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Artículo de método

Perfil de compatibilidad biológica de Biomateriales para regeneración ósea

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DOI:

10.3791/58077

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16 de noviembre de 2018

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1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Vienna, 2Laboratory of Experimental Allergy, Division of Immunology, Allergy and Infectious Diseases, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

En este artículo

Resumen

El número de nuevos biomateriales ingeniería para reparar las lesiones del hueso grande está en continua expansión con el objetivo de acelerar la cicatrización ósea y superar las complicaciones asociadas con el trasplante de hueso. Aquí, presentamos una estrategia multidisciplinaria para las pruebas de biocompatibilidad preclínico de Biomateriales para la reparación de hueso.

Resumen

Fracturas del hueso grande de la Unión no son un reto importante en cirugía ortopédica. Aunque auto e injertos óseos Alogénicos son excelentes para la curación de estas lesiones, existen posibles complicaciones con su uso. Así, materiales científicos están desarrollando biomateriales sintéticos, biocompatibles para superar estos problemas. En este estudio, presentamos una plataforma multidisciplinar para la evaluación de Biomateriales para la reparación de hueso. Combinamos conocimientos de Biología ósea y de la inmunología para desarrollar una plataforma como en vitro de los osteoclastos (OC) y osteoblastos (OB) ensayos en vivo modelos de ratón de reparación ósea, inmunogenicidad y alergenicidad. Nos muestran cómo realizar los experimentos, resumir los resultados e informar sobre biocompatibilidad de los biomateriales. En particular, hemos probado OB viabilidad, diferenciación y mineralización y viabilidad OC y diferenciación en el contexto de los discos de β-tricálcico fosfato (β-TCP). También probamos una espuma de β-TCP/colágeno (β-TCP/C) que es un material disponible comercialmente utilizado clínicamente para la reparación ósea en un modelo de ratón de defecto hueso calvarial tamaño crítico para determinar los efectos en la fase temprana de la curación del hueso. En experimentos paralelos, se evaluaron las respuestas inmunes y alérgicas en ratones. Nuestro enfoque genera un perfil de compatibilidad biológica de un biomaterial de hueso con una serie de parámetros necesarios para la predicción de la biocompatibilidad de los biomateriales utilizados para la curación del hueso y la reparación en pacientes.

Introducción

Reparación ósea es un proceso complejo que comienza con la formación de hematoma, inflamación, formación y remodelación luego1,2de callos. Sin embargo, potencial de la regeneración ósea se limita al tamaño de la fractura ósea1,3. Por ejemplo, las fracturas del hueso grande causadas por trauma, cáncer u osteoporosis no pueden curar y se denominan fracturas sin unión. Estas lesiones del hueso a menudo requieren tratamiento para promover la regeneración y reparación ósea fisiológica sana. Actualmente, el trasplante de autoinjerto y aloinjerto óseo es el enfoque de opción4 con procedimientos de reemplazo de hueso 2,2 millones anualmente5. Aunque estos procedimientos tienen una alta tasa de éxito, puede haber complicaciones, por ejemplo, la disponibilidad limitada de hueso, la infección, la morbosidad del sitio donante y la rechazo4. Se buscan nuevas alternativas para la ingeniería de tejido óseo para enfrentar estos desafíos.

El diseño de biomateriales basados en polímeros naturales o sintéticos, biocerámica o metales en combinación con las células y moléculas bioactivas está en el lugar6. Nuestra comprensión actual del hueso fisiológico sanación y sanación en el contexto de biomateriales depende de múltiples factores tales como propiedades mecánicas y de múltiples factores locales y sistémicos, incluyendo las células de la circulación y el sitio de la fractura7 ,8,9. Biomateriales para regeneración ósea intentan promover osteogenicity y osteointegración10 y son idealmente biocompatible, biodegradable y poroso (promueve la migración celular, nutrientes y oxígeno). También necesitan ser lo suficientemente fuerte para soportar el sitio de la fractura para aliviar el dolor. Además, factores inflamatorios están obligados a iniciar el proceso de curación. Sin embargo, si el biomaterial induce inflamación excesiva y las respuestas alérgicas, esto podría limitar o inhibir el hueso curativo11,12. Por lo tanto, un enfoque interdisciplinario es necesario evaluar biomateriales desarrollados para la reparación de hueso.

En este estudio, presentamos una evaluación preclínica de los materiales representativos, 1) Orthovita Vitoss espuma que es un sustituto de injerto de hueso esponjoso disponible en el mercado compuesto por fosfato tricálcico se compone de β-tricálcico puro tamaño de nanómetros partículas de fosfato (β-TCP) y colágeno bovino tipo 1 (C) (espuma de β-TCP/C) y 2) discos de β-TCP. Aquí ilustramos pruebas de biocompatibilidad de los biomateriales con osteoblastos primarios (OB) y ensayos de los osteoclastos (OC), un modelo en vivo de la reparación de hueso, una evaluación inmunológica que en vitro proliferación de linfocitos T y producción de citoquinas y en vivo inmunogenicidad y alergenicidad, como previamente divulgados13.

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Protocolo

Los procedimientos se realizaron con ratones BALB/c siguiendo todas las pautas para el cuidado y uso de animales de laboratorio del Ministerio de educación, Ciencia e investigación austríaco y fueron aprobados por la Comisión de ética del Ministerio Austriaco de educación, ciencia y la investigación.

