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Artículo de método

Proteómicos y miRNA análisis de polisomas de corazón de ratón aislados después de Langendorff la perfusión

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DOI:

10.3791/58079

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29 de agosto de 2018

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1The Smidt Heart Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Advanced Clinical Biosystems Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Institute of Analytical Chemistry of the Czech Academy of Sciences

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para realizar polysome perfilado en el corazón de ratón perfundido aislado. Se describen métodos para la perfusión del corazón, polysome perfiles y análisis de las fracciones polysome mRNAs, miRNAs y el proteoma polysome.

Resumen

Estudios en cambios dinámicos en la traducción de la proteína requieren métodos especializados. Aquí examinamos cambios en las proteínas recién sintetizadas en respuesta a la isquemia y reperfusión con el corazón de ratón perfundido aislado juntado con perfiles polysome. Para entender más los cambios dinámicos en la traducción de la proteína, caracteriza los mRNAs que fueron cargados con los ribosomas citosólicas (Polirribosomas o polisomas) mitocondriales polisomas se recuperó y en comparación con la distribución de mRNA y proteína en la fracciones de alta eficiencia (numerosos ribosomas ARNm), baja eficiencia (menos ribosomas) mitocondriales polisomas, y las fracciones no traducir. también puede asociar miRNAs mRNAs que se están traduciendo, reduciendo así la eficiencia de la traducción, examinamos la distribución de los miRNAs a través de las fracciones. La distribución de proteínas, mRNAs y miRNAs fue examinada bajo condiciones perfusión basals, al final de 30 minutos de isquemia global sin flujo y después de 30 minutos de la reperfusión. Aquí presentamos los métodos utilizados para llevar a cabo este análisis, en particular, el enfoque de optimización de la extracción de la proteína de la gradiente de sacarosa, ya que esto no se ha descrito antes y algunos resultados representativos.

Introducción

El corazón responde a la lesión de isquemia (I) y (R) la reperfusión de manera dinámica. Sin embargo, hay poca penetración en cambios agudos en la síntesis de proteínas durante la respuesta. Para abordar esto, aprovechamos el método bien establecido de polysome perfiles1 para identificar los cambios en la abundancia de proteínas que reflejan la redistribución de los ribosomas y factores reguladores traslacionales de cytosol a polisomas, y la aumento de las proteínas recién sintetizadas (NSPs). En el marco de I / R, el aumento en la síntesis de proteínas nuevas se produce en un marco de tiempo que es inconsistente con la transcripción de mRNAs nuevo2; Además, la discordancia entre los niveles de expresión de mRNA y proteína abundancia ha sido reportado3. Por estas razones, hemos optado por analizar los cambios en el proteoma dinámico como se refleja por la traducción de proteínas. Para ello, cuantificar el mRNA en las fracciones polysome y analizar la composición de la proteína en las fracciones polysome. Por último, porque microRNAs (miRs) regulan la disponibilidad de los mRNAs para la traducción y puede interferir con la eficacia de la proteína traducción4,5, examinamos la distribución de miRs en las fracciones polysome, centrándose en la respuesta a me / r.

Optamos por utilizar el modelo de perfusión en ratones aislados Langendorff y tejido cosechada bajo condiciones basales de perfusión continua, después de isquemia caudal global de 30 minutos y después de 30 min de isquemia seguida de 30 minutos de la reperfusión. A continuación solubilizado el tejido del corazón y separa polisomas sobre un gradiente de sacarosa, seguido del análisis proteómico y detección selectiva de mRNAs y miRNAs mediante PCR y microarrays, respectivamente. Esta combinación de métodos representa un enfoque poderoso para entender el proteoma dinámico, que permite la detección simultánea de MARN, miRNA y NSPs, así como la redistribución de las proteínas reguladoras, miRNA y mRNA entre fracciones de nontranslating, baja eficiencia polisomas y polisomas de alta eficiencia (ver figura 1). Penetraciones en la regulación dinámica de este proceso se extenderá por más análisis de la fosforilación de factores reguladores claves eIF2α como mTOR. Continuación se describen estos pasos individuales en detalle.

