Medición activa y pasiva mansedumbre por separado en ratones

Resumen

Mansedumbre de los animales incluye una reducción de las respuestas de evitación a los seres humanos (mansedumbre pasiva) y un aumento en enfoques activos a los seres humanos (mansedumbre activo). Aquí, describimos protocolos detallados para tres pruebas conductuales (mansedumbre activa pasiva mansedumbre y pruebas de estancia-la-mano) para medir por separado la mansedumbre activa y pasiva de los ratones.

Resumen

Animales domésticos como perros y ratones de laboratorio demuestran un alto nivel de mansedumbre, que es importante para los seres humanos manipularlos fácilmente. Mansedumbre tiene dos componentes conductuales: renuencia a evitar los seres humanos (mansedumbre pasiva) y una motivación a los seres humanos de enfoque (mansedumbre activo). Para cuantificar estos componentes en los ratones, previamente desarrollamos pruebas de comportamiento para mansedumbre activa, pasiva mansedumbre, y la voluntad de permanecer en una mano humana, cada uno diseñado para completarse en 3 minutos. Los datos obtenidos fueron utilizados para la cría selectiva, con un gran número de ratones analizados por generación. La prueba de mansedumbre activo mide el movimiento del ratón a una mano humana y el contacto a que se dedica. La prueba de mansedumbre pasiva mide la duración de tiempo que un ratón tolera el toque humano. En la prueba de la estancia-la-mano, un ratón se coloca en una mano y tocó lentamente usando el pulgar de la mano; se mide la duración de tiempo que el animal permanece en la mano. Aquí, describimos la prueba instalación y aparatos, explicar los procedimientos y discutir el análisis de datos apropiado. Por último, explicamos cómo interpretar los resultados.

Introducción

Cría selectiva durante la domesticación ha cambiado las características de los animales domesticados que estén mejor adaptadas para vivir con los seres humanos^1,2,3. "Mansedumbre" es un rasgo común de comportamiento observado en animales domesticados. Los estudios de cría selectiva para mansedumbre en animales revelan cómo han cambiado sus fenotipos en el curso de domesticación. En un estudio famoso, zorros fueron criados selectivamente para la mansedumbre y un grupo de zorros que exhibió un alto nivel de mansedumbre fue establecido². Los zorros también mostraron otros cambios del fenotipo entre morfología, reproducción, color de la capa y características fisiológicas. Mansedumbre en ratones de cría selectiva, un animal de laboratorio populares, puede ayudar a revelar el mecanismo subyacente del cambio en una variedad de fenotipos durante la domesticación.

Mansedumbre tiene dos componentes conductuales: enfoques activos a los seres humanos (mansedumbre activo) y una reducción de la evitación de los seres humanos (pasiva mansedumbre)⁴. En un estudio anterior, establecimos tres pruebas conductuales para caracterizar los niveles de mansedumbre en ratones: mansedumbre activa pasiva mansedumbre y estancia en mano las pruebas de⁵. La primera prueba fue diseñada para cuantificar mansedumbre activo del ratón mediante la medición de la latencia de su actitud espontánea hacia un ser humano y el tiempo de permanencia en contacto con una mano humana. La segunda prueba fue diseñada para cuantificar la mansedumbre pasiva midiendo cuánto tiempo un ratón tolerado ser tocado por una mano humana. La prueba de estancia en mano pretendía cuantificar la evitación conductual de ser acarició suavemente por una mano humana. Estas tres evaluaciones requieren sólo un aparato de campo abierto, una cámara digital y un par de grandes pinzas. Ellos pueden completarse secuencialmente dentro de 3 minutos, lo que permite una gran cantidad de datos a ser recogidos por día.

En el estudio anterior, caracteriza y compara conductas de mansedumbre utilizando una serie de cepas consanguíneas de ratón: 10 variedades silvestres, una japonesa lujo derivado de ratón cepa y laboratorio seis cepas⁵. Más domesticaron cepas mostraron una significativamente mayor mansedumbre pasiva de variedades silvestres, pero la mansedumbre activo no difirió entre los dos grupos. De estos resultados, se concluye que los ratones domésticos que son los fundadores de las cepas de laboratorio predominante fueron seleccionados por su mansedumbre pasiva, pero no para activo mansedumbre, en su historia de crianza.

A continuación realizamos una cría selectiva con ocho cepas de ratón salvaje para generar una población genéticamente heterogénea⁶. Elegimos los animales que anotaron alto en la prueba de mansedumbre activo y con éxito creciente su mansedumbre activo en generaciones sucesivas, en comparación con un grupo control. Este resultado indica que las pruebas medir fiablemente la mansedumbre en ratones.