1. primario de ratón OB cultura

  1. Aislamiento de OB de calvaria ratón neonatal mediante digestión enzimática
    1. Eutanasia de cachorros neonatales de 1 – 2 días (60 en total) por decapitación y colocar las cabezas en una placa Petri estéril 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    2. Sostener la cabeza por la nuca del cuello y cortar la piel, con unas tijeras estériles. Haga una incisión en la bóveda craneal por lo que (aproximadamente 0.1-0.3 mm) con un par de tijeras que luego son insertados debajo de la bóveda en la parte posterior de la cabeza en la base del cráneo y corte a lo largo del borde calvarial lateralmente de atrás hacia adelante por encima de las orejas y luego encima e el puente nasal (figura 1).
    3. Incubar calvaria disecada con 8 mL de solución de digestión de filtro esterilizado (300 unidades/mL colagenasa tipo IV y 2.14 dispase unidades/mL II disuelven en medio esencial mínimo de α (α-MEM)) en un tubo cónico de 50 mL a 37 ° C durante 10 minutos en un incubador de agitación a 200 batidos / min.
    4. Eliminar el primer sobrenadante y repetir el procedimiento de digestión tres veces con 8 mL de solución de digestión. Recoger el sobrenadante que contiene las células después de cada paso de la digestión y agregar a un tubo cónico de 50 mL. Guarde el tubo cónico de 50 mL con las células en un baño de agua helada hasta que se complete el procedimiento de digestión (aproximadamente 40 min).
    5. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a 4 ° C, aspirar el sobrenadante (con una pipeta Pasteur conectada a una bomba de vacío) y resuspender en 40 mL de medio de crecimiento de hueso (BGM) que contiene α-MEM con 10% inactivado con calor suero bovino fetal (FBS) y 1% solución de penicilina-estreptomicina. Luego añadir 10 mL de la suspensión de células a 4 placas de cultivo de tejidos (10 cm).
    6. La cultura de las células a 37 ° C y 5% de CO2 hasta confluencia (2 – 3 días).
    7. En confluencia, el viejo medio de aspirar y lavar las placas de cultivo tisular una vez con PBS 1 x (37 ° C). Luego aspirar el PBS y añadir 2 mL de solución de tripsina 1 x que contienen 0.5% ácido de etilendiaminotetracético (EDTA) para cada placa de cultivo de tejidos de 10 cm.
    8. Incubar las placas de 4 cultura a 37 ° C y 5% de CO2 durante 5 minutos y luego verifique las placas con un microscopio de luz invertido para asegurar que las células están separadas del plástico. Luego transferir todo suspensiones celulares (total 8 mL) a un tubo cónico de 50 mL que contiene 10 mL de BGM fresco. Lave cada plato con 5 mL de BGM y transferencia al misma tubo cónico de 50 mL.
    9. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a 4 ° C, aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 16 mL de BGM fresco. Preparar 16 10 cm tejido cultura placas nuevas (División 1:4) que contiene 9 mL de BGM. Añadir 1 mL de la suspensión de células a cada plato.
    10. Repita los pasos 1.1.6. a 1.1.8.
    11. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a 4 ° C, aspirar el sobrenadante y resuspender en 10 mL de BGM fresco. Contar las células y la concentración de las células.
      Nota: Este procedimiento genera aproximadamente 7.5-8.3 x 105 células/pup.
    12. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 ° C, aspirar el sobrenadante y resuspender en medio que contiene 10% dimetil sulfóxido (DMSO), α-MEM 40% y 50% de congelación FBS. Transferir 1,5 mL de la suspensión celular para crioviales de 2 mL para un total de 2 x 106 células por vial.
    13. Flash congelar los frascos en nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo en un tanque de nitrógeno líquido. Uso de las células dentro de un año para funcionalidad completa. Utilice estos OBs primarios para evaluar la proliferación (paso 1.2), diferenciación (ensayos ALP: paso 1.4., 1.5.) y mineralización (paso 1.6.) en presencia de los biomateriales. Utilizar estas células para la maduración de los precursores derivados de médula ósea OC en co-cultivo (paso 2.3).
  2. Ensayo de proliferación de OB
    1. Incubar los discos de β-TCP de diámetro de 14 mm en 1 mL de BGM en una placa de cultivo de 24 pocillos suspensión a 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 h antes de agregar el principal OBS. uso estándar tejido placas de controles y placas para las muestras de biomaterial para suspensión evitar el accesorio de la célula al plástico.
    2. Aspirar el medio de incubación antes y luego resuspender primario de ratón OBs en BGM. Añadir 4.4 x 104 OBs/cm2 en los discos de β-TCP previamente incubado en una placa de cultivo de 24 pozos suspensión y para el grupo control, en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos (1 mL/pocillo). OBs se fije a la placa de cultivo de tejidos o biomaterial.
    3. Incubar durante 14 días a 37 ° C y 5% CO2. Durante el período de incubación, cambiar el medio cada 2-3 días y añadir 1 mL de BGM fresca a cada pocillo.
    4. Para evaluar la proliferación de OB, transferir los discos de β-TCP en los días 7 y 14 a nuevos pozos para excluir a las señales de las células cultivadas en la placa de cultivo de suspensión.
    5. Aspire el medio viejo, Añadir 0,5 mL de BGM (37 ° C) e incubar las placas durante 30 min a 37 ° C y 5% CO2. Luego añadir 55 μl de 10 x reactivo de proliferación celular (1:10 dilución) directamente en el bien de la cultura. Cortes, de preparar tres pozos que contiene 0,5 mL de BGM y 55 μl del reactivo de proliferación de células de 10 x. Incubar todas las placas durante 30 min a 37 ° C y 5% CO2.
    6. Retirar y transferir 150 μL del sobrenadante de cada pozo en una placa de 96 pozos negra y leer fluorescencia con excitación a 560 nm y emisión a 590 nm. Restar las lecturas en blanco de las lecturas de la muestra.
  3. Ensayos de diferenciación y mineralización de OB
    1. Incubar los discos de β-TCP de diámetro de 14 mm en 1 mL de BGM en una placa de cultivo de 24 pocillos suspensión a 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 h antes de añadir las placas de cultivo de tejido estándar OBS. uso de controles y placas para las muestras de biomaterial evitar suspensión accesorio de celular al plástico.
    2. Aspirar el medio de incubación antes y luego resuspender primario de ratón OBs en BGM. Añadir 8.8 x 104 OBs/cm2 en los discos de β-TCP previamente incubado en una placa de cultivo de 24 pozos suspensión y para el grupo control, en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos (1 mL/pocillo). OBs se fije a la placa de cultivo de tejido o la muestra de biomaterial.
