Artículo de método

Proteómicos y miRNA análisis de polisomas de corazón de ratón aislados después de Langendorff la perfusión

DOI:

10.3791/58079

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29 de agosto de 2018

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1The Smidt Heart Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Advanced Clinical Biosystems Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Institute of Analytical Chemistry of the Czech Academy of Sciences

En este artículo

Resumen

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Aquí presentamos un protocolo para realizar polysome perfilado en el corazón de ratón perfundido aislado. Se describen métodos para la perfusión del corazón, polysome perfiles y análisis de las fracciones polysome mRNAs, miRNAs y el proteoma polysome.

Resumen

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Estudios en cambios dinámicos en la traducción de la proteína requieren métodos especializados. Aquí examinamos cambios en las proteínas recién sintetizadas en respuesta a la isquemia y reperfusión con el corazón de ratón perfundido aislado juntado con perfiles polysome. Para entender más los cambios dinámicos en la traducción de la proteína, caracteriza los mRNAs que fueron cargados con los ribosomas citosólicas (Polirribosomas o polisomas) mitocondriales polisomas se recuperó y en comparación con la distribución de mRNA y proteína en la fracciones de alta eficiencia (numerosos ribosomas ARNm), baja eficiencia (menos ribosomas) mitocondriales polisomas, y las fracciones no traducir. también puede asociar miRNAs mRNAs que se están traduciendo, reduciendo así la eficiencia de la traducción, examinamos la distribución de los miRNAs a través de las fracciones. La distribución de proteínas, mRNAs y miRNAs fue examinada bajo condiciones perfusión basals, al final de 30 minutos de isquemia global sin flujo y después de 30 minutos de la reperfusión. Aquí presentamos los métodos utilizados para llevar a cabo este análisis, en particular, el enfoque de optimización de la extracción de la proteína de la gradiente de sacarosa, ya que esto no se ha descrito antes y algunos resultados representativos.

Introducción

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El corazón responde a la lesión de isquemia (I) y (R) la reperfusión de manera dinámica. Sin embargo, hay poca penetración en cambios agudos en la síntesis de proteínas durante la respuesta. Para abordar esto, aprovechamos el método bien establecido de polysome perfiles1 para identificar los cambios en la abundancia de proteínas que reflejan la redistribución de los ribosomas y factores reguladores traslacionales de cytosol a polisomas, y la aumento de las proteínas recién sintetizadas (NSPs). En el marco de I / R, el aumento en la síntesis de proteínas nuevas se produce en un marco de tiempo que es inconsistente con la transcripción de mRNAs n....

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Protocolo

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Todos los estudios en animales fueron realizados de acuerdo con las directrices y aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité uso de Cedars-Sinai Medical Center.

1. Langendorff perfusión del corazón de ratón

  1. Langendorff perfusión del corazón de ratón con isquemia y reperfusión
    1. Administración intraperitoneal pentobarbital de sodio 70 mg/kg para el ratón adulto (8 semanas de edad, varón, C57BL6/j). Confirmar la anestesia profunda por falta de retiro a los pies, pizca.
    2. Anticoagulate con heparina intraperitoneal 500 U/kg.
    3. Abre el cofre por medio de incisión esternal. Abri....

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Resultados

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Análisis del mRNA
resultados de mRNA se pueden expresar como una distribución de un determinado mRNA en cada fracción (Figura 3A); para la cuantificación, combinar fracciones traducción polyribosomal y comparar a la fracción no traducir (figura 3B), presentando un cociente de abundancia del mRNA en la traducción de fracciones nontranslating. Información adicional es obtenida mediante el examen de las fracciones de alt.......