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Protocolo

Todos los estudios en animales fueron realizados de acuerdo con las directrices y aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité uso de Cedars-Sinai Medical Center.

1. Langendorff perfusión del corazón de ratón

  1. Langendorff perfusión del corazón de ratón con isquemia y reperfusión
    1. Administración intraperitoneal pentobarbital de sodio 70 mg/kg para el ratón adulto (8 semanas de edad, varón, C57BL6/j). Confirmar la anestesia profunda por falta de retiro a los pies, pizca.
    2. Anticoagulate con heparina intraperitoneal 500 U/kg.
    3. Abre el cofre por medio de incisión esternal. Abrir el diafragma y corte a lo largo del borde costero al eje axilar anterior. Cortan el eje axilar anterior hasta la extremidad delantera para abrir completamente la caja torácica. Después, visualizando el corazón, abrazadera de la aorta ascendente con pinzas y suprimir rápidamente el corazón. La muerte es por exsanguinación. Coloque el corazón en frío Krebs (NaCl 6,9 g/L, KCl 0,35 g/L, NaHCO3 2,1 g/L, KH2PO4 0.16 g/L, MgSO4 0,141 g/L, glucosa 2 g/L y CaCl2 0,373 g/L).
    4. Canule la aorta con una aguja de punta Roma y perfusión del corazón retrogradely con solución de Krebs en el modo de presión constante.
    5. Después de un período de estabilización de 15 minutos, someter el corazón a una isquemia global del caudal durante 30 min seguido de reperfusión durante 30 minutos.
    6. Cosecha de corazones después de 15 min de la perfusión basal, después de 30 min de isquemia o después de 30 min de reperfusión. Recorte de las aurículas y rápido-congele el tejido en nitrógeno líquido.
    7. Almacenar a-80 ° C hasta su uso

2. tejido homogeneización, solubilidad y densidad de sacarosa gradiente sedimentación

  1. Preparación de gradiente
    1. Preparar 2 soluciones (15% y 50%) de sacarosa 100 mL, mezclar 4 mL de NaCl 2.5 M;
      0,8 mL MgCl2 1,25 M; 1 mL de Tris-HCl 1 M, pH 7,5; 15 g o 50 g de sacarosa (15% y el 50%, respectivamente); agua ultrapura para llegar a 100 mL; y xileno cyanol (0,02 mg/mL) a la solución de 15% de color
    2. Filtrar cada solución (filtros de 0,22 μm)
    3. El día que el gradiente debe ser utilizado, preparar 40 mL de cada solución de sacarosa y añadir cicloheximida al alcanzar la concentración final de 100 μg/mL de cada solución
      1. Utilizar un gradiente maker para preparar una mezcla entre las soluciones de sacarosa de 15% y 50%
      2. Llene el compartimiento izquierdo con 5 mL de la gradiente de sacarosa al 15%
      3. Llene el compartimiento derecho con el gradiente de sacarosa al 50%
      4. Abrir el grifo y encienda la bomba para remover los dos pequeños compartimientos con agitador magnético
      5. Uso un tubo relacionado con la segunda llave para permitir que la solución de sacarosa mezclada de flujo en un tubo de ultra centrifugación con paredes delgadas. Volumen final será aproximadamente de 10 mL.
    4. Mantener los gradientes a 4 ° C (durante la noche si es necesario, pero no más de largo)
  2. Homogeneización del tejido cardíaco
    1. Homogeneizar el corazón fresco o congelado con un polytron en tampón de lisis filtrada (modificado para el fraccionamiento de gradiente de sacarosa) contiene 100 mM KCl, 20 mM Tris, pH 7,5, 5 mM de MgCl2, 0,4% NP-40. Incluyen la cicloheximida 100 μg/mL para mantener la estructura polysome, inhibidor de Rnasa de U 0,1 y coctel inhibidor de la proteasa (1 tableta de 50 mL).
    2. Incubar el lisado de hielo por 15 minutos.
    3. Centrifugue a 18.000 x g durante 15 min a 4 ° C para eliminar el material insoluble y recoger el sobrenadante.
    4. Reserva 50 μL para la determinación de proteínas, aislamiento de RNA y RNA integridad análisis (ver figura 2).
    5. El sobrenadante (500 – 100 μL) de la capa en la parte superior los gradientes y balancear los tubos con tampón de lisis.
  3. Sedimentación y colección de fracciones
    1. Realizar ultracentrifugación durante 120 min a 37.000 rpm a 4 ° C en un rotor que hace pivotar del cubo. Según el fabricante, esto corresponde a 228.000 x g en radio máxima.
    2. Recoger cada gradiente como 17 fracciones (fracción de alrededor de 600 μL) en tubos de microcentrífuga con monitorización continua de la absorbancia a 254 nm (OD254).
    3. Programa el colector de fracciones como sigue:
      1. Deseche los primeros 3 minutos de colección (correspondiente al líquido contenido en los tubos antes de la pendiente)
      2. De 4 a 19 min, se recogerán las fracciones a la velocidad de 1 mL/min en 17 fracciones.
    4. Coloca las fracciones en el hielo tan pronto como cada uno se recoge. Congelar las muestras a-80 ° C, si ellos no se procesan inmediatamente. Un típico seguimiento densitométrico UV del gradiente que se recoge se muestra en la figura 1.