    3. Reemplazar el BGM con 1 mL de medio de mineralización osteogénico (MM) que contiene BGM, 50 μg/mL de ácido ascórbico y β-glicerofosfato de 5 mM 24 h después de la adición de las OBs e incubar durante 14 días a 37 ° C y 5% CO2. Cambiar el medio cada 2-3 días con 1 mL de MM recién preparada para cada pozo.
  4. Diferenciación de OB por la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) de lysates de la célula
    1. Para medir la actividad ALP en el día 7 después de la adición de MM, aspirar el medio de cultivo de los pocillos y lavar con 1 mL de PBS estéril 1 x (37 ° C). Aspirar cuidadosamente el PBS para permitir que las células Unidas a permanecer en el cultivo de tejido plástico o biomaterial y la congelación de las placas a-80 ° C.
    2. Después de 24 h (o hasta 2 semanas), deshielo de la placa de cultivo de tejidos de control y placa de cultivo biomaterial suspensión a temperatura ambiente (RT) para prepararse para la lisis de OB. Para las muestras de biomaterial, transferencia de los discos de β-TCP en una placa de cultivo de suspensión nueva para excluir las células conectadas a la placa. Agregar 75 μl por pozo de 1 x de tampón de lisis celular a ambas placas. Agitar las placas durante 5 min en un agitador a 400 batidos por minuto.
    3. Transferir el lisado de células en un tubo de microcentrífuga de 0, 5 mL y centrifugar a 300 x g durante 6 min a temperatura ambiente para eliminar residuos. Añadir 50 μl del sobrenadante lisado celular muestra a una placa de 96 pozos negra y luego añadir 50 μl de una solución de 200 μm fosfato 6.8-difluoro-4-methylumbelliferyl (DiFMUP) fluorógenos sustrato disuelto en 2 x de buffer de la fosfatasa alcalina (pH 10) por pozo. Configurar dos pozos en blanco con 100 μl de una solución de 1:1 que contiene 2 x fosfatasa alcalina tampón y tampón de lisis de la célula de x 1.
    4. Preparar estándares de referencia de 8 con 100 μL/pozo con el 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) que van desde 0,5 hasta 200 μM disueltos en solución de 1:1 con buffer de lisis de la célula de x 1 y 2 buffer ALP x para generar una curva de referencia.
    5. Incube la placa negra a 37 ° C durante 15 minutos y luego lee la fluorescencia con excitación a 358 nm y emisión a 455 nm. Restar las lecturas en blanco de los patrones de referencia y lecturas de la muestra.
    6. Normalizar la actividad de la enzima ALP de los lysates de la célula a la cantidad total de proteína mediante un ensayo colorimétrico para la concentración de la proteína. Preparación de albúmina de suero bovino estándares de referencia de proteína (BSA) en un rango de 0.05 – 2,5 μg/μl disueltas en 1 x de tampón de lisis de la célula para generar una curva estándar.
    7. Preparar de los lysates de la célula de muestra y estándares de proteína BSA por duplicado. Añadir 5 μl de la célula de muestra lisada o 5 μl de proteína BSA estándar en una placa de 96 pocillos y luego añadir 25 μl del reactivo ' y 200 μL de reactivo B. conjunto a dos pozos en blanco con 5 μl de 1 x de tampón de lisis celular. Incubar las placas a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego leer la absorbancia a 690 nm. Restar las lecturas en blanco de los patrones de referencia y lecturas de la muestra.
  5. Diferenciación de OB evaluada por tinción de fosfatasa alcalina en cultivo celular
    1. Mancha de ALP en OBs cultivadas en el día 7 después de la adición de MM en una placa de cultivo de tejidos de control y el biomaterial en una placa de cultivo de suspensión.
    2. Aspire el medio de cultivo de los pozos y reemplazarlo con 0.5 mL de PBS 1 x (37 ° C). Aspire el PBS y fijar las células por incubación en 0,5 mL de formalina al 10% tamponado a temperatura ambiente durante 1 minuto.
    3. Aspire el formol 10% tamponado con una pipeta de un solo uso y añadir 0,5 mL de tampón de lavado (0.05% Tween20 en PBS 1 x).
    4. Disolver una tableta de sustrato 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitro azul de tetrazolio (NBT/BCIP) en 10 mL de agua ultrapura y agitar hasta que se disuelva completamente. La solución debe ser protegida de la luz y utilizada dentro de 2 h.
    5. Aspirar la solución de lavado y reemplace con 0,5 mL de solución de sustrato BCIP/NBT e incubar la placa a temperatura ambiente en oscuridad durante 10 minutos, aspirar la solución de tinción y reemplace con 0,5 mL de tampón de lavado.
    6. Transferencia de los discos de β-TCP manchada en un nuevo pozo y las placas manchadas de ALP la exploración con un escáner plano convencional para tinción de fosfatasa alcalina récord.
  6. Mineralización de OB evaluada por tinción con alizarina roja S (ARS)
    1. Aspirar el medio de cultivo de los pozos que contienen primarios OBs 14 días después de la adición de MM y enjuague dos veces con 0,5 mL de PBS 1 x a RT. aspirado del PBS y fijar las células añadiendo 0,5 mL de 10% formalina solución amortiguadora a temperatura ambiente durante 10 minutos.
    2. Aspirar el formol 10% tamponado con una pipeta de un solo uso y lavar dos veces con 0,5 mL de agua ultrapura.
    3. A las OBs fijadas, agregar 0,25 mL de solución de tinción de ARS de 40 mM (pH 4.2) disuelto en agua ultrapura e incubar la placa a temperatura ambiente durante 10 min en un agitador a 100 golpes/min.
    4. Aspire la solución de tinción con una pipeta de un solo uso y enjuague con 1 mL de agua ultrapura. Repetir este paso 5 – 10 veces para eliminar inespecíficas de tinción.
      Nota: La solución de lavado debe ser sin color.
    5. Aspire el agua ultrapura y añadir 1 mL de PBS frío. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 10 min en un agitador a 100 golpes/min.
    6. Aspire el PBS, transferir los discos manchados de β-TCP a un nuevo pozo y las placas de la exploración con un escáner plano para mineralización de registro.
    7. Añadir 0,25 mL de 10% solución de cloruro de cetilpiridinio e incubar la placa a temperatura ambiente durante 15 min en un agitador a 100 batidos por minuto para extraer el tinte de ARS.
    8. Transferir el sobrenadante a un tubo de 1.5 mL y centrifugar a 17.000 x g durante 5 min a TA.
    9. 10% solución de cloruro de cetilpiridinio para los extractos con una relación de dilución de 1:10 – 1:20 y añadir las muestras (300 μL) en una placa de 96 pocillos, incluyendo dos pozos en blanco que contiene sólo 10% de cloruro de cetilpiridinio.
    10. Preparar 7 estándares de referencia de ARS desde 4 hasta 400 μm diluyendo el ARS 40 mM coloración solución (pH 4.2) con 10% solución de cloruro de cetilpiridinio para generar una curva estándar.
    11. Añadir 300 μL del estándar de referencia por duplicado a la placa de 96 pocillos.
    12. Leer la absorbancia de las muestras, espacios en blanco y referencia a normas a 520 nm.
    13. Restar las lecturas en blanco de los patrones de referencia y lecturas de la muestra.