Aquí, describimos el método integral para la medición de índices de comportamiento usando las tres pruebas de comportamiento. En primer lugar, se explican la instalación y aparatos necesarios. A continuación, detallamos el procedimiento paso a paso para el funcionamiento de los experimentos, recogida de datos a través de video y análisis de dichos datos utilizando el software gratuito que desarrollamos. Por último, mostramos resultados representativos, comparando el grupo de ratones criados selectivamente con un grupo control.

Protocolo

Todos los experimentos fueron realizados siguiendo las directrices de los experimentos con animales del Instituto Nacional de genética (NIG), y todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de NIG para cuidado de animales y el uso (homologación Nº 26-9).

1. los animales

1. Cría selectiva
   1. Crear derivados salvajes heterogéneos stock (WHS)⁶ ratones, cruzando 8 cepas consanguíneas (MSM, HMI, BLG2, PGN2, KJR, CHD, NJL y BFM/2) evitando cualquier endogamia (apareamiento entre hermanos o primos)⁷. Llevar a cabo una cría selectiva, a partir de la tercera generación (G3), mediante la selección de ratones que muestran más "tiempo de contacto" (grupo seleccionado, 16 familias de pares de acoplamiento) según la mansedumbre active test (ver paso 3.1).
   2. Generar el control no seleccionados grupo (también 16 familias de pares de acoplamiento) a través de apareamiento aleatorio de G3 hacia adelante. Para un experimento representativo, usar ratones obtenidos (S1) seleccionados y no seleccionados (C1) grupos de ratones WHS para mostrar el patrón de mansedumbre tanto activa como pasiva, usando las tres pruebas de mansedumbre (ver paso 3.1-3.3). Para los experimentos, utilizar 10 ratones de G15 por grupo (S1 y C1).
2. Representante animales del tema
   1. Retirar todos los ratones de sus padres a las 3 semanas de edad y alojarlos en grupos del mismo sexo con hermanos de camada, utilizando jaulas de tamaño estándar que contiene virutas de madera, hasta la prueba. Mantener los animales en una instalación para animal de NIG bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h (se enciende de 6:00 a 18:00) y una temperatura constante (23 ± 2 ° C).
   2. Que sean alimentos y agua disponibles ad libitum. Prueba de los ratones en 6 semanas de edad durante el periodo de luz para analizar sus interacciones con los seres humanos durante parte del día cuando los seres humanos están normalmente activos.
3. Protocolo de manejo
   1. Utilizar pinzas grandes cubiertas con tubos de silicona para transferir los ratones en jaulas nuevas por levantarlos suavemente por sus colas. Utilice las pinzas para separarlos de sus padres al destete y mueva durante los experimentos. Ninguno de los ratones deben recibir tratamiento antes de las pruebas de mansedumbre.
   2. Transferencia de los ratones a una sala experimental justo antes de las pruebas de mansedumbre.
   3. Mantener los ratones machos separados uno del otro después de la prueba, para evitar la agresión entre macho en ratones WHS.

2. equipo

1. Utilice un aparato de campo abierto (400 x 400 x 400 mm, grisácea Policloruro de vinilo).
2. Iluminar el campo abierto con una lámpara de clip con un bulbo blanco neutro (100 lux) fijado a una altura de 450 mm por encima del campo abierto (figura 1).
3. Registrar todos los comportamientos mediante una cámara digital compacta disponible en el mercado fijada en 850 mm por encima de los campos utilizando un trípode (figura 1).
4. Guantes de paño debajo de guantes de látex para proteger las manos de ser mordido en durante la prueba de mansedumbre pasiva (una reacción rara).
5. Medir el tiempo utilizando un cronómetro.

3. pruebas

Nota: Las dos primeras pruebas (mansedumbre activa y pasiva mansedumbre) se llevaron a cabo durante 1 min, y se llevó a cabo la prueba de estancia en mano para menos de 1 minuto. Todas las tres pruebas se realizaron en el aparato de campo abierto y había grabado con una cámara digital. Iodophore procedimiento de desinfección debe realizarse en todas apparats antes de cualquier estudio de comportamiento.

