Aquí, presentamos un protocolo para determinar cuantitativamente el contenido de ficobiliproteína en la cianobacteria Synechocystis mediante un método espectrofotométrico. El procedimiento de extracción fue aplicado con éxito a otras cepas de cianobacterias y algas; sin embargo, debido a variaciones en los espectros de absorción del pigmento, es necesario probar las ecuaciones espectrofotométricas para cada cepa individual.
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Artículo de método
Determinación espectrofotométrica de ficobiliproteína contenido en la cianobacteria Synechocystis
En este artículo
Resumen
Resumen
Esto es un protocolo simple para la determinación cuantitativa del contenido de ficobiliproteína en la cianobacteria Synechocystisdel modelo. Ficobiliproteínas son los componentes más importantes de phycobilisomes, las antenas principales de recolección de luz en cianobacterias y varios taxones de algas. Phycobilisomes de Synechocystis contienen dos ficobiliproteínas: ficocianina y allophycocyanin. Este protocolo describe un simple, eficiente y confiable método para la determinación cuantitativa de ficocianina y allophycocyanin en esta cianobacteria modelo. Se compararon varios métodos de extracción de ficobiliproteína y cuantificación espectrofotométrica. El procedimiento de extracción como se describe en este protocolo se aplicó con éxito a otras cepas de cianobacterias como Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., y Nostoc SP., así como las algas rojas Porphyridium cruentum. Sin embargo, los coeficientes de extinción de ficobiliproteínas específicos de distintos taxones pueden variar y por lo tanto, se recomienda validar el método de cuantificación espectrofotométrica para cada cepa individual. El protocolo requiere poco tiempo y puede realizarse en cualquier laboratorio de Ciencias de la vida estándar ya que requiere equipos estándar.
Introducción
fPhycobiliproteins son complejos de proteína pigmento soluble en agua que representan los componentes principales de las antenas de luz-cosechar en procariotas cianobacterias (Cyanophyta) y varios taxones eucariotas (Glaucophyta, Rhodophyta y Cryptophyta)1. Se producen principalmente como complejos supramoleculares llamados phycobilisomes y por lo general se unen a la superficie de las membranas fotosintéticas en el lado del estroma, a excepción de Cryptophyta, donde se localizan las ficobiliproteínas en la tilacoides lumen2. Hasta la fecha se han identificado cuatro tipos de ....
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Protocolo
1. cianobacterias cultivo
- Cultivar células de Synechocystis en matraces Erlenmeyer o en fotobiorreactores10,19 en tampón BG11 medio20 a mantener un pH < 10 (p. ej., con 17 mM HEPES10).
Nota: Las condiciones de cultivo estándar requieren una temperatura controlada (normalmente, 30 ° C, la temperatura óptima es de 35 ° C)21, iluminación (por lo general, una luz blanca de intensidad hasta 800 μmol [fotones] / [m2·s])21y un CO fuente 2 (en el fotobiorreactor d....
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Resultados
Para las pruebas del método inicial, Synechocystis fue cultivado como culturas lote en matraces Erlenmeyer en una coctelera en BG11 cultivo medio20 (complementado con 17 mM HEPES) a 25 ° C, bajo una luz blanca cálida de una intensidad de 50 μmol (fotones) / (m 2·s) y con 1% de CO2 en la atmósfera de cultivo. Durante el cultivo, los cultivos fueron muestreados a los tubos safe-lock y centrifugaron (15.000 x g a temperatura de .......
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Discusión
Este protocolo describe un método sencillo, rápido y reproducible para la cuantificación del contenido de ficobiliproteína en la cianobacteria Synechocystisdel modelo. Se comparan varios métodos de homogeneización de la célula, extracción de proteínas y cuantificación de ficocianina y allophycocyanin y el protocolo final representa una combinación de lo óptimo de cada procedimiento individual. Como datos representativos, se cuantificó el contenido de ficobiliproteínas en Synechocystis células cada vez m.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El protocolo fue adoptado de una anterior publicación11. T. Z., CH. D. y J. Č. fueron apoyados por el Ministerio de educación, juventud y deportes de la República Checa en el programa nacional de sustentabilidad (NPU I), concesión número LO1415. J. Č. también fue apoyada por el GA CR, número 18-24397S. Acceso a los instrumentos y otras instalaciones fue apoyado por la infraestructura de investigación Checa para Biología de sistemas C4SYS (no proyecto LM2015055). M. A. S. fue apoyado por una beca de la Fundación de la ciencia rusa [no. 14-14-00904].
