El número de nuevos biomateriales ingeniería para reparar las lesiones del hueso grande está en continua expansión con el objetivo de acelerar la cicatrización ósea y superar las complicaciones asociadas con el trasplante de hueso. Aquí, presentamos una estrategia multidisciplinaria para las pruebas de biocompatibilidad preclínico de Biomateriales para la reparación de hueso.
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Artículo de método
Perfil de compatibilidad biológica de Biomateriales para regeneración ósea
En este artículo
Resumen
Resumen
Fracturas del hueso grande de la Unión no son un reto importante en cirugía ortopédica. Aunque auto e injertos óseos Alogénicos son excelentes para la curación de estas lesiones, existen posibles complicaciones con su uso. Así, materiales científicos están desarrollando biomateriales sintéticos, biocompatibles para superar estos problemas. En este estudio, presentamos una plataforma multidisciplinar para la evaluación de Biomateriales para la reparación de hueso. Combinamos conocimientos de Biología ósea y de la inmunología para desarrollar una plataforma como en vitro de los osteoclastos (OC) y osteoblastos (OB) ensayos en vivo modelos de ratón de reparación ósea, inmunogenicidad y alergenicidad. Nos muestran cómo realizar los experimentos, resumir los resultados e informar sobre biocompatibilidad de los biomateriales. En particular, hemos probado OB viabilidad, diferenciación y mineralización y viabilidad OC y diferenciación en el contexto de los discos de β-tricálcico fosfato (β-TCP). También probamos una espuma de β-TCP/colágeno (β-TCP/C) que es un material disponible comercialmente utilizado clínicamente para la reparación ósea en un modelo de ratón de defecto hueso calvarial tamaño crítico para determinar los efectos en la fase temprana de la curación del hueso. En experimentos paralelos, se evaluaron las respuestas inmunes y alérgicas en ratones. Nuestro enfoque genera un perfil de compatibilidad biológica de un biomaterial de hueso con una serie de parámetros necesarios para la predicción de la biocompatibilidad de los biomateriales utilizados para la curación del hueso y la reparación en pacientes.
Introducción
Reparación ósea es un proceso complejo que comienza con la formación de hematoma, inflamación, formación y remodelación luego1,2de callos. Sin embargo, potencial de la regeneración ósea se limita al tamaño de la fractura ósea1,3. Por ejemplo, las fracturas del hueso grande causadas por trauma, cáncer u osteoporosis no pueden curar y se denominan fracturas sin unión. Estas lesiones del hueso a menudo requieren tratamiento para promover la regeneración y reparación ósea fisiológica sana. Actualmente, el trasplante de autoinjerto y aloinjerto óseo es el e....
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Protocolo
Los procedimientos se realizaron con ratones BALB/c siguiendo todas las pautas para el cuidado y uso de animales de laboratorio del Ministerio de educación, Ciencia e investigación austríaco y fueron aprobados por la Comisión de ética del Ministerio Austriaco de educación, ciencia y la investigación.
1. primario de ratón OB cultura
- Aislamiento de OB de calvaria ratón neonatal mediante digestión enzimática
- Eutanasia de cachorros neonatales de 1 – 2 días (60 en total) por decapitación y colocar las cabezas en una placa Petri estéril 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Sostener la ca....
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Resultados
Para determinar β-TCP para su efectividad como un biomaterial para la reparación ósea, se utilizan in vitro y en vivo métodos de cribado. En primer lugar, medimos las respuestas OB a los discos de β-TCP en comparación con controles solo medio basal. Figura 2 se muestra la viabilidad de la OB en respuesta a discos de β-TCP a los 7 y 14 días de la cultura. Viabilidad celular de las células metabólicamente activas en los pozos de la cultura era.......
