En este protocolo, nuestro objetivo es describir un método reproducible para combinar disociado humanas pluripotentes células madre derivadas neuronas y astrocitos juntos en 3D esfera cocultures, mantener estas esferas en condiciones flotantes libres y posteriormente medición de la actividad de circuito sináptico de las esferas con inmunoanálisis y matriz micropozo-microcanal grabaciones.
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Artículo de método
Microcircuito sináptica modelado con 3D Cocultures de astrocitos y neuronas de células madre pluripotentes humanas
En este artículo
Resumen
Resumen
Una barrera para nuestra comprensión de cómo varios tipos de células y señales contribuyen a la función sináptica del circuito es la falta de modelos relevantes para el estudio del cerebro humano. Una tecnología emergente para abordar este tema es el uso de tres dimensiones (3D) nervios cultivos de células, denominado 'organoides' o esferoides, para la preservación a largo plazo de las interacciones intercelulares como moléculas de adhesión extracelular. Sin embargo, estos sistemas de cultivo son mucho tiempo y no sistemáticamente generado. Aquí detallamos un método rápidamente y consistentemente producir cocultures 3D de neuronas y astrocitos de humanas pluripotentes células madre. Astrocitos en primer lugar, el distinguido y trasplante de precursores neuronales es disociados y contado. A continuación, las células se combinan en forma de esfera platos con un inhibidor de la Rho-quinasa y en proporciones específicas para producir esferas de tamaño reproducible. Después de varias semanas de la cultura como esferas flotantes, cocultures ('asteroides') finalmente se secciona para la inmunotinción o plateados sobre matrices micropozo-microcanal para medir la fuerza y la densidad sináptica. En general, se espera que este protocolo dará 3D esferas neurales que mostrar marcadores del tipo de célula madura restringido, forman sinapsis funcionales y exhiben red sináptica espontánea explosión actividad. Juntos, este sistema permite detección de drogas y las investigaciones sobre los mecanismos de la enfermedad en un modelo más conveniente en comparación con cultivos de monocapa.
Introducción
Los astrocitos son un tipo de célula glial muy abundante dentro de sistema nervioso central (SNC) con una variedad de responsabilidades funcionales más allá de la ayuda estructural. A través de la secreción de factores solubles sinaptogénica y componentes de la matriz extracelular (ECM), astrocitos ayudan en el establecimiento y agrupación de sinapsis Maduritas durante desarrollo1. También juegan un papel crítico en el mantenimiento de la salud y plasticidad de las sinapsis a través de señalización extracelular2,3,4,5....
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Protocolo
1. cultura y preparación de los reactivos de la célula
Nota: Los protocolos en esta sección se escriben en el orden en que aparecen en el protocolo de diferenciación (sección 2). Vea la Tabla de materiales para materiales y números de catálogo.
-
Preparar placas cubiertas para el cultivo celular.
- Solución de capa de matriz extracelular (ECM) con medio DMEM/F12 prepare un 1 mg/mL solución diluida. Alícuota ECM diluido solución de stock en 30 tubos cónicos de 3 mL y almacenar inmediatamente a-20 ° C. Para una solución de trabajo, suspender 3 mL de caldo de ECM en 33 mL de pre enfriados medi....
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Resultados
Cuando se realiza correctamente, este protocolo produce poblaciones definidas de cocultures funcionales de astrocitos28,33,34 y neuronas35 generados a partir de hPSCs (figura 1A-1C), como detallado anteriormente26 y aquí descritos en los pasos 2.1, 2.2. Este procedimiento paso a paso, con la utilización.......
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Discusión
En este protocolo, se describe un método sistemático para la producción de esferas 3D de nervios cocultures. Las esferas están compuestos por astrocitos y neuronas, que se derivan independientemente de hPSCs. Aunque no es el objetivo de este protocolo, la generación de poblaciones puras de astrocitos del hPSCs28 es un paso crítico y puede ser técnicamente difícil si se realiza sin experiencia previa. Este primer paso en la generación de estos microcircuitos sinápticas debe realizarse con tiempo me.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a Dr. Erik Ullian (UCSF) por entrada intelectual sobre el diseño de estos procedimientos, el Dr. Michael Ward (NIH) para asesoramiento técnico en la diferenciación iNeuron y Barlas de Saba para el análisis preliminar de la imagen.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de 6 pocillos | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 15 mL tubos cónicos | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Accutase | Sigma | A6964-100ML | Solución de desprendimiento |
