervio y evitar burbujas de aire. Deje el molde que contiene segmentos nerviosos con la resina para polimerizar a 60 ° C durante la noche.

3. seccionar por ultramicrótomo

1. Preparar vidrio cuchillos uso un cuchillo de vidrio (figura 1B) y hacer cuchillos de cristal con barcos (figura 1), que se utilizan para recoger secciones del nervio flotando en el agua destilada.
2. Coloque los bloques de nervio de resina incrustada en el soporte de ultramicrotomía con el trapecio hacia arriba. Con el alcance de la ultramicrotomía, recortar cualquier exceso de resina que rodea el tejido nervioso y hacer el bloque de enfrente con forma de trapecio y como cerca de la superficie longitudinal del nervio posible utilizando un solo filo del disco, como una hoja de afeitar. No penetran en la superficie longitudinal del segmento del nervio, que es reconocible por su coloración oscura por el tetróxido de osmio.
   Nota: Corte del exceso de resina reduce el área de resina para ser seccionados y mejorar el rendimiento de la hoja y corte en los pasos posteriores.
3. Con el ultramicrótomo, realizar múltiples cortes transversales suficientes para exponer una superficie de sección transversal uniforme de tejido fino del nervio, usando un cuchillo de vidrio llano. Una vez hecho esto, cambie a un cuchillo de vidrio cuyo barco se llena con agua destilada a temperatura ambiente y ajustar el ultramicrótomo para 1-2 μm para cortar secciones delgadas.
4. Transferencia de secciones delgadas flotantes desde el barco de cuchillo de vidrio a una gota de agua desionizada en portaobjetos de vidrio con asa de metal (figura 1). Seque el portaobjetos que contiene secciones pasando varias veces sobre una llama durante unos segundos, asegurándose de que no se sobrecaliente las secciones. Manchas secas las secciones inmediatamente con toluidina azul o almacenar a temperatura ambiente durante varios días antes de la tinción.
   Nota: Las secciones pueden también secarse utilizando un plato caliente a 60 ° C durante 15 minutos. Un lento proceso de secado hace que las secciones suave.

4. toluidina azul de tinción

1. Preparar solución de azul de toluidina 1% disolviendo 2 g de borato de sodio en 100 mL de agua desionizada, añada 1 g de azul de toluidina y revuelva hasta que se disuelva. Filtrar la solución con papel filtro (tamaño de poro: 11 μm) y mantener la solución en una botella opaca a temperatura ambiente hasta por dos semanas.
2. Utilizando una pipeta de plástico o una micro pipeta, añada una gota de solución de azul de toluidina en la parte superior de las secciones del nervio y dejar durante 20-30 s.
3. Enjuague toda solución de azul de toluidina exceso sumergiendo suavemente los portaobjetos en agua desionizada jarra y repita 3 - 4 veces hasta que las secciones son claras. Seque el portaobjetos al menos 15 min a 60 ° C o durante la noche a temperatura ambiente y luego cubrir las secciones con un cubreobjetos usando medio de montaje regular. Examinar las diapositivas montadas inmediatamente o almacenar a temperatura ambiente.
4. Examinar bajo un microscopio de luz. Un objetivo de inmersión 100 X aceite se recomienda para imágenes detalladas para calcular ratios de g.

Resultados

Resina incrustada secciones teñidas con toluidina azul permiten cuantificaciones precisas datos histológicos de nervios periféricos. Un resumen del procedimiento se muestra en la (figura 2). Secciones de nervios ciáticos encajado en medio resina y teñidas con azul de toluidina demostrada clara imágenes con una resolución óptima (figuras 3). Daño del nervio puede causar muchos cambios en nervio estructuras morfológicas, por ejemplo, cambios en...

Discusión

Exámenes de las estructuras morfológicas de la lesión periférica del nervio y regeneración son frecuentes temas de estudio¹³. En este protocolo, describimos los pasos para obtener imágenes de alta calidad para cuantificaciones de datos histológicos utilizando tejido de nervio ciático de rata incrustados en bloques de resina y teñidas con azul de toluidina. Esta técnica proporciona una imagen de la morfología del nervio en el que la regeneración del nervio puede ser cuantificada midiendo el número ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tampón de fosfato de Dulbecco solución salina	Gibco	14200-075
Solución de glutaraldehído	Sigma-Aldrich	G6257
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich	P6148
Fosfato de sodio monobásico monohidrato	Sigma-Aldrich	S9638
Azul de toluidina O	Sigma-Aldrich	T3260
Tetraborato de sodio Decahidrato	Acros Organics	205950010
Isoflurano	Piramal	NDC 66794-013-25
Kit de medio de inclusión epoxi	Sigma-Aldrich	45359
Solución de hidróxido de sodio	Sigma-Aldrich	72068	Para ajustar el pH fijador de Trump
Acetona	Fisher Chemical	170942
Solución de tetróxido de osmio	Sigma-Aldrich	75632
Microportaobjetos VWR, Superfrost Plus	VWR	48311-703
Cubierta de vidrio para microscopio	Fisher Scientific	12545102
Pelco Fundido de incrustación	Fisher Scientific	NC9671811
Fabricante de cuchillos de vidrio	Productos RMC	Ultramicrótomo GKM-2
	RMC Productos	MT-XL
15 mL Tubo cónico	Falcon	ISO 9001
Eppendorf 1,5 mL Tubos de microcentrífuga	Sigma-Aldrich	T9661
4 mL Vial de vidrio	Sigma-Aldrich	854190
Hojas de afeitar	VWR	55411-050	Para recortar bloques de resina
Perfect Loop	Electrónica Microscopía Ciencias	70944	Para recoger secciones finas de resina
Tiras de cuchilla de vidrio ultra 6,4 mm x 25 mm x 400 mm	Ciencias de la microscopía electrónica	71012
Horno de 100 vatios	Millipore
Whatman Papel	de filtro Sigma-Aldrich	WHA10010155
pipeta de plástico de 3 mL	Z331740		Sigma-Aldrich
Instrumentos			precisión mundial
Microscopio			Cámara CCD dual en color y monocromática, DP80