1. Procedimientos para la prueba de mansedumbre activo
   1. Encender la cámara digital y empezar a grabar.
   2. Recoger un ratón suavemente por la cola con un par de pinzas grandes (ver paso 1.3.1) y transferencia de la caja de página en el centro de los aparatos de campo abierto.
   3. Comenzar el cronómetro.
   4. Coloque la mano izquierda en la esquina inferior izquierda del aparato.
   5. Mantener la palma hacia arriba y mueva los dedos lentamente y constantemente para asegurarse de que el ratón conecta la mano a un ser humano. El tiempo promedio para poner los cuatro dedos del dedo meñique el dedo índice debe ser aproximadamente 0,5 s, con un ciclo de movimiento continuamente repetido.
   6. Mueva la mano hacia el ratón lentamente, a una velocidad media de unos 13 cm/s, deteniendo a 10 cm del lado del cuerpo del ratón.
   7. Mantener la misma distancia si el ratón intenta alejarse. Si el ratón se acerca, mantenga la mano en la misma posición y continúan moviéndose ligeramente los dedos. Si el ratón intenta subir por el brazo, volver al campo, utilizando la mano libre.
   8. Concluir la prueba después de 1 minuto, retirar la mano y proceder a la prueba de mansedumbre pasiva.
2. Procedimientos para la prueba de mansedumbre pasiva
   1. Siga los mismos pasos en cuanto a la prueba de mansedumbre activo, pero en lugar de detenerse 10 cm del cuerpo del ratón, tocar despacio el ratón con los dedos.
   2. Deje los dedos en la misma posición, ponerse en contacto con el ratón, hasta que el ratón se aleja. Cuando el ratón trata de romper el contacto, seguir moviendo a una velocidad media de unos 23 cm/s y reiniciar el toque.
   3. La conclusión de la prueba después de 1 minuto reiniciar el cronómetro inmediatamente para comenzar la prueba de la estancia-la-mano.
3. Procedimientos para la prueba de estancia-la-mano
   1. Levante el ratón por la cola con un par de grandes pinzas y colocarlo suavemente en la palma izquierda. Mantenga la mano cerca del piso de los aparatos de campo abierto.
   2. Movimiento el ratón suavemente a una velocidad media de 0,5 s/movimiento con el pulgar izquierdo hasta que sale la mano.
   3. Repita los pasos 3.3.1 - 3.3.2 x 3.
   4. Tras el tercer ensayo, dejar el video grabación; ahora se celebran todas las pruebas de mansedumbre.
4. Procedimientos post-experimentales
   1. Peso del ratón y contar el número de las heces y la orina que queda en el campo Abrir.
   2. El ratón de la marca individualmente mediante un golpe de oreja.
   3. Limpie el aparato y experimentador guantes con una toalla de papel humedecida en desinfectante yodoforo de 0.2%.
   4. Limpie el aparato con una toalla de papel seca.

4. comportamiento análisis

Nota: Grabaciones de Video fueron anotadas con tanaMove versión 0.01 (Windows 7), software de grabación de evento para los análisis de comportamiento (figura 2). El software está libremente disponible (1 materiales suplementarios) y en nuestro sitio web (http://www.mgrl-lab.jp/MGRL_software.html). Un individuo que estaba ciego a las condiciones de prueba anotó todo metraje. La duración de todos los índices conductuales fue medida en incrementos de 0.1 s. Durante la calificación, el observador pulsa la letra apropiada en el teclado (consulte el paso 4.1) sobre observando un comportamiento determinado.

