Artículo de método

Caracterización de la ruptura de la membrana plasmática mediado MLKL en Necroptosis

DOI:

10.3791/58088

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7 de agosto de 2018

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1Department of Structural Biology, St. Jude Children's Research Hospital, 2Department of Chemical Biology and Therapeutics, St. Jude Children's Research Hospital, 3Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Divulgamos los métodos para la caracterización de la ruptura de la membrana plasmática mediado MLKL en necroptosis incluyendo proyección de imagen de la microscopia convencional y confocal de células vivas, análisis de microscopia electrónica y enlace de lípidos basada en NMR.

Resumen

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Necroptosis es una vía de muerte celular programada desencadenada por la activación de los receptores interactúan quinasa 3 (RIPK3), que fosforila y activa la pseudokinase quinasa-como dominio de linaje mixto, MLKL, ruptura o permeabilizar la membrana plasmática . Necroptosis es un inflamatorio asociado a múltiples patologías, incluyendo autoinmunidad, enfermedades infecciosas y cardiovasculares, derrame cerebral, neurodegeneración y cáncer. Aquí, describimos protocolos que pueden utilizarse para caracterizar MLKL como el verdugo de la ruptura de la membrana plasmática de la necroptosis. Visualizamos el proceso de la necroptosis en las células usando proyección de imagen de células vivas con microscopía de fluorescencia confocal y convencionales y en células fijas usando microscopia electrónica, que reveló a la redistribución de MLKL desde el citosol al plasma membrana antes de la inducción de grandes agujeros en la membrana plasmática. Presentamos en vitro el análisis de resonancia magnética nuclear (RMN) con lípidos para identificar supuestos moduladores de la necroptosis MLKL mediada. Basado en este método, identificamos cuantitativas preferencias de unión a lípidos y fosfatidil-inositol fosfatos (PIPs) como crítico aglutinantes de MLKL que se requieren para targeting de membrana plasmática y permeabilización en necroptosis.

Introducción

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Identificación de componentes genéticos de la necroptosis ha facilitado el uso de modelos animales para probar la implicación de la necroptosis en fisiología y enfermedad1,2,3,4,5. Nocaut de RIPK3 o MLKL en ratones tenía implicación mínima en desarrollo y adulto homeostasis sugiriendo que necroptosis no es esencial para la vida3,6. Por otra parte, algunas especies no contienen genes RIPK3 o MLKL, apoyando la función de no esenciales de la necroptosis en animales7,8. Por otro lado, desafiando los modelos animales knockout con diversas patologías inducidas en el laboratorio ha revelado un papel importante de la necroptosis en inflamación, la inmunidad innata y la infección viral9,10, 11 , 12.

Necroptosis puede activarse de varias maneras mediante señales a través de sensores de diferentes inmunidad innata, todos los cuales resultan en la activación de RIPK31,13,14. RIPK3 activa a su vez fosforila y activa MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. El más estudiado, y tal vez lo más complejo, conduciendo a la activación de RIPK3 implica la muerte del receptor la ligadura, que bifurca en base a la composición aguas abajo de los complejos de señalización o inducir apoptosis o necroptosis1. Necroptosis sobreviene cuando señalización mediante RIPK1 se favorece y da lugar a compromiso de RIPK319,20. Este resultado es fácilmente favorecido sobre inhibición farmacológica o genética supresión de caspasa 8, un inhibidor endógeno putativo de la necroptosis que mantiene necroptosis en Bahía. RIPK1 ata a y activa RIPK3. Otra manera de activar necroptosis es a través de receptores Toll-like TLR3/TLR4 señalización, que se activa y activa RIPK3 TIR-dominio-que contienen adaptador induce interferón-β (TRIF)21. Sin embargo, otra forma de morir por necroptosis es por activación del sensor de ADN DAI, que directamente se activa y activa RIPK322.