| Placa AggreWell Stemcell | Technologies | 34850 | |
| Solución de enjuague antiadherente | Stemcell Technologies | 7010 | Prevent cell Adhesión a placas de micropocillos |
| Anti/Anti | Thermofisher | 15240062 | |
| B27 | Thermofisher | 17504044 | Suplemento de medios |
| BrainPhys Medio neuronal | Stemcell Technologies | 5790 | Alternativa neurofisiológica al medio basal |
| Cubreobjetos circulares de vidrio | Neuvitro | GG-12-oz | |
| Cryostor CS10 | Stemcell Tecnologías | 7930 | Medio de criopreservación con 10% de DMSO |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 10565-042 | Con suplemento GlutaMAX |
| DMH-1 | Stemcell Technologies | 73634 | PELIGRO: Tóxico si se ingiere. Concentración de trabajo: 2 μ Suero M |
| Donkey | Lampire Biological Laboratories | 7332100 | Concentración de trabajo: 5% en tampón de bloqueo primario, 1% en tampón de bloqueo secundario |
| Clorhidrato de doxiciclina (Dox) | Sigma | D3072-1ml | PELIGRO: Tóxico para mujeres embarazadas. Concentración de trabajo: 2 μ g/mL |
| Factor de crecimiento epidérmico (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Concentración de trabajo: 10 ng/mL |
| Factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF) | Peprotech | 100-18B | Concentración de trabajo: 10 ng/mL |
| Solución de montaje Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Portaobjetos de vidrio | Fisherbrand | 22-037-246 | |
| Suero | de cabraLaboratorios Biológicos Lampire | 7332500 | Concentración de trabajo: 5% en tampón de bloqueo primario, 1% en tampón de bloqueo secundario |
| Hemacitómetro o contador automático de células | Life Technologies | AMQAX1000 | |
| Heparina | Sigma | H3149-50KU Concentración de | trabajo: 2 mg/mL |
| Placa magnética | DLAB | 8030170200 | |
| Matriz | de membrana MatrigelSolución de recubrimiento Corning | 354230 | ECM. Concentración de trabajo: 80 μ g/ml. Prepárese en hielo y asegúrese de que las pipetas, los tubos y los medios estén previamente enfriados. |
| Sistema MEA 2100 Sistemas | multicanal | MEA2100 | |
| solución de montaje | |||
| N2 | Thermofisher | 17502048 | Media Supplement |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | Solución de inclusión de tejidos para crioseccionamiento |
| Pap Pen (Aqua Hold) | Laboratorio de dispositivos científicos | 9804-02 | |
| Paraformaldehído ( PFA) | Acros Organics | 169650025 | PELIGRO: Tóxico si se inhala. Concentración de trabajo: 4% en PBS |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Stemcell Technologies | CA008-300 | |
| Poly-l-ornitina (PLO) | Sigma | P3655-100MG Concentración de | trabajo: 0,5 mg/mL |
| Cubreobjetos de vidrio rectangulares | Fisherfinest Premium Superslip | 12-545-88 | |
| ReLeSR | Stemcell Technologies | 5872 | Desmontaje y paso reactivo |
| Inhibidor de la Rho-Quinasa Y27632- (Y) | Tocris | 1254 | Concentración de trabajo: 10 uM |
| SB431542 | Stemcell Technologies | 72234 | Concentración de trabajo: 2 μ Matraces |
| giratorios | Fisher Scientific | 4500-125 | |
| Sacarosa | Fisher Chemical | S5-3 Concentración de | trabajo: 20% o 30% en PBS |
| T25 Matraz de cultivo | Olympus Plastics | 25-207 | Tapones ventilados |
| T75 Matraz de cultivo Olympus | Plastics | 25-209 | Tapones ventilados |
| Terg-A-zyme | Sigma | Z273287-1EA | Detergente. Concentración de trabajo: 1% |
| Medio basal TeSR-E8 | Stemcell Technologies | 5940 | Medio de células madre pluripotentes humanas (hPSC) |
| Suplementos de TeSR-E8 Stemcell | Technologies | 5940 | Suplementos para medio de células madre pluripotentes humanas |
| TritonX-100 | Sigma | X100-500ML | Detergente para la permeabilización celular. Concentración de trabajo: 0,25% en tampón bloqueante |
| Azul de tripano | Invitrogen | T10282 | |
| Anticuerpos | |||
| AlexaFluor 488 | Thermofisher | A-11029 | Anticuerpo secundario |
| AlexaFluor 594 | Thermofisher | A-11037 | Anticuerpo secundario |
| Ezrin | Thermofisher | MA5-13862 | Anticuerpo primario; astrocitos perisinápticos |
| GFAP | Chemicon | MAB360 | Anticuerpo primario; astrocitos |
| GFP | Aves | GFP-1020 | Anticuerpo primario; astrocitos |
| Glt1 | Regalo del Dr. Jeffrey Rothstein | n/a | Anticuerpo primario; astrocitos |
| Homer | Synaptic Systems | 160 011 | Anticuerpo primario; neuronas postsinápticas |
| MAP2 | Sistemas sinápticos | 188 004 | Anticuerpo primario; neuronas |
| PSD95 | Abcam | ab2723 | Anticuerpo primario; neuronas postsinápticas |
| S100 | Abcam | ab868 | Anticuerpo primario; astrocitos |
| Sinapsina 1 | Sistemas sinápticos | 106 103 | Anticuerpo primario; neuronas, presináptico |
| TuJ1/β 3-tubulina (TUBB3) | Covance | MMS-435P | Anticuerpo primario; neuronas |
Referencias
- Ullian, E. M., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Role for Glia in Synaptogenesis. Glia. 47, 209-216 (2004).
- Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
- Molofsky, A. V., et al.
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Reimpresiones y permisos