3. aislamiento y análisis de los mRNAs de Polysome y fracciones Nontranslating

  1. Extracción de ARNm
    1. Descongelar las fracciones en el hielo, si fueran flash-congeladas después de la recolección
    2. Transfiera 200 μL de cada fracción a un tubo nuevo
      Nota: En este paso, dos o más fracciones consecutivas pueden ser agrupados juntos. Se debe hacer cuidadosamente después de analizar el gráfico de254 de OD por lo que no se mezclan fracciones polysome y no polysome.
    3. Añadir 10 ng de luciferase RNA como control interno para cada muestra de propósito de la normalización.
      Nota: Cartillas de Luciferase deben utilizarse como un control interno para normalizar los resultados.
    4. Agregar 700 μl del reactivo de extracción de RNA (solución monofásica de fenol con isotiocianato de guanidina; véase Tabla de materiales) a cada tubo. Mezclar bien e incubar los tubos por 5 min a TA (temperatura ambiente).
    5. Añadir 140 μl cloroformo y vortex por 15 s. Incubar durante 2-3 min a TA.
    6. Centrifugar las muestras durante 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
    7. Cuidadosamente transferir la fase acuosa superior a un tubo nuevo.
    8. Puesto que el contenido de RNA de las fracciones no es alto, añadir 10 μg de glucógeno como portador a cada tubo.
    9. Añadir 350 μl isopropanol a cada tubo. Mezclar bien e incubar a-20 ° C durante 1 hora aumentar el rendimiento.
    10. Centrifugar 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
    11. Deseche el sobrenadante y añadir etanol μl 700 75% para lavar el pellet de RNA.
    12. Centrifugar durante 5 min a 7.500 x g a 4 ° C.
    13. Eliminar el etanol y Airee el pellet seco durante 10-15 minutos.
      Nota: Sobre-secar el pellet de RNA evitará su solubilidad completa en agua.
    14. Resuspender el precipitado de RNA en 50 μL de ARNasa-libre ultrapuro H2O.
    15. Incubar las muestras durante 10 min a 55 ° C.
    16. Utilice 2 μL de cada muestra para medir la calidad y cantidad del ARN extraído y guarde el resto a-80 ° C.
  2. QPCR y reversa de la transcripción
    1. Utilizar 4 μL de cDNA síntesis de transcripción reversa kit (véase Tabla de materiales) para una reacción de 20 μL. Preparar el supermix según el número de muestras. Transferir el volumen requerido a cada tubo y añadir 5 μL de la entrada de RNA a cada tubo. Este volumen puede ser corregido para ser relevantes para la gama de las condiciones de trabajo de Taq polimerasa.
    2. Incubar los tubos en un termociclador con el siguiente programa recomendado por el fabricante: 5 min a 25 ° C, transcripción reversa de 20 min por 20 min a 46 ° C y la inactivación de la transcriptasa reversa durante 1 min a 95 ° C.
    3. Ejecute qPCR con el programa optimizado para cada par de primers.
      Nota: Para detectar la presencia de ciertos mRNAs en fracciones, igual volumen de cada fracción (del ARN aislado) puede usarse para reversa de la transcripción.
  3. Análisis de los resultados
    1. Utilizar el valor de Ct de gene del interesado y la luciferasa para calcular los valores de Ct de delta
    2. Expresar cada delta fracción valor Ct como el porcentaje del valor total de mRNA dentro de todas las fracciones para visualizar la distribución del mRNA a través de las diferentes fracciones (tabla 1)