2. ratón OB-OC cocultivo para derivar OCs maduro

  1. Preparación y esterilización de láminas de hueso cortical bovino
    1. Limpie segmentos del hueso del tejido circundante y quite el hueso trabecular y la médula ósea.
    2. Seca el hueso a 50 ° C durante 24 h.
    3. Cortar el hueso en trozos más pequeños y cortar en rodajas (aproximadamente 300-350 μm de espesor) usando una baja velocidad sierra con hoja de diamante.
    4. Corta las rebanadas de 300-350 μm en discos cuadráticos (1 cm2).
    5. Para limpiar los discos de hueso (1 cm2), ponerlos en un frasco de cristal con llave y llenar con agua destilada. El frasco de cristal lleno de transferencia en un baño de ultrasonidos y someter a ultrasonidos de 5 minutos Repita este paso tres veces.
    6. Vierta el agua destilada, añadir etanol al 70% y someter a ultrasonidos durante 5 minutos.
    7. Quite el etanol al 70% y sustituir con etanol al 100%.
      Nota: Almacene las láminas de hueso en etanol 100% a 4 ° C hasta por 4 semanas.
    8. Irradiar los trozos de hueso con la luz UV durante 15 min a cada lado en condiciones estériles. Almacene las láminas de hueso esterilizado en una placa de cultivo estéril a temperatura ambiente hasta su uso posterior.
  2. Aislamiento de precursores de médula ósea OC
    1. Eutanasia a ratones BALB/c de 8 – 12 semanas viejo ingenuo usando una inyección intraperitoneal (i.p.) de una solución de 200 mg/kg ketamina y 24 mg/kg xilacina.
    2. Aislar a los precursores de la OC de la médula ósea de fémur de ratón y tibias.
    3. Quitar las patas con tijeras estériles desde el punto más cercano al cuerpo en la articulación de la cadera, corte las extremidades en las articulaciones de la rodilla y el tobillo y quitar el tejido blando con bisturí estéril y pinzas. Cortar las epífisis. Eliminar y suspender la médula con 1mL BGM en una Petri estéril de 6 cm con una aguja de 27G conectada a una jeringa de 1mL para obtener una suspensión celular.
    4. Añadir la suspensión de células a un tubo cónico de 50 mL, lavar el 6 cm caja de Petri con 5 mL de BGM y traslado al misma tubo cónico de 50 mL. Centrifugar a 350 x g a 4 ° C por 5 min resuspender las células en medio de la diferenciación de OC (DM) que contiene BGM, 1 nM 1,25-(OH)2-vitamina D3 y 1 μm de prostaglandina E2 (1 mL/pocillo).
      Nota: Un ratón BALB/c proporciona un número suficiente de los precursores OC para una placa de cultivo de 24 pozos.
  3. Preparación de la cultura Co ratón OB-OC con biomaterial
    1. Pre-incubar 14 mm diámetro β-TCP discos o rebanadas hueso bovino (1 cm2) en 1 mL de BGM en una placa de cultivo de 24 pocillos suspensión a 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 h antes de añadir las células.
      Nota: Rebanadas de hueso bovino son un grupo de control del sustrato fisiológico para el estudio de diferenciación de OC en presencia de biomateriales.
    2. Añadir 8.8 x 104 células/cm2 de primarias OBs suspendido en BGM en los biomateriales o el hueso de control en una placa de cultivo de 24 pozos suspensión o a una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Incubar a 37 ° C y 5% CO2 durante 24 h.
      Nota: OBs Coloque el plástico o el hueso biomaterial o bovino.
    3. Añadir recién aislado precursores de médula ósea OC a las 24 h cultivan primario OBs y cultivo a 37 ° C y 5% de CO2 durante 5 días. Reemplazar el medio con DM OC recién preparado todos los días. Entonces mancha OCs para fosfatasa ácida tartrato resistente (TRAP) para evaluar la diferenciación OC.
  4. Diferenciación de OC evaluada por tinción de trampa
    1. Para caracterizar la OCs multinucleated maduros, de paso 2.3.3, aspirar el medio de cultivo de la placa de cultivo de tejidos de control y la placa de cultivo de biomaterial suspensión y añadir 1 mL de PBS 1 x (37 ° C). Aspire el PBS y fijar las células por incubación en 1 mL de solución de formalina al 10% tamponado a temperatura ambiente durante 10 minutos.
    2. Aspirar la solución de formalina al 10% tamponada con una pipeta de un solo uso y agregar 1 mL de PBS 1 x a RT. Repita este paso tres veces, luego aspire PBS, reemplazar con 1 mL de tampón (pH 5) de la trampa e incubar las placas a 37 ° C por 30 min.
    3. Aspire el búfer de trampa y añadir 1 mL de acetona y 100% el etanol de 1:1. Incubar la placa a temperatura ambiente por 30 s. rápidamente solución aspirar la acetona etanol con una pipeta de un solo uso y secar completamente las placas a TA.
    4. Para la trampa de coloración de la solución, preparar un 10 mg/mL solución stock de fosfato de naftol AS-MX en disolver N, N-dimetilformamida, 0,6 mg/mL de fast rojo violeta sal en tampón de trampa y añadir 0,1 mL de solución stock de fosfato de naftol AS-MX a 10 mL de fast rojo violeta sal en tampón de trampa.
    5. Añadir 1 mL de solución de tinción de trampa incubar la placa a 37 ° C durante 10 min, luego aspirar la trampa solución de tinción y añadir 1 mL de agua ultrapura para detener la reacción.
    6. Transferencia de los discos de β-TCP y rebanadas de hueso bovino después de la tinción en un nuevo pozo, observar OCs manchado rojo usando un microscopio de luz (aumento: 10 X) y enumerar trampa + OCs madura con tres o más núcleos.