MLKL es una proteína citosólica compuesta por un dominio N-terminal hélice paquete (NB) y un dominio de pseudokinase C-terminal (psKD) Unidos por una abrazadera reguladora región3. En las células normales, MLKL se encuentra en el citosol donde se cree que en un complejo inactivo con RIPK314. Activación de la necroptosis desencadena la fosforilación RIPK3 de MLKL en el circuito de activación de la psKD y potencialmente otros sitios en la NB y soporte3,15,23. La fosforilación induce un cambio conformacional en MLKL que produce disociación de RIPK314. Cambios conformacionales mal entendidos suelte la abrazadera del psKD24. El soporte, que contiene 2 hélices, media Oligomerización de MLKL en un trímero putativo el C-terminal hélice25. La hélice N-terminal de la abrazadera inhibe el dominio NB, que es esencial para la permeabilización de la membrana24,26. En aislamiento, dominio NB es suficiente para inducir la permeabilización de la membrana plasmática y necroptosis16,24,27. La actividad de pro-necroptotic de nota fue reconstituida en fibroblastos embrionarios de ratón deficientes en MLKL (mlkl- / - MEFs). NB es un dominio de unión a lípidos que compromete preferentemente el difosfato de fosfatidilinositol 4,5 de fosfolípidos (PIP2). Hemos propuesto un mecanismo paso a paso de activación de MLKL, donde Oligomerización de apoyo facilita el reclutamiento de MLKL a la membrana plasmática a través de las interacciones débiles de NB con el PIP2 grupo de cabeza polar24. En la membrana, el NB somete a exposición regulada de un sitio de unión de alta afinidad adicional PIP2, el que es enmascarado por la rodillera en MLKL inactivo. En general, las múltiples interacciones de NB con PIP2 desestabilizan la membrana del plasma a su ruptura, aunque no ha aclarado el mecanismo molecular de estos eventos.

Aquí ilustran métodos específicos utilizados para caracterizar la función de MLKL como verdugo de la necroptosis24. En particular, nos centramos en el más mínimo dominio MLKL, NB y ortesis (NBB), que está regulado por la inhibición de la rodillera y pueden activarse a través de la dimerización forzada para inducir necroptosis y ruptura de la membrana plasmática. Describimos nuestro sistema de expresión inducible con forzada dimerización de FKBP-mediada inducida por medicamentos para la proyección de imagen de células vivas y la microscopia electrónica de las células que experimentan necroptosis. Además, ilustramos nuestro análisis en vitro NMR de las interacciones de NBB con fosfatidilinositoles (PIPs).

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Protocolo

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1. clonación y generación de la línea de la célula

  1. PCR amplifica la región NBB, correspondiente a residuos de aminoácidos 1-140 (NBB140), de humano cDNA MLKL para marco estándar basados en la enzima de la restricción la clonación con la Oligomerización dominio 2 x FK506 proteína de unión (2xFKBP o 2xFV) y Venus fluorescente proteína en la doxiciclina (Dox) - inducible vector retroviral pRetroX-TRE3G para obtener NBB140- 2xFV-Venus (tabla 1, figuras 1A-B).
  2. Inmortalizar la primaria mlkl- / - o ripk3- / - mlkl- / - ratón embrionarios fibroblastos (MEFs) obtenidos de los respectivos ratones disponibles en el laboratorio verde por transfección transitoria con antígeno SV40 grande expresando el plásmido. Seleccionar las células inmortalizadas en ~ 1-2 semanas y mantener en DMEM suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina, piruvato de sodio 1 mM y aminoácidos no esenciales en 37 ° C y 5% de CO2 en tejido estándar incubadoras de cultivo.
  3. Transduce inmortalizó SV40 mlkl- / - MEFs con el transactivator de tetraciclina inversa controlada (rtTA)-que contienen retrovirus de un plásmido que contiene el gen de resistencia blasticidin (nuestro plásmido modificado) y tratar de 1 semana con 5 μg/mL blasticidin para seleccionar las células que expresan estable rtTA28.
  4. Transduce las MEFs rtTA expresando con el Dox-inducible vector retroviral conteniendo la quimérica MLKL (NBB pRetroX140-2xFV-Venus-puro) y seleccione con 4 puromicina μg/mL para una semana, 2 días después de la transducción de señales.

2. proyección de imagen de microscopia células vivas de la Necroptosis MLKL mediada