4. aislamiento y análisis de los miRNAs de Polysome fracciones y fracciones Nontranslating

  1. Extracción de ARNm y miRNA
    Nota: Este protocolo sigue las instrucciones del fabricante, con algunos cambios.
    1. Descongelar el glucógeno y el punto de control. Mantener en hielo.
    2. Agregar 700 μl del reactivo de extracción de miRNA a 200 μL de la muestra combinada.
    3. Añadir 1 μg/μl de glucógeno y homogeneizarla con la pipeta. Incubar por 5 min a temperatura ambiente.
    4. Añadir 3,5 μl de 1.6 x 108 spike en el control y se mezcla.
    5. Añadir 200 μL de cloroformo y agitar durante al menos 15 segundos.
    6. Incubar 3 min a temperatura ambiente.
    7. Centrifugar a 12.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
    8. Usando una pipeta, transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL. Deseche las fases media y final.
    9. Añadir 1,5 volumen x de etanol 100% al sobrenadante y se mezcla.
    10. Transferencia de 700 μl de esta mezcla a la columna de extracción de miRNA y centrifugar a máxima velocidad por 15 s en RT y descartar el paso; Repita este paso con cualquier muestra restante.
    11. Agregar 700 μl de tampón 1 a la columna y centrifugar a máxima velocidad por 15 s en RT; Deseche el flujo a través.
    12. Añadir 500 μl de tampón 2 a la columna y centrifugar a máxima velocidad por 15 s en RT; Deseche el flujo a través.
    13. Añadir 500 μl de etanol al 80% a la columna y centrifugar a máxima velocidad durante 2 min a temperatura ambiente; Deseche el flujo a través.
    14. Transferencia de la columna para un nuevo 2 mL destapado del tubo, abra la tapa y centrifugar a temperatura ambiente durante 5 minutos a toda velocidad; Deseche el flujo a través.
    15. Añadir 16 μl de agua libre de ARNasa a la columna y centrifugar a máxima velocidad durante 1 min a RT. Mantenga el efluente en el hielo o almacenar a-80 ° C para futuros análisis.
      Nota: Dos microlitros de cada muestra pueden utilizarse para el análisis de OD.
  2. Transcripción reversa
    1. Preparar en el hielo. Para cada reacción de RT-PCR de 20 μl, añadir 4 μL del buffer de RT de miRNA, 2 μl de ácidos nucleicos, 9 μl de RNA total, 2 μl de enzima y 3 μl de agua libre de ARNasa; mézclelo y desactivación brevemente.
    2. Establecidas en el termociclador:
      37 ° C por 60 minutos;
      95 ° C por 5 min;
      4 ° C se mantenga.
    3. Saque los tubos en el termociclador y añadir 200 μL de agua libre de ARNasa. Almacenar a-20 ° C o proceder a la PCR en tiempo real.
  3. PCR en tiempo real
    Nota: Este protocolo sigue 96 placa bien. Preparar la mezcla de reacción sobre hielo.
    1. Preparar la mezcla de reacción de PCR y añadir cDNA (de miRNAs arriba) según el rango aceptado por el protocolo. Reacciones múltiples se pueden preparar en lote.
    2. Agregar un total de 25 μl de la mezcla PCR + cDNA en cada pozo.
    3. Selle la placa con un sello de placa óptica.
    4. Centrifugar la placa durante 1 min a 1.000 x g a temperatura ambiente.
    5. Programa de la cycler en tiempo real como sigue:
      Paso de la activación inicial a 95 ° C durante 15 min;
      Paso 3 ciclo: desnaturalización a 94 ° C por 15 s; recocido a 55 ° C por 30 s; extensión a 70 ° C para 30 s (realizar la recopilación de datos de fluorescencia); Añadir 40 ciclos;
      Curva de fusión según defecto cycler.
  4. Análisis comparativo
    1. Ejemplo de normalización (ver tabla 2):
      1. Encontrar el valor mínimo de SCM.
      2. Normalizar todos los valores de la SCM a este mínimo.
      3. Restar este valor de los valores de Ct de miRNAs de interés (MOI) y el gene de la referencia (REF).
      4. Analizar los datos utilizando la fórmula 2-ΔCt .