3. crítica tamaño ratón defecto Calvarial modelo

  1. Inyectar 0.1 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea (s.c.) en ratones BALB/c 8 semanas de edad para la analgesia.
  2. Anestesiar los ratones con una mezcla de 100 mg/kg ketamina y 5 mg/kg i.p. de xilacina, agregar un gel o ungüento para los ojos para mantenerlos húmedos y coloque el ratón sobre una placa de calentamiento a 37 ° C durante todo el procedimiento para prevenir la hipotermia. Evaluar la profundidad de la anestesia por presión del dedo del pie y la cola.
  3. Afeitarse la piel en la parte superior de la cabeza entre las orejas y limpie la superficie con 7,5% povidona yodo solución y 70% etanol.
  4. Hacer una incisión sagital de línea media en la parte superior del cráneo entre las orejas con un bisturí estéril para exponer el calvarium y quitar los tejidos finos conectivos de pericráneo sobre el hueso parietal derecho raspando con un bisturí.
  5. Crear un defecto de tamaño crítico en el hueso parietal derecho utilizando un trépano dental estéril con un diámetro de 4 mm (2000 rpm) bajo irrigación constante con solución salina normal a muesca el hueso parietal derecho y cortar a través de la ectocortex y algunos endocortex.
  6. Para evitar daños en el mater del dura, utilice un pequeño elevador perióstico para romper el endocortex restante, cuidadosamente levante el hueso calvarial y sacarla con fórceps. El defecto resultante debe ser circular y aproximadamente 3,5 mm de diámetro.
  7. Llenar el defecto calvarial con previamente remojadas (estéril de 1 x PBS a temperatura ambiente) espuma de β-TCP/C con unas pinzas.
  8. Preparar el número adecuado de controles negativos pareados por edad, simulados con un defecto vacíelo.
  9. Para mantener el biomaterial en el lugar, poner 0,5 μl de adhesivo tisular en el borde del defecto en dos puntos opuestos.
  10. Cierre la piel con una sutura no absorbible.
  11. Limpie todos los instrumentos quirúrgicos con esterilizante frío para mantener las condiciones estériles antes de realizar la cirugía siguiente en un ratón anestesiado.
  12. Para el tratamiento post quirúrgico, colocar los animales en una placa de calefacción limpio y seco a 37 ° C en el área de la cirugía para el control adecuado durante el período de recuperación. Vigilar la frecuencia respiratoria, temperatura corporal y color de las mucosas y los ojos cada 10 minutos hasta que se despiertan.
  13. Transferir los ratones conscientes funcionados en una jaula con comida y agua separados de los otros animales hasta recuperación completa. Inyectar 0.1 mg/kg de buprenorfina s.c. para terapia analgésica postquirúrgica dos veces al día durante 72 h. regreso recuperado ratones a sus jaulas.
  14. Para determinar la eficacia del biomaterial, eutanasia la i.p. de ratones con una solución de 200 mg/kg ketamina y 24 mg/kg xilacina.
  15. En la implantación posterior de 8 – 12 semanas, decapita al eutanasia del ratón con unas tijeras afiladas.
  16. Fijar la cabeza decapitada de ratón en 30 mL de 4.5% tamponada con solución de formalina durante 1-2 semanas garantizar la penetración completa del fijador en el tejido.
  17. Transferir las cabezas en etanol al 70% para el almacenamiento a largo plazo a 4 ° C hasta por un año.
  18. Uso micro computarizada de tomografía (microCT) o técnicas histológicas undecalcified estandarizadas para evaluar la regeneración ósea. Es posible utilizar microCT análisis en muestras post mortem en alta resolución (90 kV, 4 min) en 2D y 3D sagital y frontal planos.
  19. Para histología undecalcified, deshidratar las cabezas en ascendente grados de etanol y embed en glicol metacrilato de metilo.
  20. Corte los bloques de metacrilato de metilo-encajado de glicol con una sierra de diamante y moler las secciones con un grosor de aproximadamente 80 – 100 μm.
  21. Evaluar Levai Laczko hueso secciones manchada para identificar la nueva formación de hueso14.

4. in Vitro la respuesta inmune

  1. Eutanasia el ingenuo 8 semana de edad intraperitoneal de ratones BALB/c con una solución de 200 mg/kg ketamina y 24 mg/kg xilacina.
  2. Coloque el ratón sobre su lado derecho, afeitarse la piel en el lado izquierdo y limpiar la piel sobre el lado izquierdo del abdomen con etanol al 70%.
  3. Hacer una 10 mm larga y profunda incisión de 1 mm en la piel del ratón en el lado izquierdo posteriorly siguiendo las costillas sobre el estómago con tijeras estériles.
  4. Abrir la piel y luego exponer el peritoneo. Hacer una 10 mm de largo y menos de 1 mm de profundidad de incisión en el peritoneo utilizando las tijeras bajo condiciones estériles.
  5. Empujar el estómago proximal para exponer el bazo.
  6. Sujete el bazo suavemente con pinzas estériles y quite cortando el tejido y vasos coloca por debajo de él.
  7. Coloque el bazo intacto en un tubo de 50 mL que contiene 10 mL de frío 1 x PBS estéril.
  8. Preparar una suspensión unicelular por picar el bazo con 2 pinzas estériles o 2 portaobjetos de vidrio estéril.
  9. Retire los residuos pasa por un colador de célula estéril de 40 μm con PBS 1 x fría utilizando el émbolo de una jeringa de 1 mL.
  10. Centrifugue la suspensión de células individuales a 300 x g durante 10 min a 4 ° C en un tubo cónico de 50 mL, aspirar y descartar el sobrenadante. Luego Resuspender el precipitado de células en 5 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos (gr).
  11. Incubar la suspensión de células durante 14 minutos a temperatura ambiente y detener la reacción agregando 45 mL de medio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
  12. Centrifugar las células después de la lisis de la célula a 300 x g durante 10 min a 4 ° C y luego descartar el sobrenadante.
  13. Esplenocitos resuspender en Medio RPMI con 10% había inactivado con calor FBS solución de penicilina-estreptomicina de 1%, 0,1% gentamicina, ß-mercaptoetanol 0,2% y 1% no esenciales aminoácidos.
  14. Incubar la espuma de β-TCP/C en una placa de cultivo de 96 pocillos estériles con Medio RPMI durante 24 h a 37 ° C y 5% de CO2 antes de sembrar células.
  15. Añadir esplenocitos en números titulados, por ejemplo., 1,25 x 105, 2,5 x 105 y 5 x 105/well a pozos de una placa de cultivo de tejidos de 96 pozos con Medio RPMI y aditivos, con o sin la espuma de β-TCP/C previamente incubada.
  16. Añadir 10 μg/mL concanavilina A (estafa A) disuelto en medio de un total de 100 μL/pocillo a los pocillos adecuados y luego incubar a 37 ° C y 5% de CO2 por 72 h.
  17. Proliferación de la célula de medida con un ensayo de bromodeoxiuridina (BrdU). Añadir 10 μL/pocillo de solución etiquetado de BrdU a las 48 h de cultivo celular y luego incubar la placa por una 24 h adicional.
  18. A las 72 h, recoger el sobrenadante y almacenar a-20 ° C hasta su uso posterior.
  19. Añadir 200 μL/pocillo de la solución de fijación a cada pozo y luego incubar durante 30 min a RT. Aspire la solución de fijación. Añadir 100 μL/pocillo de la solución de trabajo de anticuerpos anti-BrdU e incubar durante 90 minutos.
  20. Aspirar la solución de anticuerpo, enjuague los pozos tres veces con 200 – 300 μL/pocillo de solución de lavado y remueva la solución de lavado.
  21. Añada 100 μl de solución de sustrato incubar durante 3-10 min a temperatura ambiente y medir la absorbancia a 450 nm.
  22. Medir la interleucina-1β (IL-1β), interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4) e interferón-γ (IFN-γ) en los sobrenadantes recogidos usando un ELISA estándar.