  1. Placa mlkl- / - MEFs expresando NBB140-2xFV-Venus en densidades de 50.000 células por pocillo (1 mL/pocillo) de 24 bien las placas e incubar durante una noche (figura 2A). Utilizar la tinción de células vivas para el recuento de células automatizado (véase Tabla de materiales).
  2. Tratar células por 12 h con Dox (0,5 μg/mL) para inducir la expresión de NBB140-2xFV-Venus.
  3. Inducir la necroptosis con 25 dimerizer FKBP nM (Dim) además de fluorescente verde membrana impermeable de 25 nM (véase Tabla de materiales) del tinte en DMEM estándar (véase 1.2). Las células que experimentan necroptosis acumulan el tinte como está comprometida su integridad de la membrana plasmática por NBB140-mediada por la ruptura. Realizar ensayos en triplicado o cuadruplicado.
  4. Para supervisar necroptosis mediante sistemas de imagen de color solo o dual (véase Tabla de materiales), coloque los vasos en la respectiva unidad de imagen en una incubadora de cultivo de tejidos de mamíferos.
  5. Abra el software (véase Tabla de materiales) y seleccione la ficha calendario próximas exploraciones bajo la lista de tareas.
    Nota: este protocolo es para proyección de imagen usando sistemas del solo-color, pero un software similar está disponible para sistemas de dos colores.
  6. Seleccione la "bandeja, recipiente, tipos de análisis" y el "patrón de análisis" en la ficha "Diseño físico" y el "Rápido de la fluorescencia" en la ficha Propiedades.
  7. Añadir "Scan Time" haciendo clic en la ventana de "Timeline" y el número total de puntos de tiempo y frecuencia de adquisición (típicamente 1 adquisición cada 0.5 h a 1 h 6 h a 12 h o cada 5 min para rápida cinética necroptosis) y comenzar la adquisición de la imagen seleccionando "App ly"(botón rojo).
  8. Cuantificar necroptosis utilizando el software de análisis de imagen (véase Tabla de materiales) seleccionando desde el "panel de tareas", "Análisis de nueva cuenta objeto con umbral fijo de segmentación por encima del nivel de fondo", que puede ser determinada por rondando la cursor del ratón sobre las regiones de fondo en varias imágenes utilizadas en el análisis.
  9. Examinar objetos fluorescentes seleccionando Previewing usando imagen actual y perfeccionar los niveles de umbral según sea necesario.
  10. Integrar cuentas de fluorescencia verde abriendo la pestaña de "Lanzamiento de un nuevo análisis", elija el "intervalo de tiempo", seleccione los pozos analizados, introduzca el "nombre de trabajo de análisis" y pulse "OK".
  11. Acceso analizaron datos de la pestaña "Análisis de puestos de trabajo" por hacer doble clic sobre el nombre del respectivo trabajo y exportar de la ventana de gráfico y exportación para análisis adicional en software gráficos externo (véase Tabla de materiales).
  12. Cuantificar datos como fluorescencia verde positivo (+ ve) cuentas/mm2 o normalizar las cuentas por confluencia y expresar los datos como fluorescencia verde + ve cuentas/confluencia.
  13. Opcionalmente, en el extremo experimental, teñir células con 100 nM del membrana-permeant verde fluorescente tinte (véase Tabla de materiales). Normalizar datos % necroptotic células como el cociente de la fluorescencia fluorescencia verde al final.

3. células vivas la microscopia Confocal imagen de reclutamiento de la membrana plasmática y permeabilización por MLKL

  1. Placa mlkl- / - MEFs expresando NBB140-2xFV-Venus con una densidad de 20.000 células por pocillo (0,5 mL/pocillo) en un vaso inferior cámara 4 pozos microscopia pretratado con fibronectina de 50 μg/mL en PBS a 37 ° C durante 30 minutos e incubar ~ 12 h ( Figura 2B).
  2. Tratar las células con Dox (0,5 μg/mL) por ~ 12 h para inducir la expresión de NBB140-2xFV-Venus.
  3. Inducir la necroptosis por incubación con medio fresco (1 mL/pocillo) que contiene 25 nM Dim para inducir NBB140-2xFV-Venus la activación y translocación a la membrana plasmática.
  4. Coloque la cámara en un laser de disco de giro confocal microscopio construido sobre un soporte invertido equipado con control ambiental y un 63 1.4 objetivo de NA y utilizando el software de la opción de adquisición de imágenes (véase Tabla de materiales).
  5. Inicializar el software, seleccione el icono de "Enfoque" y configuración de filtro YFP (nm de longitud de onda 515 de excitación).
  6. Ubique el campo de visión y el plano focal y el sistema de mantenimiento de enfoque utilizando la ficha de "Enfoque definido".
  7. Para iniciar la adquisición, seleccione la pestaña "Captura" seguida de configuración de filtro, apropiado EMCCD cámara exposición tiempo e intensificación ganancia y parámetros de adquisición Time-lapse como intervalo y duración de la adquisición.
  8. Supervisar la redistribución celular de los NBB fluorescente140-2xFV-proteína de Venus durante necroptosis adquiriendo imágenes cada 10 s con una cámara EMCCD usando un láser 515 (película 1).
    Nota: Photobleaching es una preocupación con la proyección de imagen de proteína fluorescente. Venus es una de las proteínas fluorescentes más resistentes al fotoblanqueo29. Si se utilizan proteínas fluorescentes que son más susceptibles a fotoblanqueo, una imagen cada 30 s o más para permitir la recuperación de señales entre puntos de tiempo de proyección de imagen.
  9. Controlar la Asociación de la membrana plasmática de NBB140-2xFV-imagen de Venus durante la necroptosis, cada 10 s la muestra preparada en 3.3 por fluorescencia de reflexión interna total microscopia (TIRF) usando un microscopio equipado con un deslizador TIRF automatizado y un Objetivo de 100 x 1.4 NA y una cámara EMCCD (película 2). Siga los pasos de 3.5-3.7, pero ajustar el ángulo de la TIRF dentro de la pestaña foco TIRF según muestra e inferior grueso de cristal de la sala de microscopía.
    Nota: los marcadores de membrana plasmática como LCK-C-RFP pueden utilizarse como controles para la localización de la membrana plasmática en el análisis de la TIRF.
  10. Realizar el tratamiento para mejorar la calidad por convolución con la segunda normalizada negativa derivada de una función Gaussiana (algoritmo de Marr) de la imagen.

