Se describen métodos para aislar caninas neutrófilos de la sangre entera y visualizar la formación neta en vivo neutrófilos mediante microscopía de fluorescencia. También se describe son protocolos para cuantificar la formación neta y citrulinado histona H3 (citH3) expresión usando microscopia de la inmunofluorescencia.
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Artículo de método
In Vitro Formación de la trampa extracelular neutrófilo canino: Análisis dinámico y cuantitativo por microscopía de fluorescencia
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Resumen
Resumen
En respuesta a la invasión de patógenos, neutrófilos liberan trampas extracelulares neutrófilos (redes), que son redes extracelulares de ADN con las histonas y proteínas antimicrobianas. Formación de red excesiva (NETosis) citH3 liberación durante la sepsis se asocia con múltiples disfunción del órgano y la mortalidad en ratones y seres humanos y sus implicaciones en los perros son desconocidos. Aquí, describimos una técnica para aislar caninas neutrófilos de la sangre entera para la observación y cuantificación de NETosis. Plasma rico en leucocitos, generado por sedimentación de dextrano, se separa por medios de separación gradiente de densidad disponible comercialmente y granulocitos recolectaron para la cuenta y las pruebas de viabilidad de la célula. Para observar en tiempo real NETosis en vivo neutrófilos, florescente de la célula y la célula impermeant ácido nucleico fluorescente manchas se agregan a neutrófilos activados por lipopolisacárido (LPS) o forbol 12-miristato 13-acetato (PMA). Con el tiempo se observan cambios en la morfología nuclear y formación de red por microscopía de fluorescencia. In vitro NETosis se caracteriza por co-colocalization sin células ADN de (cfDNA), mieloperoxidasa (MPO) y citrulinado histona H3 (citH3) utilizando un protocolo modificado de immunolabelling doble. Cuantificar objetivamente la neta formación y expresión de citH3 utilizando microscopía de fluorescencia, redes y células citH3-positivas se cuantifican de manera cegada utilizando software disponible. Esta técnica es un análisis específico para evaluar la capacidad en vitro de los neutrófilos caninos a NETosis.
Introducción
Neutrófilos son de breve duración granulocitos responsables de la defensa inicial contra los patógenos invasores. Neutrófilos, reclutados en el sitio de la infección, eliminan microorganismos por fagocitosis, degranulación y generación de oxígeno reactivo (ROS) las especies1. En presencia de bacterias y endotoxinas, neutrófilos liberación neutrófilo extracelular trampas (redes), compuestas de cromatina extracelular decoración con las histonas y las proteínas granulares como elastasa y mieloperoxidasa (MPO)2. Aunque redes tienen propiedades antimicrobianas indispensables, cada vez mayor evidencia experimental y clínica su....
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Protocolo
Todos los métodos aquí descritos fueron aprobados por el institucional Animal cuidado y uso de la Universidad de California, Davis (protocolo número: 18338).
1. sangre
- Extraer 10 mL de sangre desde la vena cefálica o yugular utilizando una aguja de 21 G por la aspiración de la jeringa.
- Para evitar excesiva tensión de esquileo, retire la aguja de la jeringa antes de transferir la sangre en tubos con heparina sódica (USP 75). Invertir suavemente los tubos varias veces para asegurar una mezcla adecuada de anticoagulante y sangre. Busque evidencia de coágulos o agregados de glóbulos rojos antes de colocar las muestras en hie....
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Resultados
Utilizando este protocolo de imágenes de células vivas, los investigadores pueden observar la morfología nuclear, la integridad de la membrana plasmática y la presencia de cfDNA en neutrófilos de vida. Un colorante nuclear impermeant celular tiñe ácidos núcleos rojo en células con membranas celulares dañadas. Otro tinte celular-permeant, etiquetas de los ácidos nucleicos intracelulares en células vivas con membranas intactas de plasma. Los neutrófilos intactas, independientemente de sus t.......
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Discusión
Presentamos aquí un protocolo para observar los cambios en núcleos conformación y cfDNA comunicado en vida canina neutrófilos utilizando un colorante florescente de la célula y un tinte impermeant del celular. La principal ventaja de este ensayo es que permite para la detección en tiempo real de formación red por microscopía de alta resolución en vivo neutrófilos sin fijación de la célula, por lo tanto, proporciona una herramienta sencilla y valiosa para la observación en vitro de neta formación. Puesto que este.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El autor fue financiado por la Morris Animal Foundation (D15CA-907). El estudio fue apoyado por fondos de la Universidad de California, Davis, centro de salud equina y centro de salud de animales de compañía (2016-24-F). Los autores desean reconocer Geena Ng su asistencia con las figuras y Nghi Nguyen para su ayuda con el video.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Dextrano de Leuconostoc spp. | Sigma | 31392 | Peso molecular 450.000 – 650.000 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17144002 | |
| Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato | ThermoFisher Scientific A1285801 | con cationes divalentes | |
| Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato | ThermoFisher Scientific 14190136 | Sin cationes divalentes | |
| E. coli O55:B5 | InvivoGen | ||
| SYTOX Orange Tinción fluorescente de ácido nucleico | ThermoFisher Scientific | S11368 | 5 mM en DMSO; Tinciones en células con membranas permeables |
| SYTO Green 16 Tinción de ácido nucleico fluorescente | ThermoFisher Scientific | S7578 | 1 mM en DMSO; tinciones en células con membranas intactas |
| Amperios de superficie NP-40 | Pierce | 28324 | |
| Cubreobjetos recubiertos de poli-D-lisina | neuVitro | H-12-pdl | 12 mm de diámetro |
| Anticuerpo antihistona H3 anticitrulinado | Abcam | Ab5103 | |
| Fragmento de Fab anti-conejo de cabra no conjugado | Jackson ImmunoResearch | 111-007-003 | Especificidad: IgG (H+L) |
| Anticuerpo anti-mieloperoxidasa | Dako | A0398 | |
| 4,6-diamidino-2-fenilina (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 |
Referencias
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs. Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 ....
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Reimpresiones y permisos
