Aquí presentamos un protocolo para realizar polysome perfilado en el corazón de ratón perfundido aislado. Se describen métodos para la perfusión del corazón, polysome perfiles y análisis de las fracciones polysome mRNAs, miRNAs y el proteoma polysome.
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Artículo de método
Proteómicos y miRNA análisis de polisomas de corazón de ratón aislados después de Langendorff la perfusión
En este artículo
Resumen
Resumen
Estudios en cambios dinámicos en la traducción de la proteína requieren métodos especializados. Aquí examinamos cambios en las proteínas recién sintetizadas en respuesta a la isquemia y reperfusión con el corazón de ratón perfundido aislado juntado con perfiles polysome. Para entender más los cambios dinámicos en la traducción de la proteína, caracteriza los mRNAs que fueron cargados con los ribosomas citosólicas (Polirribosomas o polisomas) mitocondriales polisomas se recuperó y en comparación con la distribución de mRNA y proteína en la fracciones de alta eficiencia (numerosos ribosomas ARNm), baja eficiencia (menos ribosomas) mitocondriales polisomas, y las fracciones no traducir. también puede asociar miRNAs mRNAs que se están traduciendo, reduciendo así la eficiencia de la traducción, examinamos la distribución de los miRNAs a través de las fracciones. La distribución de proteínas, mRNAs y miRNAs fue examinada bajo condiciones perfusión basals, al final de 30 minutos de isquemia global sin flujo y después de 30 minutos de la reperfusión. Aquí presentamos los métodos utilizados para llevar a cabo este análisis, en particular, el enfoque de optimización de la extracción de la proteína de la gradiente de sacarosa, ya que esto no se ha descrito antes y algunos resultados representativos.
Introducción
El corazón responde a la lesión de isquemia (I) y (R) la reperfusión de manera dinámica. Sin embargo, hay poca penetración en cambios agudos en la síntesis de proteínas durante la respuesta. Para abordar esto, aprovechamos el método bien establecido de polysome perfiles1 para identificar los cambios en la abundancia de proteínas que reflejan la redistribución de los ribosomas y factores reguladores traslacionales de cytosol a polisomas, y la aumento de las proteínas recién sintetizadas (NSPs). En el marco de I / R, el aumento en la síntesis de proteínas nuevas se produce en un marco de tiempo que es inconsistente con la transcripción de mRNAs n....
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Protocolo
Todos los estudios en animales fueron realizados de acuerdo con las directrices y aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité uso de Cedars-Sinai Medical Center.
1. Langendorff perfusión del corazón de ratón
-
Langendorff perfusión del corazón de ratón con isquemia y reperfusión
- Administración intraperitoneal pentobarbital de sodio 70 mg/kg para el ratón adulto (8 semanas de edad, varón, C57BL6/j). Confirmar la anestesia profunda por falta de retiro a los pies, pizca.
- Anticoagulate con heparina intraperitoneal 500 U/kg.
- Abre el cofre por medio de incisión esternal. Abri....
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Resultados
Análisis del mRNA
resultados de mRNA se pueden expresar como una distribución de un determinado mRNA en cada fracción (Figura 3A); para la cuantificación, combinar fracciones traducción polyribosomal y comparar a la fracción no traducir (figura 3B), presentando un cociente de abundancia del mRNA en la traducción de fracciones nontranslating. Información adicional es obtenida mediante el examen de las fracciones de alt.......