5. análisis proteómico de

  1. Extracción de proteínas de fracciones polysome
    1. Combinar fracciones sacarosa recogidos en tres fracciones finales. Marcar las fracciones como pesado (polisomas de alta eficiencia en los fracciones 4, 5, 6 y 7 con la mayor concentración de sacarosa, parte inferior del tubo del gradiente), luz (polisomas de baja eficiencia en la fracción combinada 8, 9, 10 y 11; media de la tubo de gradiente) y no traducir (fracciones combinados 12, 13, 14 y 15 con la menor concentración de sacarosa, parte superior del tubo del gradiente). Realizar análisis de proteína en fracciones agrupadas.
    2. Preparar 100% stock de ácido tricloroacético (TCA) y almacenar a 4 ° C en oscuridad. Mezclar 0,5 mL de la muestra con 60 μL de 100% TCA e incubar a-20 ° C durante la noche en la oscuridad.
      Nota: Use tubos de retención de proteína baja 1,5 mL (véase Tabla de materiales).
    3. Después de la incubación durante la noche, descongelar la muestra en hielo y centrifugue a 15.000 x g, 4 ° C por 30 min descartar sobrenadante.
      Nota: 100 μg de proteínas totales en muestra da pellet proteína visible en la parte inferior del tubo.
    4. Pre-enfriar acetona en congelador de-20 ° C. Añadir 0.5 mL de acetona fría a la pelotilla de la proteína y centrifugar a 15.000 x g, 4 ° C por 15 minutos descartar sobrenadante. Repita este paso dos veces.
    5. Secar el pellet. Resuspender el precipitado en 360 μl de tampón de Tris-HCl 50 mM (pH 8).
      Nota: Si es necesario, utilice un sonicador de pulso para Resuspender el precipitado.
    6. Agregar 40 μl de 0,1 M dithiothreitol (concentración final 10 mM) e incubar a 55 º C en agitador para 45 min añadir 50 μl de solución 0,15 M Yodoacetamida (concentración final 17 mM) e incubar a temperatura ambiente en un agitador durante 30 minutos en oscuridad.
    7. Preparar la solución de tripsina: 20 μg de la tripsina de resuspender en 100 μl 50 mM de bicarbonato de amonio. Añadir volumen correspondiente de solución de tripsina a la muestra a 1:50 (w/w) tripsina: relación, asegúrese de que el pH es 8 e incubar en agitador a 37 ° C durante la noche.
      Nota: Agregar bicarbonato de amonio de 1 M para llevar el pH a 8.
    8. Después de la digestión de la tripsina, enfriar la muestra, centrifugar brevemente en centrífuga de banco, Añadir ácido fórmico al 10% a pH 2-3 para apagar la actividad de la tripsina y proceder con la muestra de la desalación.
      Nota: Use placa μ-elución para muestra de la desalación.
    9. Condición del sorbente en los pozos de 96 placa bien con 200 μL de metanol mediante vacío tres veces seguido por acondicionado 200 μL de ácido fórmico de 0.1% tres veces. Muestra la carga y realizar un lavado de la muestra con 200 μL de ácido fórmico de 0.1% tres veces. Eluir la muestra con 100 μl de ácido fórmico de 50% acetonitrile/0.1% dos veces en el tubo de 0,5 mL de retención baja en proteínas.
      Nota: Eluir la muestra lentamente en un principio usando gravitación seguidas de bajo vacío.
    10. Evaporar muestra eluyente hasta la sequedad utilizando concentrador y o directamente llevar a cabo análisis de espectrometría de masas o tienda a-80 ° C hasta su uso.
  2. Análisis de espectrometría de masas
    1. Reconstituir cada pellet (consistiendo en los péptidos trípticos) en 50 – 100 μl e inyectar 1 μl de espectrómetro de masas.