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Discusión
A continuación, os mostramos un enfoque multidisciplinario para la evaluación preclínica de la biocompatibilidad de biomateriales representativos desarrollado para la reparación y regeneración ósea. Probamos las respuestas de OBs, OCs, y la respuesta curativa en vivo en un defecto óseo importante modelo en ratones, así como in vitro e in vivo las respuestas inmunitarias. El objetivo fue demostrar cómo los análisis del trabajan y resumen los datos y conclusiones derivadas de la examinación de lo.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este proyecto de investigación ha recibido financiación del séptimo programa de marco de la Unión Europea (FP7/2007-2013) con beca Convenio núm. 263363.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| β-TCP (β-TCP, 14 mm) | Los discos se sinterizaron en un horno de mufla a una temperatura de 1150 °C. Una descripción detallada de la producción se puede encontrar en Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Las muestras fueron irradiadas con rayos UV (15 min para cada lado) antes de su uso en cultivos celulares. | ||
| Espuma Orthovita Vitoss (espuma β-TCP/C) | Orthovita | 2102-1405 | |
| Cultivo de osteoblastos de ratón | |||
| Alizarina Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Tampón de ensayo ALP (2x) pH 10,4 | Disuelva 200 mM de glicina, 2 mM de cloruro de magnesio, 2 mM de cloruro de zinc en agua ultrapura y ajuste a pH 10. | ||
| Medio de crecimiento óseo (BGM) | α-MEM + 10 % de FBS inactivado por calor + 1 % de penicilina/estreptomicina | ||
| Tampón de lisis celular: Tampón de lisis celular CyQuant 20x concentrado | Thermo Scientific | C7027 | Diluya el material tampón de lisis celular concentrado 20 veces en agua ultrapura. |
| Reactivo de viabilidad celular: Presto Blue reactivo de viabilidad celular | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | A13261 | |
| Colagenasa tipo IV de clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DC kit de ensayo de proteínas II | Bio Rad | 5000112 | DC contiene reactivo A, reactivo B, reactivo S y BSA para el estándar de referencia. Para el reactivo A', agregue 20 µ L reactivo S a 1000 µ L reactivo A. |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Filtro estéril DMSO antes de su uso. |
| Dispasa II (proteasa neutra, grado II) | Kit | ||
| EnzCheck para la actividad de la fosfatasa alcalina | Thermo Fisher Scientific | E12020 | EnzCheck contiene 6,8-difluoro-4-metilobeliferil fosfato (DiFMUP), N,N-dimetilformamida y 6,8-difluoro-7-hidroxi-4-metilcumarina (DiFMU). |
| Suero fetal bovino (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Solución de formalina tamponada neutra 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Glicina | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Cloruro de hexadecilpirinio (cetilpiridinio) monohidratado | Sigma-Aldrich | C9002 | |
| Ácido L-ascórbico 2-fosfato sesquimagnesio sal hidrato | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Cloruro de magnesio hexahidratado | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MEM medio alfa (α-MEM) | Gibco Life Technologies | 11900-073 | |
| Medio de mineralización osteogénico (MM) | &alfa;-MEM + 10% FBS inactivado por calor + 1% penicilina-estreptomicina + 50 µ g/mL de ácido ascórbico + 5 mM β-glicerofosfato | ||
| Penicilina-estreptomicina | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sigmafast BCIP/NBT | Sigma-Aldrich | B5655 | |
| Tripsina-EDTA (0,5%), rojo sin fenol (10x) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15400054 | Diluir la solución madre concentrada 10 veces en 1x PBS. |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Agua ultrapura: Agua de cultivo celular libre de pirógenos | VWR | L0970-500 | |
| Tampón | Añadir 0,05% Tween20 a 1x PBS. | ||
| Cloruro de zinc | Sigma-Aldrich | 1.08816 | |
| β-Glicerofosfato hidrato de sal disódica | Sigma-Aldrich | G5422 | |
| Placa de cultivo en suspensión de 24 pocillos | Greiner bio-one | 662102 | |
| placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos | Greiner bio-one | 662160 | |
| mL Tubo cónico | Greiner bio-one | 227261 | |
| Placa negra de 96 pocillos | Greiner bio-one | 655076 | |
| Placa transparente de 96 pocillos | Greiner bio-one | 655001 | |
| Centrífuga: VWR Mega Star 600R | Incubadora | ||
| : HeraCell 240 | Thermo Scientific | ||
| Cryovial 2 mL | Greiner bio-one | 122263 | |
| Unidad de filtro desechable FP30/0.2 CA-S | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 10462200 | Para la filtración estéril de soluciones enzimáticas. |
| Escáner plano: Epson Perfection 1200 Photo | Epson | ||
| Infinite M200 Pro | Tecan | ||
| Tubo de microcentrífuga: Tubo Eppendorf con cierre seguro 0,5 mL | VWR | 20901-505 | |
| Tubo de microcentrífuga: Tubo Eppendorf con bloqueo seguro 1,5 mL | VWR | 21008-959 | |