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Discusión
Polysome perfil análisis permite el estudio de la traducción de proteínas mediante el análisis del estado traslacional de un mARN específico o el transcriptoma conjunto6,7. También es de gran ayuda cuando traducción local debe estudiarse como sinaptosomas8. Tradicionalmente, este método implica la separación de mono - y Polirribosomas y los mRNAs asociados a un gradiente de sacarosa que podría acoplarse con genómica o proteómica técnicas p.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
HL112730 NIH P01 (trapo, JVE), NIH R01 HL132075 (trapo, JVE), centro del corazón de la mujer de Barbra Streisand (trapo, JVE), Dorothy y Phillip Lyon E. Sillón en Cardiología Molecular (GAR), Erika Glazer dotado Cátedra salud del corazón de la mujer (JVE) y la Academia Checa de Ciencias Apoyo institucional RVO: 68081715 (MS).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Pentobarbital | Vortech Phamaceuticals | 9373 | para eutansia |
| Heparin | Sagent | 103424 | utilizado en la preparación de Langendorff |
| Pinzas | Fine Science Tools | 91110-10 | utilizado para colgar el corazón |
| Sistema Langendorff | Radnoti + hecho en casa | n/a | Un sistema de "cuatro corazones" que consta de vidrio soplado personalizado, tubos y baños de agua |
| NaCl | Sigma | S7653-5KG | Tampón Krebs y gradiente de sacarosa |
| KCl | Tampón Sigma | P5405 | Krebs y tampón de lisis |
| KH2PO42 | Sigma | P-5504 | Tampón Krebs Tampón |
| MgSO4 | Sigma | M7774-500G | Tampón Krebs |
| Glucosa | Sigma | G5767 | Búfer de Krebs |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | Tampón Krebs |
| Polvo de sacarosa | Sigma | S0389-1KG | Gradiente de sacarosa |
| MgCl2 | Sigma | 208337 | Gradiente de sacarosa y tampón de lisis |
| Tris-base | Sigma | T1503-1KG | Gradiente de sacarosa y tampón de lisis |
| Xileno Cianol | Sigma | X-4126 | Gradiente de sacarosa |
| Cicloheximida | Sigma-aldrich | 239763 | Gradiente de sacarosa y tampón de lisis |
| RNaseOUT | Life Technologies | C00019 | Inhibidor de ARNasa para tampón de lisis |
| Igepal CA-360 (NP40) | Sigma | I3021 | Tampón de lisis |
| Inhibidor de la proteasa Comprimidos de cóctel, sin EDTA | Roche | 5056489001 | |
| Tubo, Pared Delgada, Ultra-Transparente, 13.2 mL, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultracentrífuga | Beckman | LE-80K | Ultracentrifugación de los gradientes |
| Rotor | Beckman | SW41 | Ultracentrifugación de los gradientes |
| Biologic LP (bomba) | Biorad | 731-8300 | Fraccionamiento de los gradientes |
| BioFrac Biorad | 741-0002 | Fraccionamiento de los gradientes | |
| Tubos de microcentrífuga Eppendorf RNA/DNA LoBind, tubo de 2 mL | Sigma | Z666513-100EA | Fracción de gradiente y extracción de ARN |
| Reactivo TRIzol Tecnologías | de vida | AM9738 | Extracción de ARN |
| Luciferasa ARN de control | Promega | L4561 | Extracción de ARN |
| Cloroformo | Fisher Scientific | C606-4 | ARN extracción |
| Glucógeno de grado ARN | Thermo Fisher Scientific | R0551 | Extracción de ARN |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | Extracción de ARN |
| Etanol Sigma | E7023-1L | Extracción de | |
| ARN iScript Kit de síntesis de ADNc | BioRad | 170-8891 | Transcripción inversa |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 175-5122 | PCR cuantitativa |
| miRNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 217084 | Kit para el aislamiento total de ARN |
| miScript II RT Kit (50) | Qiagen | 218161 | Kit para transcripción inversa de miARN |
| miScript Sybr Green PCR Kit (200) | Qiagen | 218073 | Kit para el análisis de la expresión de PCR en tiempo real de miRNAs |