      Nota: Optimizar la reconstitución y la inyección de volúmenes para obtener intensidad máxima LC/MS/MS de la señal. En nuestro caso, la señal máxima (total actual del ion; TIC) en el corazón de la exploración estaba en gama de 1E8 a 2E9.
    2. Utilizar una trampa columna C18 (300 μm i.d. x 5 mm, 5 μm, 100Å) seguido por la separación de péptidos mediante columna C18 (75 μm i.d. x 250 mm, 2 μm, 100Å) con un ajuste de la tasa de flujo en conjunto la temperatura capilar nano-fuente de 300 nL/min a 275 ° C y la tensión de aerosol a 2 kV.
    3. Aplicar un degradado lineal de 5 – 35% B por 90 min, B 35 – 95% por 3 min, en 95% B por 7 min y equilibrar a 5% B durante 25 minutos (r: 0,1% ácido fórmico/agua y B: 0,1% ácido fórmico en acetonitrilo). Adquirir espectros MS2 para los 15 iones de intensidad más alto de cada exploración de MS1 usando modo de CID. Espectrometría de masas en uso 3 réplicas por cada muestra analizada.
      Nota: Optimizar y utilizar las condiciones experimentales y los parámetros que son adecuados para sus muestras en el instrumento particular espectrometría de masas. Los condiciones/parámetros mencionados en la sección 5.2. fueron utilizados y optimizados en nuestro laboratorio.
  3. Identificación/cuantificación de proteína
    1. Tras el análisis de espectrometría de masas, convertir el crudo espectros mzXML compatible utilizando el software de MSConvert (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).
    2. Enviar los archivos convertidos en motor de búsqueda SEQUEST con los criterios de búsqueda, por ejemplo, UniProtKB/Swiss-Prot ratón base de datos (más actualizada canónico revisado); digerir la enzima utilizando tripsina (después de KR /-); con 2 divisiones perdidas; gama total de precursor: 400 a 4.500 amu; modificación estática: carbamidomethyl (C) 57,021465 amu; tolerancia de masa de péptidos: 50 ppm; fragmento de masa tipo: monoisotopic.
      Nota: Pueden utilizar otra proteína base de datos búsqueda motores y datos de tuberías. Si utiliza la base de datos para por ejemplo, la rata, que es menos completa que las bases de datos para el ratón y humanos, puede que necesite buscar contra el ratón (o humanos) bases de datos para aumentar la cobertura del proteoma. En este caso, redundancia en los nombres de proteína tendrá que eliminarse.
    3. Realizar un análisis de la búsqueda. Establezca los filtros para ver los datos. Por ejemplo, establecer una probabilidad de proteína mínimo (umbral de proteína) como el 95% o 99%, es decir, se mostrará sólo las proteínas para que un análisis estadístico implica 95% o 99% de probabilidad de estar presente en la muestra. Establecer el filtro umbral del péptido (por ejemplo, 95%), es decir, una probabilidad mínima que se utilizará en la determinación de si un espectro identifica un péptido. Seleccionar el número mínimo de péptidos que van a determinar si una proteína está presente (se recomienda 2 péptidos como mínimo para identificación de proteínas).
    4. Evaluar las proteínas identificadas por calidad/cantidad. Garantizar que los péptidos proteotypic se utilizan para la cuantificación. Si se identifica isoforma asegurar es base en la observación de un péptido tríptico conformado por una secuencia de aminoácidos única para la isoforma específica. Cualquier proteínas "similares" o hipotéticas deben someterse a la comparación para ver si los péptidos que corresponden a una proteína conocida.