5. alto rendimiento modelo Intraperitoneal

  1. Anestesiar ratones BALB/c antiguo de mujer 6-8 semanas con una mezcla de 100 mg/kg ketamina y 5 mg/kg i.p. de xilacina y agregar un gel o ungüento para los ojos para mantenerlos húmedos y coloque el ratón sobre una placa de calentamiento a 37 ° C durante todo el procedimiento para prevenir la hipotermia. Evaluar la profundidad de la anestesia por presión del dedo del pie y la cola.
  2. Afeitarse la piel abdominal y limpie con 7.5% povidona yodo solución y el 70% de etanol.
  3. Hacer una incisión de 8 mm largo de la línea media a través de la piel a lo largo de la linea alba. Hacer una pequeña incisión en el peritoneo con bisturí.
  4. PBS estéril lugar había empapado injertos de la espuma de β-TCP/C (2 x 2 x 2 mm3) en la cavidad peritoneal o sin había agregado de materiales para los ratones de control simulado de edad comparable.
  5. Suturar el peritoneo y la piel con sutura absorbible y no absorbible, respectivamente.
  6. Limpie todos los instrumentos quirúrgicos con esterilizante frío para mantener las condiciones estériles antes de realizar la cirugía siguiente en un ratón anestesiado.
  7. Para el tratamiento post quirúrgico, colocar los animales en una placa de calefacción limpio y seco a 37 ° C en el área de la cirugía para el control adecuado durante el período de recuperación. Vigilar la frecuencia respiratoria, temperatura corporal y color de las mucosas y los ojos cada 10 minutos hasta que se despiertan.
  8. Transferir los ratones conscientes funcionados en una jaula con comida y agua separados de los otros animales hasta recuperación completa. Volver totalmente recuperados ratones a sus jaulas.
    Nota: Este procedimiento induce un dolor mínimo. Terapia analgésica postquirúrgica generalmente no es necesaria. Si la operación los animales muestran signos de dolor, inyecta 0,1 mg/kg de buprenorfina s.c. u otro fármaco analgésico apropiado para aliviar el dolor.
  9. Eutanasia a la ratones 7 días tras la implantación, con una solución de 200 mg/kg ketamina y 24 mg/kg xilacina i.p.
  10. En la implantación después de 7 días, lavado de la cavidad peritoneal con un 1 mL jeringa con una aguja de 25 G para un total de 3 mL de PBS frío sujetando la cabeza de ratón y insertar la aguja en el cuadrante abdominal inferior izquierdo y el objetivo proximalmente.
    Nota: El líquido peritoneal debe estar libre de glóbulos rojos.
  11. Centrifugar el líquido de lavado peritoneal a 300 x g durante 5 min a 4 ° C y recoger el líquido peritoneal para almacenar a-20 ° C para la medición de ELISA de citoquinas IL-1β, IL-2 y IL-4.
  12. Aspirar el sobrenadante, Resuspender el precipitado de células en 1 mL de PBS y contar las células peritoneales con azul tripán en un hemocitómetro.
  13. Citocentrifuga la suspensión de células a 5 x 105 células en portaobjetos de vidrio, deje que los portaobjetos se seque y mancha para un conteo diferencial.
  14. Usando un microscopio de luz, cuenta un mínimo de 300 células en total y diferenciar a los macrófagos, eosinófilos, neutrófilos y linfocitos.

6. subcrónica modelo subcutánea

  1. Anestesiar ratones BALB/c hembra 6 – 8 semanas viejo con una mezcla de 100 mg/kg ketamina y 5 mg/kg i.p. de xilacina, agregar gel o ungüento para los ojos para mantenerlos húmedos y coloque el ratón sobre una placa de calentamiento a 37 ° C durante todo el procedimiento para prevenir la hipotermia. Evaluar la profundidad de la anestesia por presión del dedo del pie y la cola.
  2. Coloque el ratón sobre su espalda, afeitarse la piel abdominal y limpiar la superficie de afeitado con 7,5% povidona yodo solución y 70% etanol.
  3. Hacer una incisión de 8 mm largo de la línea media a través de la piel a lo largo de la línea alba del abdomen utilizando un bisturí y luego implante PBS empapado biomaterial (2 x 2 x 2 mm3) debajo de la piel o no añadir ningún material para los ratones de control simulado de edad comparable.
  4. Sutura la piel con una sutura no absorbible.
  5. Limpie todos los instrumentos quirúrgicos con esterilizante frío para mantener las condiciones estériles antes de realizar la cirugía siguiente en un ratón anestesiado.
  6. Para el tratamiento post quirúrgico, colocar los animales en una placa de calefacción limpio y seco a 37 ° C en el área de la cirugía para el control adecuado durante el período de recuperación. Vigilar la frecuencia respiratoria, temperatura corporal y color de las mucosas y los ojos cada 10 minutos hasta que se despiertan.
  7. Transferir los ratones conscientes funcionados en una jaula con comida y agua separados de los otros animales hasta recuperación completa. Volver totalmente recuperados ratones a sus jaulas.
    Nota: Este procedimiento induce un dolor mínimo. Terapia analgésica postquirúrgica generalmente no es necesaria. Si la operación los animales muestran signos de dolor, inyecta 0,1 mg/kg de buprenorfina s.c. u otro analgésico adecuado.
  8. Cuando esté listo para examinar el sitio de implantación, eutanasia la i.p. de ratones con una solución de 200 mg/kg ketamina y 24 mg/kg xilacina.
  9. Implantación después de ocho semanas, suprimir el sitio de implantación con el tejido (1 cm2) circundante.
  10. Fijar el tejido en solución de formalina al 4.5% tamponado durante la noche, incluir en parafina y cortadas en 4 secciones de μm.
  11. Mancha 4 secciones de tejido parafina-encajado de μm con hematoxilina y eosina (H & E) para la inflamación o el de Masson trichrome de fibrosis y deposición de colágeno.

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Resultados

Para determinar β-TCP para su efectividad como un biomaterial para la reparación ósea, se utilizan in vitro y en vivo métodos de cribado. En primer lugar, medimos las respuestas OB a los discos de β-TCP en comparación con controles solo medio basal. Figura 2 se muestra la viabilidad de la OB en respuesta a discos de β-TCP a los 7 y 14 días de la cultura. Viabilidad celular de las células metabólicamente activas en los pozos de la cultura era...