| Shaker Swip (orbital y horizontal) | Edmund Buehler | ||
| incubadora agitadora GFL3032 | GFL | 3032 | |
| Pipeta de un solo uso: pipeta de suero | Greiner bio-one | 612301 | |
| Instrumentos estériles (tijeras, pinzas, pinzas curvas) | |||
| Placa de cultivo de tejidos (10 cm) | Greiner bio-one | 664960 | |
| Ratón osteoblasto-osteoclasto cocultivo | |||
| 1α,25- Dihidroxivitamina D3 | Sigma-Aldrich | 17936 | 1000x caldo concentrado (10 µ M en etanol 100%) |
| Acetona | VWR Chemicals | 22065.327 | |
| Medio de crecimiento óseo (BGM) | α-MEM + 10% FBS inactivado por calor + 1% penicilina-estreptomicina | ||
| Agua destilada | Carl Roth | 3478.4 | |
| Etanol (100% vol/vol) | VWR Chemicals | 20821.365 | |
| Etanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Rojo violeta rápido Sal LB | Sigma-Aldrich | F3381 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Solución de formalina neutra tamponada 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| MEM alfa Medio (α-MEM) | Gibco Life Technologies | 11900-073 | |
| N,N-Dimetilformamida | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Naftol AS-MX fosfato | Sigma-Aldrich | N4875 | |
| Medio de diferenciación de osteoclastos (DM) | α-MEM + 10% FBS inactivado por calor + 1% penicilina-estreptomicina + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamina D3 + 1 µ M prostaglandina E2 | ||
| Penicilina-estreptomicina | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Prostaglandina E2 (PGE2) | Cayman Chemical Company | 9003016 | 1000x culata concentrada (1 mM en etanol 100%) |
| Acetato de sodio trihidrato | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Tartrato de sodio dibásico dihidratado | Sigma-Aldrich | S8640 | |
| Instrumentos estériles (tijeras, fórceps, bisturí) | |||
| TRAP tampón pH 5.0 | Disuelva 40 mM de acetato de sodio, 10 mM de tartrato de sodio en agua ultrapura y ajuste a pH 5. | ||
| Agua ultrapura: Agua de cultivo celular libre de pirógenos | VWR | L0970-500 | |
| Placa de cultivo en suspensión de 24 pocillos | Greiner bio-one | 662102 | |
| placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos | Greiner bio-one | 662160 | |
| Tubo cónico de 50 ml Centrífuga | Greiner bio-one | 227261 | |
| : VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| Incubadora de CO2: HeraCell 240 | Thermo Scientific | ||
| Hoja de oblea de diamante (10,2 cm x 0,3 cm) | Buehler | ||
| Placa de Petri | |||
| Frasco de vidrio con tapón de rosca 20 mL | Carl Roth | EXY4.1 | |
| Schein Animal Health | 9003016 | ||
| Pipeta de un solo uso: pipeta de suero | Greiner bio-one | 612301 | |
| Aguja estéril: Aguja hipodérmica RW 27 G x 3/4'' | Henry Schein Animal Health | 9003340 | |
| Modelo de defecto de la pantorrilla de ratón | |||
| Analgesia: Buprenorfina (Bupaq) | Richter Pharma AG | ||
| Anestesia: ketamina (Ketamidor), xilacina (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Esterilizante para frío: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health 9882765 | ||
| Etanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Pomada para los ojos: VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
| Solución salina normal (solución de cloruro de sodio al 0,9%) | Fresenius Kabi | ||
| Solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Solución de povidona yodada: Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
| Roti-Histofix 4.5% formalina tamponada | Carl Roth | 2213.6 | |
| Adhesivo tisular: Histoacryl 5 x 0.5 mL | B. Braun Surgical | 1050060 | |
| Equipo de protección personal: guantes quirúrgicos, gorro y mascarilla, bata | Henry Schein Animal Health | 1045073, 1026614, 9009062, 370406 | |
| Instrumentos estériles (bisturí, tijeras, fórceps, portaagujas) | |||
| Agujas estériles: Agujas hipodérmicas RW 27 G x 3/4'' y 30 G x 1/2'' | Henry Schein Animal Health | 9003340, 9003630 | |
| Jeringa estéril de un solo uso 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Placa calefactora: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| Hisopos de gasa estéril | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
| Bisturí estéril desechable (Figura 20) | Henry Schein Animal Health | 9008957 | |
| Taladro quirúrgico/dental: Implantmed SI-923 | W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH | 16929000 | |
| Pieza de mano tipo S-II | W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH | 30056000 | |
| Trephine, diámetro 4 mm | Hager& Meisinger GmbH | 229040 | |
| Juego de tubos de riego 2,2 m | W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH | 4363600 | |
| Elevador perióstico 2 mm / 3 mm | Henry Schein Animal Health | 472683 | |
| Sutura no reabsorbible: Poliéster verde, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm | Henry Schein Animal Health | 300715 | |
| In vitro respuestas inmunitarias | |||
