Identificación y aislamiento de Oligopotent y linaje comprometido progenitores mieloides de la médula ósea de ratón

Summary

Demostramos cómo identificar y aislar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de médula murine usando una combinación de magnético y fluorescencia clasificación (MACS y FACS). Este protocolo puede ser utilizado para RNA/proteína análisis, experimentos de transferencia adoptiva en vivo y en vitro ensayos de cultura (culturas de la pastilla o líquido).

Abstract

Progenitores mieloides que neutrófilos, monocitos y células dendríticas (DCs) pueden ser identificados en y aisladas de la médula ósea de ratones para análisis hematológicos e inmunológicos. Por ejemplo, estudios de las propiedades celulares y moleculares de las poblaciones progenitoras mieloides pueden revelar mecanismos subyacentes a la transformación leucémica, o demostrar cómo el sistema inmune responde a la exposición del patógeno. Previamente estrategias de citometría de flujo se describe para la identificación del progenitor mieloide han permitido avances significativos en muchos campos, pero las fracciones que se identifican son muy heterogéneas. Las estrategias más frecuentemente usadas bloquea definen fracciones de médula ósea que están enriquecidos para la población deseada, pero también contienen grandes cantidades de progenitores de "contaminar". Nuestros estudios recientes han resuelto gran parte de esta heterogeneidad y el protocolo que presentamos permite el aislamiento de 6 subpoblaciones de oligopotent y progenitores mieloides linaje comprometido de 2 describen anteriormente fracciones de médula ósea. El protocolo describe 3 etapas: 1) aislamiento de médula células, 2) enriquecimiento de progenitores hematopoyéticos por célula activada por el magnético clasificación (agotamiento del linaje por Mac) y 3) la identificación de subconjuntos del progenitor mieloide mediante citometría de flujo (incluyendo fluorescencia activada célula clasificación, FACS, si lo desea). Este enfoque permite la cuantificación de la progenitora y el aislamiento para una variedad de aplicaciones in vitro e in vivo y ya ha dado nuevo penetración en las vías y mecanismos de neutrófilos, monocitos y la diferenciación de DC.

Introduction

Monocitos, neutrófilos y células dendríticas (DCs) son células mieloides que provienen de progenitores hematopoyéticos, principalmente en la médula ósea, por un proceso llamado mielopoyesis. Progenitores mieloides comunes (CMPs) tienen el potencial para producir células mieloides, así como megacariocitos y eritrocitos, pero las células no linfoides. Progenitores de granulocitos-monocitos (BPF), que se derivan de los CMPs, producen granulocitos y monocitos, pero han perdido megakaryocyte y el potencial del eritrocito. Monocitos y clásica y plasmacytoid DCs (CDC/PDC) también se piensan para presentarse de progenitores comunes conocidos como progenitores de monocito DC (MDPs), que son producidos por CMPs. Gradual restricción potencial del linaje que finalmente se traduce en linaje comprometido progenitores: progenitores de granulocitos, monocito progenitores y progenitoras de células dendríticas (figura 1).

Weissman y sus colegas informaron que los CMPs se encuentran en Lin^– c-Kit⁺ Sca-1^– CD34 (LKS^–)⁺ FcγR^lo fracción de médula ósea de ratón, mientras que las prácticas correctas de fabricación están contenidos en el CD34 LKS^{– +} FcγR ^Hola fracción¹. Sin embargo, estas fracciones "CMP" y "GMP" son muy heterogéneas. Por ejemplo, la fracción de "GMP" también contiene progenitores comprometidos linaje granulocito monocito progenitores y^1,2. MDPs se informaron por separado que CX3CR1⁺ Flt3⁺ CD115⁺ progenitores que también expresan CD34 y FcγR^3,4. MDPs dan lugar a cDC/pDC-producción común DC progenitores (CDP), que se han divulgado para expresar niveles más bajos de c-Kit (CD117) y no están incluidos en la fracción LKS^{– 5}.