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Discusión

A continuación, os mostramos un enfoque multidisciplinario para la evaluación preclínica de la biocompatibilidad de biomateriales representativos desarrollado para la reparación y regeneración ósea. Probamos las respuestas de OBs, OCs, y la respuesta curativa en vivo en un defecto óseo importante modelo en ratones, así como in vitro e in vivo las respuestas inmunitarias. El objetivo fue demostrar cómo los análisis del trabajan y resumen los datos y conclusiones derivadas de la examinación de lo...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este proyecto de investigación ha recibido financiación del séptimo programa de marco de la Unión Europea (FP7/2007-2013) con beca Convenio núm. 263363.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
β-TCP (β-TCP, 14 mm)Los discos se sinterizaron en un horno de mufla a una temperatura de 1150 °C. Una descripción detallada de la producción se puede encontrar en Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Las muestras fueron irradiadas con rayos UV (15 min para cada lado) antes de su uso en cultivos celulares.
Espuma Orthovita Vitoss (espuma β-TCP/C)Orthovita2102-1405
Cultivo de osteoblastos de ratón
Alizarina Red SSigma-AldrichA5533
Tampón de ensayo ALP (2x) pH 10,4Disuelva 200 mM de glicina, 2 mM de cloruro de magnesio, 2 mM de cloruro de zinc en agua ultrapura y ajuste a pH 10.
Medio de crecimiento óseo (BGM)α-MEM + 10 % de FBS inactivado por calor + 1 % de penicilina/estreptomicina
Tampón de lisis celular: Tampón de lisis celular CyQuant 20x concentradoThermo ScientificC7027Diluya el material tampón de lisis celular concentrado 20 veces en agua ultrapura.
Reactivo de viabilidad celular: Presto Blue reactivo de viabilidad celularInvitrogen, Thermo Fisher ScientificA13261
Colagenasa tipo IV de clostridium histolyticumSigma-AldrichC5138
DC kit de ensayo de proteínas IIBio Rad5000112DC contiene reactivo A, reactivo B, reactivo S y BSA para el estándar de referencia. Para el reactivo A', agregue 20 µ L reactivo S a 1000 µ L reactivo A. 
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD8418Filtro estéril DMSO antes de su uso.
Dispasa II (proteasa neutra, grado II)Kit
EnzCheck para la actividad de la fosfatasa alcalina Thermo Fisher ScientificE12020EnzCheck contiene 6,8-difluoro-4-metilobeliferil fosfato (DiFMUP), N,N-dimetilformamida y 6,8-difluoro-7-hidroxi-4-metilcumarina (DiFMU). 
Suero fetal bovino (FBS)Sigma-AldrichF7524
Solución de formalina tamponada neutra 10%Sigma-AldrichHT501128
GlicinaSigma-AldrichG8898
Cloruro de hexadecilpirinio (cetilpiridinio) monohidratadoSigma-AldrichC9002
Ácido L-ascórbico 2-fosfato sesquimagnesio sal hidratoSigma-AldrichA8960
Cloruro de magnesio hexahidratadoSigma-AldrichM2670
MEM medio alfa (α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
Medio de mineralización osteogénico (MM)&alfa;-MEM + 10% FBS inactivado por calor + 1% penicilina-estreptomicina + 50 µ g/mL de ácido ascórbico + 5 mM β-glicerofosfato
Penicilina-estreptomicina   Sigma-AldrichP4333
Solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Sigmafast BCIP/NBTSigma-AldrichB5655
Tripsina-EDTA (0,5%), rojo sin fenol (10x)Gibco, Thermo Fisher Scientific 15400054Diluir la solución madre concentrada 10 veces en 1x PBS.
Tween20Sigma-AldrichP1379
Agua ultrapura: Agua de cultivo celular libre de pirógenosVWRL0970-500
TampónAñadir  0,05% Tween20 a 1x PBS.
Cloruro de zincSigma-Aldrich1.08816
β-Glicerofosfato hidrato de sal disódicaSigma-AldrichG5422
Placa de cultivo en suspensión de 24 pocillosGreiner bio-one662102
placa de cultivo de tejidos de 24 pocillosGreiner bio-one662160
mL Tubo cónicoGreiner bio-one227261
Placa negra de 96 pocillosGreiner bio-one655076
Placa transparente de 96 pocillosGreiner bio-one655001
Centrífuga: VWR Mega Star 600RIncubadora
: HeraCell 240Thermo Scientific
Cryovial 2 mLGreiner bio-one122263
Unidad de filtro desechable FP30/0.2 CA-SGE Healthcare Life Sciences Whatman10462200Para la filtración estéril de soluciones enzimáticas.
Escáner plano: Epson Perfection 1200 PhotoEpson
Infinite M200 ProTecan
Tubo de microcentrífuga: Tubo Eppendorf con cierre seguro 0,5 mLVWR20901-505
Tubo de microcentrífuga: Tubo Eppendorf con bloqueo seguro 1,5 mLVWR21008-959
Shaker Swip (orbital y horizontal) Edmund Buehler 
incubadora agitadora GFL3032GFL 3032
Pipeta de un solo uso: pipeta de sueroGreiner bio-one612301
Instrumentos estériles (tijeras, pinzas, pinzas curvas)
Placa de cultivo de tejidos (10 cm)Greiner bio-one664960
Ratón osteoblasto-osteoclasto cocultivo
1α,25- Dihidroxivitamina D3Sigma-Aldrich179361000x caldo concentrado (10 µ M en etanol 100%)
AcetonaVWR Chemicals22065.327
Medio de crecimiento óseo (BGM)α-MEM + 10% FBS inactivado por calor + 1% penicilina-estreptomicina
Agua destiladaCarl Roth3478.4
Etanol (100% vol/vol)VWR Chemicals20821.365
Etanol (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Rojo violeta rápido Sal LBSigma-AldrichF3381
Suero fetal bovino (FBS)Sigma-AldrichF7524
Solución de formalina neutra tamponada 10%Sigma-AldrichHT501128
MEM alfa Medio (α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
N,N-DimetilformamidaSigma-AldrichD4551
Naftol AS-MX fosfatoSigma-AldrichN4875
Medio de diferenciación de osteoclastos (DM)α-MEM + 10% FBS inactivado por calor + 1% penicilina-estreptomicina + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamina D3 + 1 µ M prostaglandina E2 
Penicilina-estreptomicina Sigma-AldrichP4333
Solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Prostaglandina E2 (PGE2)Cayman Chemical Company90030161000x culata concentrada (1 mM en etanol 100%)
Acetato de sodio trihidratoSigma-AldrichS7670
Tartrato de sodio dibásico dihidratadoSigma-AldrichS8640
Instrumentos estériles (tijeras, fórceps, bisturí)
TRAP tampón pH 5.0Disuelva 40 mM de acetato de sodio, 10 mM de tartrato de sodio en agua ultrapura y ajuste a pH 5.
Agua ultrapura: Agua de cultivo celular libre de pirógenosVWRL0970-500
Placa de cultivo en suspensión de 24 pocillosGreiner bio-one662102
placa de cultivo de tejidos de 24 pocillosGreiner bio-one662160
Tubo cónico de 50 ml CentrífugaGreiner bio-one227261
: VWR Mega Star 600RVWR
Incubadora de CO2: HeraCell 240Thermo Scientific
Hoja de oblea de diamante (10,2 cm x 0,3 cm)Buehler
Placa de Petri
Frasco de vidrio con tapón de rosca 20 mLCarl RothEXY4.1
Schein Animal Health9003016
Pipeta de un solo uso: pipeta de sueroGreiner bio-one612301
Aguja estéril: Aguja hipodérmica RW 27 G x 3/4''Henry Schein Animal Health9003340