| Anestesia para la eutanasia: Ketamina (Ketamidor), Xilacina (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Proliferación celular ELISA, BrdU (colorimétrico) Kit de ensayo | Sigma-Aldrich | 11647229001 | El kit contiene solución de etiquetado BrdU, solución de fijación (FixDenat), solución de anticuerpos anti-BrdU, tampón de lavado y solución de sustrato. |
| Concanavalina A (ConA) | MP Biomedicals | 150710 | |
| Medio de cultivo de esplenocitos | Medio RPMI + 10% FBS inactivado por calor + 1% solución de penicilina-estreptomicina + 0,1% gentamicina + 0,2% ß-mercaptoetanol + 1% aminoácidos no esenciales | ||
| Etanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific& nbsp; | ||
| Gentamicina | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Ratón IL-1 y beta; ELISA ¡Listo-LISTO-Listo! | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 88-7013-88 | |
| Ratón IL-2 ELISA MAX Estándar | BioLegend | 431001 | |
| Ratón IL-4 ELISA MAX Estándar | BioLegend | 431101 | |
| Ratón INF-γ ELISA MAX Standard | BioLegend | 430801 | |
| Solución de aminoácidos no esenciales | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Penicilina-estreptomicina | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC): BD Pharm, Lyse | BD Bioscience | 555899 | |
| RPMI 1640 medio, HEPES | , Gibco, Thermo Fisher Scientific | 52400025 | |
| β-Mercaptoetanol | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| tubo cónico de 50 ml | Greiner bio-one | 227261 | |
| placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos | Greiner bio-one | 655180 | |
| Centrífuga: VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| Filtro de células 40 µ m | BD Bioscience | 352340 | |
| Infinite M200 Pro lector de microplacas | Tecan | ||
| Jeringa estéril de un solo uso 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Instrumentos quirúrgicos estériles (pinzas, portaobjetos de vidrio) | |||
| Modelo intraperitoneal de alto rendimiento | |||
| Anestesia: ketamina (Ketamidor), xilacina (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Esterilizante para frío: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health 9882765 | ||
| Etanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Pomada para los ojos: VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
| Mouse IL-1β ELISA ¡Listo-LISTO-Listo! | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 88-7013-88 | |
| Ratón IL-2 ELISA MAX Estándar | BioLegend | 431001 | |
| Ratón IL-4 ELISA MAX Estándar | BioLegend | 431101 | |
| Solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Solución de povidona yodada: Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
| Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Tinting | Kit Thermo Scientific | 9990700 | Para recuento diferencial de células. |
| Placa calefactora: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| Hemocitómetro: Cámara de Neubauer | Carl Roth | PC72.1 | |
| Sutura no reabsorbible: Ethibond Excel 4-0 | Ethicon | 6683H | |
| Sutura reabsorbible: Polysorb | Covidien | SL-5628 | |
| Centrífuga Shandon para citopena | Thermo Scientific | ||
| Jeringa estéril de un solo uso de 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Hisopos de gasa estériles | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
| Agujas estériles: Agujas hipodérmicas RW 27 G x 3/4'' y 25 G | Henry Schein Animal Health | 9003340, 420939 | |
| Instrumentos quirúrgicos estériles (bisturí, tijeras, fórceps, portaagujas) | |||
| Solución de azul de tripano 0,4% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| : Ketamina (Ketamidor), Xilacina (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Esterilizante para el resfriado: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health 9882765 | ||
| Etanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Pomada para los ojos: VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
| Solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) pH 7.4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Solución de povidona yodada: Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
| Roti-Histofix 4,5% formalina tamponada | Carl Roth | 2213.6 | |
| Placa calefactora: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| Sutura no reabsorbible: Ethibond Excel 4-0 | Ethicon | 6683H Equipo | |
| protección individual: quirúrgico guantes, gorro y mascarilla, bata | Henry Schein Animal Health | 1045073, 1026614, 9009062, 370406 | |
| Jeringa estéril de un solo uso 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Hisopos de gasa estériles | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
| Instrumentos estériles (bisturí, tijeras, pinzas, portaagujas) | |||
| Aguja estéril: Agujas hipodérmicas RW 27 G x 3/4'' | 9003340 de Salud Animal Henry Schein | , 420939 |
Referencias
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
- Cooper, G. M., et al.
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Reimpresiones y permisos