Previamente, fue asumido que los monocitos surgen a través de una sola vía (CMP-GMP-MDP-monocito). Consistente con este modelo, cometidos por el monocito progenitores producida por prácticas correctas de fabricación (nombre de progenitores de monocitos, MPs)² y MDPs (nombradas de progenitores comunes de monocitos, cMoPs)⁶ parecen ser las células del mismo en base a la expresión del marcador de superficie compartido . Sin embargo, nosotros recientemente demostró que los monocitos son producidos independientemente por GMPs y MDPs y fueron capaces de distinguir entre el MPs y el cMoPs unicelular RNA la secuencia⁷.

Recientemente modificamos la estrategia bloquea "GMP" y Weissman "CMP" para identificar 6 subfracciones de médula de ratón C57BL/6J que contiene diferentes oligopotent y subconjuntos de progenitor mieloide linaje comprometido. Primero nos informan que la coloración de Ly6C y CD115 permite el aislamiento de oligopotent correctas, como progenitores de granulocitos (GPs) y progenitores de monocitos (MPs y cMoPs, que actualmente no podemos separar) del "GMP" fracción² (LKS ^- CD34⁺ FcγR^Hola puerta; Figura 1). Posteriormente demostró que MDPs se encuentran predominantemente en la fracción "CMP" (CD34 LKS^{– + lo} puerta de FcγR), que también contiene Flt3⁺ CD115^lo y Flt3^– subconjuntos⁷ (figura 1 ). El CMP-Flt3⁺ CD115^lo fracción rinde GMPs y MDPs sobre transferencia adoptiva. El CMP-^– de Flt3 subconjunto contiene progenitores que parecen intermedios entre CD115 CMP-Flt3^{+ lo} y las células correctas. A diferencia de MDPs, CD115 CMP-Flt3^{+ lo} tanto fracciones de CMP-Flt3^– también poseen megakaryocyte y el potencial del eritrocito.

Es importante señalar, sin embargo, que no está actualmente claro si las fracciones "CMP" contienen progenitores que son realmente oligopotent (por ejemplo, las células individuales en el CMP-Flt3⁺ CD115^lo fracción que poseen del neutrófilo, monocito DC, megacariocitos y eritrocito potencial), o alternativamente, comprenden una mezcla de progenitores con potencial más restringido de linaje. Formadoras de ensayos (culturas de metilcelulosa) revelaron las células con granulocitos (neutrófilos), eritrocitos, monocitos y potencial de megacariocitos (células GEMM) en la "AMC", CMP-⁺ CD115^lo de Flt3 y fracciones de CMP-Flt3^{– 1 ,7}, pero no permiten la evaluación del potencial de DC. En cambio, formadoras de ensayos demostraron la existencia de oligopotent correctas (progenitores con recuento de neutrófilos y monocitos potencial) en el "GMP" fracción^1,2, y esto es apoyado por recientes unicelular de análisis transcriptómico⁸. No se actualmente sabe, sin embargo, si estos oligopotent BPF también produce otros granulocitos (eosinófilos, basófilos y mastocitos).

Basado en estos estudios, ahora demostramos cómo 7 superficie marcadores (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C y CD115) puede utilizarse para identificar y aislar estos 6 subconjuntos de oligopotent y de progenitores mieloides linaje comprometido. El protocolo descrito aquí puede ser aplicado para en vitro ensayos de cultura (culturas de la pastilla o líquido), en vivo experimentos transferencia adoptiva en ratones y el análisis molecular (secuencia de RNA a granel y unicelular, Western blotting, etc.).