Modelo de defecto de la pantorrilla de ratón
Analgesia: Buprenorfina (Bupaq)Richter Pharma AG
Anestesia: ketamina (Ketamidor), xilacina (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Esterilizante para frío: SafeSept MaxHenry Schein Animal Health 9882765
Etanol (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Pomada para los ojos: VitA POS 5 gUrsapharm
Solución salina normal (solución de cloruro de sodio al 0,9%)Fresenius Kabi
Solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Solución de povidona yodada: Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Roti-Histofix 4.5% formalina tamponadaCarl Roth2213.6
Adhesivo tisular: Histoacryl 5 x 0.5 mL B. Braun Surgical1050060
Equipo de protección personal: guantes quirúrgicos, gorro y mascarilla, bataHenry Schein Animal Health1045073, 1026614, 9009062, 370406
Instrumentos estériles (bisturí, tijeras, fórceps, portaagujas)
Agujas estériles: Agujas hipodérmicas RW 27 G x 3/4'' y 30 G x 1/2'' Henry Schein Animal Health9003340, 9003630
Jeringa estéril de un solo uso 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
Placa calefactora: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Hisopos de gasa estérilHenry Schein Animal Health220192
Bisturí estéril desechable (Figura 20)Henry Schein Animal Health9008957
Taladro quirúrgico/dental: Implantmed SI-923W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH16929000
Pieza de mano tipo S-IIW& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH30056000
Trephine, diámetro 4 mmHager& Meisinger GmbH229040
Juego de tubos de riego 2,2 mW& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH4363600
Elevador perióstico 2 mm / 3 mmHenry Schein Animal Health472683
Sutura no reabsorbible: Poliéster verde, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cmHenry Schein Animal Health300715
In vitro respuestas inmunitarias
Anestesia para la eutanasia: Ketamina (Ketamidor), Xilacina (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Proliferación celular ELISA, BrdU (colorimétrico) Kit de ensayoSigma-Aldrich11647229001El kit contiene solución de etiquetado BrdU, solución de fijación (FixDenat), solución de anticuerpos anti-BrdU, tampón de lavado y solución de sustrato.
Concanavalina A (ConA)MP Biomedicals150710
Medio de cultivo de esplenocitosMedio RPMI + 10% FBS inactivado por calor + 1% solución de penicilina-estreptomicina + 0,1% gentamicina + 0,2% ß-mercaptoetanol + 1% aminoácidos no esenciales
Etanol (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Suero fetal bovino (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific& nbsp;
GentamicinaGibco, Thermo Fisher Scientific 
Ratón IL-1 y beta; ELISA ¡Listo-LISTO-Listo!Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
Ratón IL-2 ELISA MAX EstándarBioLegend431001
Ratón IL-4 ELISA MAX EstándarBioLegend431101
Ratón INF-γ ELISA MAX StandardBioLegend430801
Solución de aminoácidos no esencialesGibco, Thermo Fisher Scientific 
Penicilina-estreptomicina Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC): BD Pharm, LyseBD Bioscience555899
RPMI 1640 medio, HEPES, Gibco, Thermo Fisher Scientific 52400025
β-MercaptoetanolGibco, Thermo Fisher Scientific 
tubo cónico de 50 mlGreiner bio-one227261
placa de cultivo de tejidos de 96 pocillosGreiner bio-one655180
Centrífuga: VWR Mega Star 600RVWR
Filtro de células 40 µ mBD Bioscience352340
Infinite M200 Pro lector de microplacasTecan
Jeringa estéril de un solo uso 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
Instrumentos quirúrgicos estériles (pinzas, portaobjetos de vidrio)
Modelo intraperitoneal de alto rendimiento
Anestesia: ketamina (Ketamidor), xilacina (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Esterilizante para frío: SafeSept MaxHenry Schein Animal Health 9882765
Etanol (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Pomada para los ojos: VitA POS 5 gUrsapharm
Mouse IL-1β ELISA ¡Listo-LISTO-Listo!Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
Ratón IL-2 ELISA MAX EstándarBioLegend431001
Ratón IL-4 ELISA MAX EstándarBioLegend431101
Solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Solución de povidona yodada: Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff TintingKit Thermo Scientific9990700Para recuento diferencial de células.
Placa calefactora: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Hemocitómetro: Cámara de NeubauerCarl RothPC72.1
Sutura no reabsorbible: Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
Sutura reabsorbible: PolysorbCovidienSL-5628
Centrífuga Shandon para citopenaThermo Scientific
Jeringa estéril de un solo uso de 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
Hisopos de gasa estérilesHenry Schein Animal Health220192
Agujas estériles: Agujas hipodérmicas RW 27 G x 3/4'' y 25 GHenry Schein Animal Health9003340, 420939
Instrumentos quirúrgicos estériles (bisturí, tijeras, fórceps, portaagujas)
Solución de azul de tripano 0,4%Gibco, Thermo Fisher Scientific 15250061
: Ketamina (Ketamidor), Xilacina (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Esterilizante para el resfriado: SafeSept MaxHenry Schein Animal Health 9882765
Etanol (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Pomada para los ojos: VitA POS 5 gUrsapharm
Solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Solución de povidona yodada: Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Roti-Histofix 4,5% formalina tamponadaCarl Roth2213.6
Placa calefactora: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Sutura no reabsorbible: Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H Equipo
protección individual: quirúrgico guantes, gorro y mascarilla, bataHenry Schein Animal Health1045073, 1026614, 9009062, 370406
Jeringa estéril de un solo uso 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
Hisopos de gasa estérilesHenry Schein Animal Health220192
Instrumentos estériles (bisturí, tijeras, pinzas, portaagujas)
Aguja estéril: Agujas hipodérmicas RW 27 G x 3/4'' 9003340 de Salud Animal Henry Schein, 420939
de ensayo de fosfatasa Roche 4942078001 El kit de ensayo de fosfatasa 10010023 de lavado de CO2 VWR Lector de microplacas 10010023Sierra de baja velocidad Isomet Buehler (6 cm)Greiner bio-one 628,161 Jeringa estéril de un solo uso 1 mL Henry 100100231050006415750037111400501514012210010023, 313500101001002310010023de

Referencias

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  4. O'Brien, F. J. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Materials Today. 14 (3), 88-95 (2011).
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