1. Asignación de claves para el análisis de video
   1. Asignar teclas para cada índice de comportamiento. Con teclas apropiadas para cada índice de comportamiento es fundamental para resumir los datos automáticamente en el paso 4.3.
      Nota: Las asignaciones utilizadas en este estudio se muestran en la figura 3.
2. Análisis de video
   1. Analizar cada vídeo grabación 3 x para diferentes índices de comportamiento (figura 3B). Comportamiento uno mismo-de la preparación no fue anotada. Asegúrese de que el altavoz de la computadora se enciende para oír el sonido del temporizador en el video.
   2. Lanzamiento de tanaMove.
   3. Arrastrar y soltar el archivo de vídeo a analizar en la ventana de tanaMove. Confirme que el archivo se carga y que la ruta y el nombre del CSV outputted archivo en el cuadro Archivo de datos [CSV] es correcta.
   4. Haga clic en el botón listo . Esto activa una nueva ventana para introducir las claves asignadas.
   5. Haga clic en el botón Play para iniciar el archivo de vídeo. Haga clic en el botón Stop para detener el archivo de vídeo.
   6. Pulsa el botón A cuando el ratón se observa "hacia" o acercarse a la mano, incluyendo permanente detectar. La tecla R cuando el ratón se observa "producir" sin rumbo hacia la mano durante la prueba activa de mansedumbre.
   7. Pulse la tecla W para por lo menos 0,3 s (por lo menos tres intervalos en la ventana) cuando se escucha el sonido de temporizador 60 s.
   8. Iniciar el análisis de la prueba de mansedumbre pasiva después de la mano izquierda entra en el video. Pulsa el botón A cuando el ratón se observa hacia o acercarse a la mano y la tecla R cuando el ratón se observa viajando sin rumbo hacia la mano durante la prueba de mansedumbre pasiva.
   9. Pulse la tecla W para por lo menos 0,3 s (por lo menos tres intervalos en la ventana) cuando se escucha el sonido de temporizador 60 s.
   10. La tecla T cuando el ratón se observa "permanecer" en la mano en la prueba de la estancia-la-mano.
   11. Después de la prueba de la estancia-la-mano, haga clic en el botón Stop para detener la observación del video.
   12. Haga clic en el botón nuevo y escriba un nuevo nombre de archivo para la salida de datos CSV.
   13. Haga clic en el botón listo para activar una nueva ventana para introducir las claves asignadas.
   14. Haga clic en el botón Play para reiniciar las imágenes de vídeo e iniciar la observación de la prueba de mansedumbre activo.
   15. La tecla T cuando el ratón se observa "con" el ser humano, que incluye toda conducta entra en contacto con voluntarios pero contactos no accidentales, como el aterrizaje en una palmera después de saltar, en la mansedumbre activa prueba.
   16. Pulse la tecla W para por lo menos 0,3 s (por lo menos tres intervalos en la ventana) cuando se escucha el sonido de temporizador 60 s.
   17. Pulse la tecla T cuando el ratón permite al experimentador a tocar su cuerpo durante la prueba de mansedumbre pasiva.
   18. Pulse la tecla W para por lo menos 0,3 s (por lo menos tres intervalos en la ventana) cuando se escucha el sonido de temporizador 60 s.
   19. Haga clic en el botón Stop para detener el vídeo.
   20. Haga clic en el botón nuevo y escriba un nuevo nombre de archivo para la salida de datos CSV.
   21. Haga clic en el botón listo para activar una nueva ventana para introducir las claves asignadas.
   22. Haga clic en el botón Play para reiniciar las imágenes de vídeo e iniciar la observación de la prueba de mansedumbre activo.
   23. La tecla J cuando el ratón se observa "saltando" durante la prueba activa de mansedumbre.
   24. Pulse la tecla W para por lo menos 0,3 s (por lo menos tres intervalos en la ventana) cuando se escucha el sonido de temporizador 60 s. Luego iniciar la observación de la prueba de mansedumbre pasiva.
   25. La tecla J cuando el ratón se observa "saltando" durante la prueba de mansedumbre pasiva.
   26. Haga clic en el botón Stop para detener la observación del video cuando se escucha el sonido del temporizador 60 s.
   27. Haga clic en el botón nuevo y escriba un nuevo nombre de archivo para la salida de datos CSV.
3. Resumir los datos
   1. Guarde todos los archivos de datos (CSV) en la misma carpeta con el archivo xlsm complementario 2 (2 de materiales suplementarios).
   2. Abra el archivo xlsm complementario 2 y haga clic en el botón de resumir .
   3. Guardar los resultados como un archivo separado y utilizarlo para su posterior análisis del comportamiento de mansedumbre.

Resultados

Previamente realizamos una cría selectiva para mansedumbre activo en miceandsuccessfully producida ratones que mostraron un alto nivel de mansedumbre activo⁶. Los resultados representativos de la mansedumbre en figura 4se muestran las pruebas para los grupos seleccionados y no seleccionados de ratones en^{la generación 15 (G15)} . Ratones de grupo puntuaron más en la prueba de mansedumbre activo, exhibiendo una duración signifi...

Discusión

Resultados representativos cubren nueve índices de comportamiento de la mansedumbre activa pasiva mansedumbre y pruebas de estancia-la-mano. Una comparación de las puntuaciones entre el seleccionado y los grupos de control revelaron claras diferencias en mansedumbre. Estos resultados muestran que las tres pruebas son válidas para medir la mansedumbre en ratones.

Niveles de mansedumbre en los animales pueden ser difíciles de cuantificar empíricamente. Varios métodos han sido desarrollados para ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
aparato de campo abierto	O' Hara & Co. Ltd.	OF-3102	400 veces; 400 veces; Cámara digital compacta de 400 mm, cloruro de polivinilo grisáceo
	Ricoh Company, Ltd.	La producción de CX-5	en la empresa se ha realizado sobre
guantes puros de látex	AS ONE	BioLab, IKG-8002
cronómetro	SEIKO	SSBJ018
Desinfectante de yodophor	Ecolab G.K. (CLEA Japón)	CL-4123	Mikro Klene