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Resultados

Análisis del mRNA
resultados de mRNA se pueden expresar como una distribución de un determinado mRNA en cada fracción (Figura 3A); para la cuantificación, combinar fracciones traducción polyribosomal y comparar a la fracción no traducir (figura 3B), presentando un cociente de abundancia del mRNA en la traducción de fracciones nontranslating. Información adicional es obtenida mediante el examen de las fracciones de alt...

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Discusión

Polysome perfil análisis permite el estudio de la traducción de proteínas mediante el análisis del estado traslacional de un mARN específico o el transcriptoma conjunto6,7. También es de gran ayuda cuando traducción local debe estudiarse como sinaptosomas8. Tradicionalmente, este método implica la separación de mono - y Polirribosomas y los mRNAs asociados a un gradiente de sacarosa que podría acoplarse con genómica o proteómica técnicas p...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

HL112730 NIH P01 (trapo, JVE), NIH R01 HL132075 (trapo, JVE), centro del corazón de la mujer de Barbra Streisand (trapo, JVE), Dorothy y Phillip Lyon E. Sillón en Cardiología Molecular (GAR), Erika Glazer dotado Cátedra salud del corazón de la mujer (JVE) y la Academia Checa de Ciencias Apoyo institucional RVO: 68081715 (MS).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
PentobarbitalVortech Phamaceuticals9373para eutansia
HeparinSagent103424utilizado en la preparación de Langendorff
PinzasFine Science Tools91110-10utilizado para colgar el corazón
Sistema LangendorffRadnoti + hecho en casan/aUn sistema de "cuatro corazones" que consta de vidrio soplado personalizado, tubos y baños de agua
NaClSigmaS7653-5KGTampón Krebs y gradiente de sacarosa
KClTampón SigmaP5405Krebs y tampón de lisis
KH2PO42SigmaP-5504Tampón Krebs Tampón
MgSO4SigmaM7774-500GTampón Krebs
GlucosaSigmaG5767Búfer de Krebs
CaCl2SigmaC1016-500GTampón Krebs
Polvo de sacarosaSigmaS0389-1KGGradiente de sacarosa
MgCl2Sigma208337Gradiente de sacarosa y tampón de lisis
Tris-baseSigmaT1503-1KGGradiente de sacarosa y tampón de lisis
Xileno CianolSigmaX-4126Gradiente de sacarosa
CicloheximidaSigma-aldrich239763Gradiente de sacarosa y tampón de lisis
RNaseOUTLife TechnologiesC00019Inhibidor de ARNasa para tampón de lisis
Igepal CA-360 (NP40)SigmaI3021Tampón de lisis
Inhibidor de la proteasa Comprimidos de cóctel, sin EDTARoche5056489001
Tubo, Pared Delgada, Ultra-Transparente, 13.2 mL, 14 mm x 89 mmBeckman Coulter344059
UltracentrífugaBeckmanLE-80KUltracentrifugación de los gradientes
RotorBeckmanSW41Ultracentrifugación de los gradientes
Biologic LP (bomba)Biorad731-8300Fraccionamiento de los gradientes
BioFrac Biorad741-0002Fraccionamiento de los gradientes
Tubos de microcentrífuga Eppendorf RNA/DNA LoBind, tubo de 2 mLSigmaZ666513-100EAFracción de gradiente y extracción de ARN
Reactivo TRIzol Tecnologíasde vidaAM9738Extracción de ARN
Luciferasa ARN de controlPromegaL4561Extracción de ARN
CloroformoFisher ScientificC606-4ARN extracción
Glucógeno de grado ARNThermo Fisher ScientificR0551Extracción de ARN
IsopropanolSigmaI9516Extracción de ARN
Etanol SigmaE7023-1LExtracción de
ARN iScript Kit de síntesis de ADNcBioRad170-8891Transcripción inversa