El protocolo consta de 3 etapas: 1) preparación de una suspensión unicelular de la médula ósea las células, 2) enriquecimiento de progenitores hematopoyéticos (clasificación celular activada por el magnético) y 3) la identificación y aislamiento si lo desea, de subconjuntos del progenitor por flujo Citometría (mediante un analizador o un clasificador, según sea el caso). El primer paso es el aislamiento de las células de la médula ósea de los fémures y tibias de ratones eutanasia y es similar a otros protocolos previamente descritos⁹. A continuación, la muestra es enriquecida de células madre y progenitoras utilizando un cóctel de anticuerpos contra los marcadores de superficie celular de los eritrocitos, neutrófilos, monocitos, linfocitos, etc., para agotar las células diferenciadas. Esto no es obligatorio, pero se recomienda fuertemente para optimizar la detección de los subconjuntos de la progenitora y a reducir la cantidad de anticuerpos necesarios para la identificación del progenitor y el tiempo necesario para citometría de flujo. El protocolo de agotamiento del linaje más abajo describe Magnetic-Activated celular clasificación (MACS) usando un ratón linaje celular agotamiento Kit (que contiene anticuerpos biotinilados contra CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4 y Ter-119, más anti-biotina microesferas) y un separador magnético automatizado. El paso final es la identificación (y ordenar, si lo desea) de los subconjuntos de progenitoras por citometria de flujo. El panel de anticuerpos se describe a continuación (ver también tabla 1) ha sido diseñado para ser utilizado en un citómetro de flujo (analizador o clasificador) con 4 rayos láser (405 nanómetro, 488 nanómetro, 561 nm, 640 nm).

Figura 1: vías de diferenciación y progenitores de neutrófilos, monocitos y DC. El modelo recientemente revisado de mielopoyesis⁷ se ilustra, con las puertas de Weissman "CMP" (azul) y "Correctas" (verde)¹ overlaid. Esta figura ha sido modificada desde Yáñez et al. 2017⁷. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

Todos los métodos aquí descritos fueron aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de Cedars-Sinai Medical Center.

1. aislamiento de médula ósea de ratón y la preparación de una suspensión unicelular

1. Eutanasia el ratón según las directrices.
2. Coloque el ratón sacrificaron a sus espaldas y rociar con 70% de etanol (EtOH). Hacer una incisión pequeña (3-5 mm) en cada miembro trasero en el tobillo nivel usando afiladas, tijeras puntiagudas y tire la piel hacia arriba hacia el cuerpo para eliminar de las piernas y exponer los músculos y los huesos.
3. Quitar los músculos (cuádriceps, isquiotibiales, etc.) de los huesos por recortar con tijeras, siguiendo la dirección del hueso. Tenga cuidado de no dañar los huesos.
4. Dislocar el fémur de la cadera y corte el tejido conectivo y músculo para soltar las piernas, teniendo cuidado de no cortar los huesos.
5. Retire los pies por dislocar los tobillos de la tibia, colocar los huesos en un tubo estéril PBS o los medios de comunicación y transporte en hielo a la sala de cultivo de tejidos.
   Nota: Para algunas aplicaciones (por ejemplo, derivadas de los macrófagos de médula ósea total) es posible dejar los huesos en el hielo durante un tiempo, pero para el aislamiento del progenitor es importante proceder lo más rápidamente posible para evitar downregulation de marcadores de superficie importantes (especialmente CD115).
6. En un gabinete de bioseguridad, quitar cualquier tejido blando restante de los huesos por frotamiento con papel de seda.
   Nota: El protocolo debe realizarse en un gabinete de bioseguridad si una muestra estéril se requiere de estudios de cultura o en vivo de células después de su clasificación de FACS. Si no tienen células estériles, todo el proceso se puede realizar en el Banco de laboratorio.
7. Sumerja brevemente los huesos en el 70% EtOH para la desinfección de ellos y luego en PBS estéril para lavarlos.
8. Separar el fémur de las tibias y peronés cortando a través de la rodilla y deseche los peronés.
9. Corte los extremos de los huesos con unas tijeras afiladas.
10. Cosecha de la médula con PBS estéril fría como sigue hasta que los huesos aparecen blancos:
    1. Agarre cada hueso con pinzas y coloque una aguja de 26G conectada a una jeringa de 10 mL con PBS estéril fría en el eje del hueso en un extremo.
    2. Sostenga el hueso por encima de un tubo de centrífuga de 50 mL y lavar 2-5 mL de PBS a través del hueso para la cosecha de la médula.
    3. La médula de los 4 huesos por ratón (2 fémures y 2 tibias) de la cosecha.
11. ¡Pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1 mL a la desagregación de la médula ósea para formar una suspensión.
12. Filtrar la suspensión de la médula ósea a través de un pedazo de malla de nylon de 30 μm para eliminar piezas de hueso y agregados, generando una suspensión unicelular de células.
13. Centrifugar la suspensión unicelular a 280 x g por 5 min y resuspender el precipitado de células en solución tampón de tinción estéril (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA), usando 5 mL de buffer por ratón (por ejemplo, 10 mL para las células de los fémures y tibias de 2 ratones) la coloración.
14. Tomar 10 μL alícuota de la muestra, mezclar con 10 μL azul de tripán y carga 10 μL de la muestra marcada con azul de tripán resultante en un hemocitómetro. Contar las células utilizando un microscopio de luz.
    Nota: Si las células son demasiado concentradas para conteo confiable, diluir la muestra antes de la adición de azul de tripano.