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Synechocystis sp. PCC 6803 | Institut Pasteur, París, Francia | 6803 | Cepa de cianobacteria |
| Roti-CELL PBS | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania | 9143.1 | Solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.4 |
| Tubos de bloqueo seguro Eppendorf | Eppendorf, Hamburk, Alemania | 30120086 | Tubos con cierre de seguridad 1,5 ml |
| Sistema de almacenamiento de 80 plazas | VWR VWR International, Radnor, Pensilvania, EE. UU | 30128-282 | Soporte para tubos con cierre de seguridad |
| RAININ 100 µ l -1000 y micro; l | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, EE. UU. | 17014382 | Pipeta |
| GP-LTS-A-1000µ L-/F-768/8 | Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, EE. UU. | 30389272 | Puntas de pipeta |
| Rotina 420R | Hettich, Kirchlengern, Alemania | 4701 | Centrífuga refrigerada para tubos de cierre seguro de 1,5 ml y tubos de centrífuga cónicos de 15 ml |
| LCexv 4010 | Liebherr, Bulle, Suiza | 9005382197172 | Refrigerador y congelador -20 ° C |
| Revco ExF -86° C Congelador vertical de temperatura ultrabaja | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU | . EXF24086V | Congelador -80 ° C |
| CoolSafe | LaboGene, Liller ø d, Dinamarca | 7.001.000.615 | Liofilizador |
| UV-2600 | Shimadzu, Kioto, Japón | UV-2600 | |
| Cubetas de absorción Hellma, semi Micro | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU | . Z600288 | Cubetas semimicro VIS/UV-VIS 0,75-1,5 ml, rango espectral 200-2500 nm |
| Silamat S6 | Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein | 602286WU | Homogeneizador |
| Perlas de vidrio macizo | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU | Z273627 | Perlas de vidrio de diámetro 2 mm |
| CPA225D-0CE | Sartorius AG, Gö ttingen, Alemania | SECURA225D-1OBR | Balanzas analíticas |
| C-Ficocianina de Spirulina sp. | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU. | P2172 | Estándar de ficocianina |
| Aloficocianina | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU. | A7472 | estándar de aloficocianina |
| Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU. | BCA1, B9643 | Kit completo para la determinación de proteínas totales | |
| AlgaeTron | Photon System Instruments Ltd., Drá sov, República Checa | AG 130-ECO | Cámara de cultivo de matraces E., con luz y atmósfera controlables |
| Fotobiorreactor | Photon System Instruments Ltd., Drá sov, República Checa | FMT-150 | Equipo de cultivo para cianobacterias y algas con entorno completamente controlable |
| Celómetro | Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, EE. UU. | Auto M10 | Contador de celdas |
| Corning Tubos de centrífuga de 15 ml | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU | . CLS430791 | Tubo de centrífuga de 15 ml para la toma de muestras de peso seco |
| Herasafe KS | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU. | 51024579 | Campana de flujo laminar |
Referencias
- Mimuro, M., Kikuchi, H. Antenna Systems and Energy Transfer in Cyanophyta and Rhodophyta. Light-Harvesting Antennas in Photosynthesis. Green, B. R., Parson, W. W. , Springer. Dordrecht, The Netherlands. 281-306 (2003).
- Spear-bernstein, L., Miller, K. R. Unique location of the phycobiliprotein light-harvesting pigment in the Cryptophyceae. Journal of Phycology. 25 (3), 412-419 (1989). ....
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Reimpresiones y permisos