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Discusión

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Polysome perfil análisis permite el estudio de la traducción de proteínas mediante el análisis del estado traslacional de un mARN específico o el transcriptoma conjunto6,7. También es de gran ayuda cuando traducción local debe estudiarse como sinaptosomas8. Tradicionalmente, este método implica la separación de mono - y Polirribosomas y los mRNAs asociados a un gradiente de sacarosa que podría acoplarse con genómica o proteómica técnicas p.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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HL112730 NIH P01 (trapo, JVE), NIH R01 HL132075 (trapo, JVE), centro del corazón de la mujer de Barbra Streisand (trapo, JVE), Dorothy y Phillip Lyon E. Sillón en Cardiología Molecular (GAR), Erika Glazer dotado Cátedra salud del corazón de la mujer (JVE) y la Academia Checa de Ciencias Apoyo institucional RVO: 68081715 (MS).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
PentobarbitalVortech Phamaceuticals9373para eutansia
HeparinSagent103424utilizado en la preparación de Langendorff
PinzasFine Science Tools91110-10utilizado para colgar el corazón
Sistema LangendorffRadnoti + hecho en casan/aUn sistema de "cuatro corazones" que consta de vidrio soplado personalizado, tubos y baños de agua
NaClSigmaS7653-5KGTampón Krebs y gradiente de sacarosa
KClTampón SigmaP5405Krebs y tampón de lisis
KH2PO42SigmaP-5504Tampón Krebs Tampón
MgSO4SigmaM7774-500GTampón Krebs
GlucosaSigmaG5767Búfer de Krebs
CaCl2SigmaC1016-500GTampón Krebs
Polvo de sacarosaSigmaS0389-1KGGradiente de sacarosa
MgCl2Sigma208337Gradiente de sacarosa y tampón de lisis
Tris-baseSigmaT1503-1KGGradiente de sacarosa y tampón de lisis
Xileno CianolSigmaX-4126Gradiente de sacarosa
CicloheximidaSigma-aldrich239763Gradiente de sacarosa y tampón de lisis
RNaseOUTLife TechnologiesC00019Inhibidor de ARNasa para tampón de lisis
Igepal CA-360 (NP40)SigmaI3021Tampón de lisis
Inhibidor de la proteasa Comprimidos de cóctel, sin EDTARoche5056489001
Tubo, Pared Delgada, Ultra-Transparente, 13.2 mL, 14 mm x 89 mmBeckman Coulter344059
UltracentrífugaBeckmanLE-80KUltracentrifugación de los gradientes
RotorBeckmanSW41Ultracentrifugación de los gradientes
Biologic LP (bomba)Biorad731-8300Fraccionamiento de los gradientes
BioFrac Biorad741-0002Fraccionamiento de los gradientes
Tubos de microcentrífuga Eppendorf RNA/DNA LoBind, tubo de 2 mLSigmaZ666513-100EAFracción de gradiente y extracción de ARN
Reactivo TRIzol Tecnologíasde vidaAM9738Extracción de ARN
Luciferasa ARN de controlPromegaL4561Extracción de ARN
CloroformoFisher ScientificC606-4ARN extracción
Glucógeno de grado ARNThermo Fisher ScientificR0551Extracción de ARN
IsopropanolSigmaI9516Extracción de ARN
Etanol SigmaE7023-1LExtracción de
ARN iScript Kit de síntesis de ADNcBioRad170-8891Transcripción inversa
iTaq Universal SYBR Green SupermixBioRad175-5122PCR cuantitativa
miRNeasy Micro Kit (50)Qiagen217084Kit para el aislamiento total de ARN
miScript II RT Kit (50)Qiagen218161Kit para transcripción inversa de miARN
miScript Sybr Green PCR Kit (200)Qiagen218073Kit para el análisis de la expresión de PCR en tiempo real de miRNAs
Centrífuga 5424REppendorfPara la centrifugación de tubos de 1,5 mL o 2,0 mL a diferentes temperaturas. Velocidad máxima - 21130 x g
Centrífuga 5810REppendorfPara la centrifugación de placas PCR en tiempo real a diferentes temperaturas. Velocidad máxima: 2039 x g
My Cycler TermocicladorBio-RadPara transcripción inversa
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal CyclerBio-RadPara análisis de PCR en tiempo real
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in ControlQiagen219610Para el control de calidad del aislamiento de ARN
Placas de PCR de 96 pocillos de carcasa dura, de perfil bajo, pared delgada, con faldón, verde/transparenteBio-RadHSP9641Para el análisis de PCR en tiempo real
Microseal 'B' Película de sellado de placas de PCR, adhesivo, ópticaBio-RadMSB1001Para el sellado de placas de PCR en tiempo real
Research plus Pipeta monocanal, gris; 0.5-10 µ LEppendorfUX-24505-02Para pipetear
Pipetas PIPETMAN Classic, P20GilsonF123600GPara pipetear
Pipetas PIPETMAN Classic, P200GilsonF144565Para pipetear
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipeta 100-1000 µ LGilson17011782para pipetear
Glucógeno, grado de ARNThermo Fisher ScientificR0551Mejora la eficiencia del aislamiento total de ARN
Posi-Click 1,7 mL Tubos, color naturalDenvilleC2170Aislamiento y almacenamiento de ARN; mezcla de reactivos
Tubos de ciclo térmico -0,2 mL Tapas individuales, tubos estándar de 0,2 mL con ópticaDenvilleC18098-4 (1000910)Reacción de transcripción inversa
Sharp 10 Puntas de barrera de precisiónDenvilleP1096-FRPara pipeteo
Sharp 20 Puntas de barrera de precisiónDenvilleP1121Para pipeteo
Sharp 200 Puntas de barrera de precisiónDenvilleP1122Para pipeteo
Puntas LTS 1 mL FiltroRaininRT-L1000FPara pipeteo
miScript Primer Assay ( 200)Qiagen(cambia según el miRNA)Para elanálisis de PCR en tiempo real
Gradient Master ver 5.3 Model 108BioComp InstrumentsPara la preparación de gradientes de sacarosa
, ácido tricloroacéticoSigma AldrichT6399
acetonaSigma Aldrich650501
clorhidrato de Tris, AmrescoM108
ditiotreitolFisher ScientificBP172
yodoacetamidaGbiosciencesRC-150
grado de secuenciación tripsina modificada, porcinoPromegaV5111
bicarbonato de amonioBDHBDH9206
ácido fórmico, Optima LC/MSFisher ChemicalA117
metanol, Optima LC/MSFisher ChemicalA454
acetonitrilo, Optima LC/MSFisher ChemicalA996
Tubos LoBind de proteína 0,5 mLEppendorf AG22431064
tubos Protein LoBind de 1,5 mLEppendorf AG22431081
HLB y micro; Placa de elución 30 µ mOasis186001828BA
Concentrador SpeedVacThermo ScientificSavant SPD2010
sonicadorQsonicaOasis180
centrífugaThermo ScientificSorvall Legend micro 21R
Columna de trampa LC PepMap 100 C18Thermo Scientific160454
LC columna de separación PepMap RSLC C18Espectrómetrode masas Thermo Scientific 164536
Thermo ScientificOrbitrap Elite espectrómetro
MSConvert softwareProteoWizard Toolkit
Software Sorcerer-SEQUESTSage-N Research, Inc.
, , , de masas con trampa de iones

Referencias

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  1. Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression. PLoS ONE. 10, e0129750(2015).
  2. Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A.

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Perfilado de polisomasextracci n de prote nasprecipitaci n con TCAgradiente de sacarosaultracentrifugaci nan lisis de ARNmisquemia reperfusi n

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