2. progenitor enriquecimiento por célula activada por el magnético clasificación (MACS)

1. Centrifugue la suspensión de toda la célula individual (o tantas células como están obligadas a obtener el rendimiento deseado) a 280 x g durante 5 min a 4° C y resuspender el pellet celular en 40 μL tampón (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA) por 10⁷ células de tinción.
   Nota: También es posible utilizar tampón MACS del fabricante del kit del agotamiento del linaje (véase Tabla de materiales) como una alternativa para el tampón de tinción.
2. Realizar el agotamiento de linaje según las instrucciones suministradas con el kit de agotamiento de linaje. Las instrucciones siguientes son para el juego visto en la Tabla de materiales. Si se utiliza un equipo diferente, siga las instrucciones del fabricante y luego continúe con el paso 2.3.
   1. Añadir 10 μL biotina anticuerpo cóctel por 10⁷ células, mezclar mediante pipeteo e incubar 10 min a 4 ° C.
   2. Añadir 30 μL tampón/MACS la coloración buffer por 10⁷ células y mezclar.
   3. Añadir 20 μL anti-biotina microesferas por 10⁷ células. Mezclar bien e incubar un adicional 15 min a 4 ° C.
      Nota: Vórtice microbeads antes de agregar a las células para asegurarse de que están totalmente dispersas.
   4. Añadir 1 mL de tampón buffer/MACS por 10⁷ células de tinción, centrifugar las células a 280 x g por 5 min y resuspender el pellet celular en 500 μL tampón/MACS tinción para células de⁸ hasta 10. Para más de 10⁸ células, aumentar el volumen de tampón buffer/MACS de tinción por consiguiente.
   5. Preparar el separador magnético automatizado según las instrucciones del fabricante.
   6. Coloque el tubo que contiene las células etiquetadas en el separador y elegir el programa de selección negativa.
   7. Recoger la fracción negativa, que contiene las células progenitoras enriquecido linaje negativo (Lin^–). Desechar la fracción positiva, que contiene las células de linaje-positivos marcados magnéticamente.
3. Lin^– las células de 280 x g durante 5 min, de centrifugar y resuspender el precipitado de células en 2 mL de tampón buffer/MACS por ratón (por ejemplo, 4 mL si la médula se agruparon de 2 ratones) la coloración.
   Nota: El pellet debe ahora ser blanco en vez de rojo porque los eritrocitos se han agotado.
4. Tomar 10 μL alícuota de las células de Lin^– , mezclar con 10 μL azul de tripán y carga 10 μL de la muestra marcada con azul de tripán resultante en un hemocitómetro. Contar las células utilizando un microscopio de luz.
   Nota: Si las células son demasiado concentradas para conteo confiable, diluir la muestra antes de la adición de azul de tripano.