iTaq Universal SYBR Green SupermixBioRad175-5122PCR cuantitativa
miRNeasy Micro Kit (50)Qiagen217084Kit para el aislamiento total de ARN
miScript II RT Kit (50)Qiagen218161Kit para transcripción inversa de miARN
miScript Sybr Green PCR Kit (200)Qiagen218073Kit para el análisis de la expresión de PCR en tiempo real de miRNAs
Centrífuga 5424REppendorfPara la centrifugación de tubos de 1,5 mL o 2,0 mL a diferentes temperaturas. Velocidad máxima - 21130 x g
Centrífuga 5810REppendorfPara la centrifugación de placas PCR en tiempo real a diferentes temperaturas. Velocidad máxima: 2039 x g
My Cycler TermocicladorBio-RadPara transcripción inversa
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal CyclerBio-RadPara análisis de PCR en tiempo real
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in ControlQiagen219610Para el control de calidad del aislamiento de ARN
Placas de PCR de 96 pocillos de carcasa dura, de perfil bajo, pared delgada, con faldón, verde/transparenteBio-RadHSP9641Para el análisis de PCR en tiempo real
Microseal 'B' Película de sellado de placas de PCR, adhesivo, ópticaBio-RadMSB1001Para el sellado de placas de PCR en tiempo real
Research plus Pipeta monocanal, gris; 0.5-10 µ LEppendorfUX-24505-02Para pipetear
Pipetas PIPETMAN Classic, P20GilsonF123600GPara pipetear
Pipetas PIPETMAN Classic, P200GilsonF144565Para pipetear
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipeta 100-1000 µ LGilson17011782para pipetear
Glucógeno, grado de ARNThermo Fisher ScientificR0551Mejora la eficiencia del aislamiento total de ARN
Posi-Click 1,7 mL Tubos, color naturalDenvilleC2170Aislamiento y almacenamiento de ARN; mezcla de reactivos
Tubos de ciclo térmico -0,2 mL Tapas individuales, tubos estándar de 0,2 mL con ópticaDenvilleC18098-4 (1000910)Reacción de transcripción inversa
Sharp 10 Puntas de barrera de precisiónDenvilleP1096-FRPara pipeteo
Sharp 20 Puntas de barrera de precisiónDenvilleP1121Para pipeteo
Sharp 200 Puntas de barrera de precisiónDenvilleP1122Para pipeteo
Puntas LTS 1 mL FiltroRaininRT-L1000FPara pipeteo
miScript Primer Assay ( 200)Qiagen(cambia según el miRNA)Para elanálisis de PCR en tiempo real
Gradient Master ver 5.3 Model 108BioComp InstrumentsPara la preparación de gradientes de sacarosa
, ácido tricloroacéticoSigma AldrichT6399
acetonaSigma Aldrich650501
clorhidrato de Tris, AmrescoM108
ditiotreitolFisher ScientificBP172
yodoacetamidaGbiosciencesRC-150
grado de secuenciación tripsina modificada, porcinoPromegaV5111
bicarbonato de amonioBDHBDH9206
ácido fórmico, Optima LC/MSFisher ChemicalA117
metanol, Optima LC/MSFisher ChemicalA454
acetonitrilo, Optima LC/MSFisher ChemicalA996
Tubos LoBind de proteína 0,5 mLEppendorf AG22431064
tubos Protein LoBind de 1,5 mLEppendorf AG22431081
HLB y micro; Placa de elución 30 µ mOasis186001828BA
Concentrador SpeedVacThermo ScientificSavant SPD2010
sonicadorQsonicaOasis180
centrífugaThermo ScientificSorvall Legend micro 21R
Columna de trampa LC PepMap 100 C18Thermo Scientific160454
LC columna de separación PepMap RSLC C18Espectrómetrode masas Thermo Scientific 164536
Thermo ScientificOrbitrap Elite espectrómetro
MSConvert softwareProteoWizard Toolkit
Software Sorcerer-SEQUESTSage-N Research, Inc.
, , , de masas con trampa de iones

Referencias

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