| Centrífuga 5424R | Eppendorf | Para la centrifugación de tubos de 1,5 mL o 2,0 mL a diferentes temperaturas. Velocidad máxima - 21130 x g | |
| Centrífuga 5810R | Eppendorf | Para la centrifugación de placas PCR en tiempo real a diferentes temperaturas. Velocidad máxima: 2039 x g | |
| My Cycler Termociclador | Bio-Rad | Para transcripción inversa | |
| CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | Para análisis de PCR en tiempo real | |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | Para el control de calidad del aislamiento de ARN |
| Placas de PCR de 96 pocillos de carcasa dura, de perfil bajo, pared delgada, con faldón, verde/transparente | Bio-Rad | HSP9641 | Para el análisis de PCR en tiempo real |
| Microseal 'B' Película de sellado de placas de PCR, adhesivo, óptica | Bio-Rad | MSB1001 | Para el sellado de placas de PCR en tiempo real |
| Research plus Pipeta monocanal, gris; 0.5-10 µ L | Eppendorf | UX-24505-02 | Para pipetear |
| Pipetas PIPETMAN Classic, P20 | Gilson | F123600G | Para pipetear |
| Pipetas PIPETMAN Classic, P200 | Gilson | F144565 | Para pipetear |
| Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipeta 100-1000 µ L | Gilson | 17011782 | para pipetear |
| Glucógeno, grado de ARN | Thermo Fisher Scientific | R0551 | Mejora la eficiencia del aislamiento total de ARN |
| Posi-Click 1,7 mL Tubos, color natural | Denville | C2170 | Aislamiento y almacenamiento de ARN; mezcla de reactivos |
| Tubos de ciclo térmico -0,2 mL Tapas individuales, tubos estándar de 0,2 mL con óptica | Denville | C18098-4 (1000910) | Reacción de transcripción inversa |
| Sharp 10 Puntas de barrera de precisión | Denville | P1096-FR | Para pipeteo |
| Sharp 20 Puntas de barrera de precisión | Denville | P1121 | Para pipeteo |
| Sharp 200 Puntas de barrera de precisión | Denville | P1122 | Para pipeteo |
| Puntas LTS 1 mL Filtro | Rainin | RT-L1000F | Para pipeteo |
| miScript Primer Assay ( 200) | Qiagen | (cambia según el miRNA)Para el | análisis de PCR en tiempo real |
| Gradient Master ver 5.3 Model 108 | BioComp Instruments | Para la preparación de gradientes de sacarosa | |
| , ácido tricloroacético | Sigma Aldrich | T6399 | |
| acetona | Sigma Aldrich | 650501 | |
| clorhidrato de Tris | , Amresco | M108 | |
| ditiotreitol | Fisher Scientific | BP172 | |
| yodoacetamida | Gbiosciences | RC-150 | |
| grado de secuenciación tripsina modificada, porcino | Promega | V5111 | |
| bicarbonato de amonio | BDH | BDH9206 | |
| ácido fórmico, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A117 | |
| metanol, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A454 | |
| acetonitrilo, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A996 | |
| Tubos LoBind de proteína 0,5 mL | Eppendorf AG | 22431064 | |
| tubos Protein LoBind de 1,5 mL | Eppendorf AG | 22431081 | |
| HLB y micro; Placa de elución 30 µ m | Oasis | 186001828BA | |
| Concentrador SpeedVac | Thermo Scientific | Savant SPD2010 | |
| sonicador | Qsonica | Oasis180 | |
| centrífuga | Thermo Scientific | Sorvall Legend micro 21R | |
| Columna de trampa LC PepMap 100 C18 | Thermo Scientific | 160454 | |
| LC columna de separación PepMap RSLC C18 | Espectrómetro | de masas Thermo Scientific 164536 | |
| Thermo Scientific | Orbitrap Elite espectrómetro | ||
| MSConvert software | ProteoWizard Toolkit | ||
| Software Sorcerer-SEQUEST | Sage-N Research, Inc. |
Referencias
- Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression. PLoS ONE. 10, e0129750(2015).
- Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A.
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Reimpresiones y permisos