3. mieloides progenitoras identificación y aislamiento de células activado por fluorescencia (FACS) de clasificación

1. Etiqueta 9 tubos de microcentrífuga (1.5 ó 2 mL) para: 1) sin mancha las células, 2-8) solo de células teñidas con anticuerpos conjugados fluoróforo contra FcγR (CD16/32), c-Kit, Sca-1, CD34, Flt3 (CD135), Ly6C y CD115 para compensación de color y selección de la tensión y 9) células de la muestra a teñir con 7 anticuerpos todo progenitor identificación y clasificación.
2. Distribuir 100.000 células a cada uno de los tubos de control (tubos 1-8) y todas las células restantes (o menos si se desea) al muestra tubo (9).
   Nota: Si el volumen de muestra es mayor de 1.5-2 mL, puede ser necesario distribuir las células de la muestra en un tubo de 15 mL, centrifugarlos Resuspender el precipitado (paso 3.3 a continuación) y luego se transfieren las células a un tubo de microcentrífuga para los posteriores pasos de tinción.
3. Centrifugar las células a 1.500 x g durante 5 min y volver a suspender los pellets de tubo control en 100 μL tampón (PBS + 0,5% FBS + 2 mM EDTA) y el sedimento del tubo de muestra en 100 μL de tinción tinción buffer por 5 x 10⁶ células (por ejemplo, 200 μL de células 1 x 10⁷ ).
4. Añadir 2 μg/mL anti-CD16/CD32-APC-Cy7 FcγR mancha solo tubo y el tubo de muestra. Vórtice suavemente para mezclar e incubar 10 min a 4 ° C.
   Nota: Es importante teñir las células de la muestra con el anticuerpo FcγR (CD16/32) antes de añadir los otros anticuerpos para evitar la competencia debido a la Unión de anticuerpos Fc-mediada no específicos. No incubar las células con un FcγR bloqueo reactivo.
5. Añadir los otros anticuerpos a los tubos correspondientes de tinción simple (1 anticuerpo) y el tubo de muestra (todos 6 anticuerpos): 10 μg/mL c-Kit-Pacífico azul, Sca-1-PE-Cy7 de 2 μg/mL, 25 μg/mL CD34-FITC, 10 μg/mL Flt3-APC, 2 μg/mL Ly6C-PerCP-Cy5.5 y 4 μg/mL CD115-PE. Vortex e incubar por 15 min a 4 ° C.
6. Añadir 900 tampón de tinción μL a los tubos de control y 1 mL de tampón de tinción por 10⁷ células en el tubo de muestra. Centrifugar las células a 1.500 x g durante 5 minutos y resuspender el pellet celular en tampón de tinción: 200 μL por tubo de control y 500 μL por 25 x 10⁶ células en el tubo de muestra. Transferir las células resuspendidas a tubos de 5 mL FACS.
   Nota: Si el volumen de muestra es mayor de 1.5-2 mL, puede ser necesario transferir las células a un tubo de 15 mL para centrifugación.
7. Preparar el citómetro de flujo (analizador o clasificador) según las instrucciones del fabricante.
8. Ejecute sin manchas y solo manchado las células del control por el citómetro de flujo para establecer las tensiones y compensaciones de color.
9. Funcionamiento de las células de la muestra, los subconjuntos del progenitor como se describe a continuación y resumidas en la figura 2de la puerta y si lo desea, realizar FACS clasificación para aislar los subconjuntos relevantes del progenitor.
   Nota: Es típicamente necesario adquirir aproximadamente 200.000 células para obtener al menos 1.000 eventos en cada puerta del progenitor.
   1. Crear un diagrama de punto de todas las células, mostrando la FSC-A (eje x) y el SSC-A (eje y) y para excluir los desechos y células muertas de la puerta = > "viven" las células.
   2. Crear un diagrama de punto de células "vivas", mostrando FSC-H (eje x) y FSC-W (eje y) y la puerta para excluir dobletes = > puerta de vivir/camiseta (FSC).
   3. Crear un diagrama de punto de vivir/camiseta (FSC) células, mostrando SSC-H (eje x) y SSC-W (eje y) y la puerta para excluir dobletes = > vivir/camiseta (FSC) / puerta de camiseta (SSC).
   4. Crear un diagrama de punto de vivir/camiseta (FSC) / células de camiseta (SSC), visualización de Sca-1 (eje x) y c-Kit (eje y) y la puerta para seleccionar c-Kit⁺ Sca-1^– células = > células LKS^– .
   5. Crear un diagrama de punto de células LKS^– , mostrando CD34 (eje x) y FcγR (eje y) y puerta para seleccionar CD34⁺ FcγR^lo células = > "CMP" y CD34⁺ FcγR^Hola células = > "Correctas".
      Nota: Es importante el "CMP" y "GMPs" como precisamente la puerta como sea posible. Es útil utilizar un diagrama de densidad de pseudocolor o una trama de contorno para la sincronización exacta.
   6. Crear un diagrama de punto de "CMP", mostrando CD115 (eje x) y Flt3 (eje y) y la puerta para seleccionar:
      Flt3⁺ CD115^lo células = > ⁺ CMP-Flt3 CD115^lo las células,
      Flt3^– CD115^lo células = > CMP -^– de Flt3 de células,
      Flt3⁺ CD115^Hola células = > MDPs.
   7. Crear un diagrama de punto de "Correctas", mostrando Ly6C (eje x) y FcγR (eje y) y puerta para seleccionar Ly6C células^–= > "GMP-Ly6C^– células" y Ly6C⁺ células = > "GMP-Ly6C⁺ células".
   8. Crear un diagrama de punto de "Células de GMP-Ly6C^– ", mostrando CD115 (eje x) y Flt3 (eje y) y la puerta para seleccionar:
      Flt3^– CD115^lo células = > GMPs.
   9. Crear un diagrama de punto de "Células de GMP-Ly6C⁺ ", mostrando CD115 (eje x) y Flt3 (eje y) y la puerta para seleccionar:
      Flt3^– CD115^lo células = > GPs,
      Flt3^– CD115^Hola células = > MPs + cMoPs.

Results

Utilizando el protocolo descrito anteriormente, es posible obtener células 100 millones (incluyendo células de sangre rojas, o 50 millones de células nucleadas) de fémur y tibia (2 patas) de un ratón C57BL/6J (6-8 semanas edad, hombres o mujeres). 1-2 millones Lin^– células pueden ser aisladas por ratón por agotamiento de MACS de células Lin⁺ .

Cada uno de los subconjuntos de progenitor mieloide 6 constituye...

Discussion

Weissman gating estrategia para ratón progenitor mieloide identificación¹ ha sido el estándar de oro para los inmunólogos y hematólogos durante casi 20 años, pero ahora es evidente que las puertas "CMP" y "GMP" son muy heterogéneas y más precisa se necesitan estrategias bloquea. El protocolo que hemos descrito aquí permite la identificación de oligopotent y subconjuntos linaje comprometido en ratones C57BL/6J más precisa cuantificación de progenitores mieloides específicos y asignación de las vías...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ratón: Tipo salvaje C57BL/6J (CD45.2)	The Jackson Laboratories	Cat#JAX:000664
Lineage Cell Depletion Kit, ratón	Miltenyi Biotec	Cat#130-090-858
Rata anti-ratón CD34 (clon RAM34) FITC	BD Biosciences	Cat#553733
Rata anti-ratón CD16/CD32 (Fcγ R; clon 93) APC-Cy7	BioLegend	Gato#101327
Rata anti-ratón Ly6A/E (Sca-1; clon 108113) PE-Cy7	BioLegend	Gato#108114
Rata anti-ratón CD117 (c-Kit; clon 2B8) Azul Pacífico	BioLegend	Gato#105820
Rata anti-ratón Ly6C (clon HK1.4) PerCP-Cy5.5	BioLegend	Gato#128012
Rata anti-ratón CD115 (clon AFS98) PE	BioLegend	Gato#135506
Rata anti-ratón CD135 (Flt3; clon A2F10.1) APC	BD Biosciences	Cat#560718
CountBright Cuentas de conteo absolutas	Thermo Fisher Scientific	Cat#C36950
Separador AutoMACS	Miltenyi Biotec	N/A	Utilice el programa "deplete"
BD LSRFortessa	BD Biosciences	N/A	5 láseres, 15 colores
Clasificadora de células BD FACS Aria III	BD Biosciences	N/A	5 láseres, 13 colores
FlowJo	FlowJo, LLC	https://www.flowjo.com	Para un análisis más detallado de los archivos .fcs