4. microscopia electrónica

  1. Placa mlkl- / - MEFs expresando NBB140-2xFV-Venus con una densidad de 5 millones células de revestimiento de plasma 150 mm placa de cultivo de células e incubar durante 12 h (figura 3).
  2. Tratar las células con doxiciclina (0,5 μg/mL) para inducir la expresión de la nota1-140-2xFV-Venus de 12 h.
  3. Inducir a NBB140-2xFV-Venus la activación y translocación a la membrana plasmática con 25 nM de homodimerizer durante 5 minutos. Este tiempo se establece de la cinética de la necroptosis observados en imágenes de células vivas.
  4. Quite los medios de comunicación y las células, usando 10 mL de glutaraldehído al 2.5%, 2% paraformaldehído en 0.1 M sodio cacodilato de tampón pH 7,4 (tampón cacodilato) calentado previamente a 37 ° C.
  5. Recoger la muestra por raspado y centrifugar las muestras durante 10 minutos a 500 x g. Deseche el sobrenadante.
  6. Postfix la muestra durante 1,5 h en tetróxido de osmio 2% reducido con ferrocianuro de potasio de 1.5% en buffer de cacodilato de sodio de 0.1 M. Tetróxido de osmio es un agente de tinción utilizado en TEM para proporcionar contraste. Utilizamos TEM como análisis preliminar antes de SEM de la célula que experimenta necroptosis.
  7. Enjuague la muestra 5 veces en agua ultrapura por 5 min a 500 x g, seguido por enjuagues en buffer (ver 4.6), agua y etanol en un procesador automático. Deseche el sobrenadante.
  8. Para el SEM, mancha las muestras previamente fijadas con 1% uranilo acetato y plomo aspartato metales pesados mancha31.
  9. Deshidratan las muestras a través de una serie gradual de soluciones de alcohol propileno óxido.
  10. Embeber la muestra en resina dura32 para obtener un bloque de resina.
  11. Corte secciones de espesor de 0.5 μm para determinar el área correcta del análisis.
  12. Cubrir las muestras con una película ultra delgada de metal eléctricamente conductor (iridio).
  13. Imagen y análisis de las muestras (figura 3). Para la cuantificación, se escanea una imagen de bajo aumento de la superficie del bloque de resina con las células expuestas a 5 keV usando un microscopio electrónico.
  14. Visualizar las células a través de imágenes individuales, capturadas por SEM o software de imágenes puede utilizarse para unirse a múltiples campos de la vista en una imagen contigua30. Aproximadamente 100 células pueden ser utilizadas para evaluar la fracción de células que experimentan necroptosis de esta manera generando un montaje de alta resolución en el software de elección (véase Tabla de materiales).
    Nota: Puntuación morfología necrótica por SEM compara características de células normales con la progresión de fenotipos previamente necróticas o necróticos. Estas características incluyen alteraciones de la membrana del plasma incluyendo la desaparición de las microvellosidades, aplanar, rupturas en las células que van desde 10 nm y 1 μm de tamaño o pérdida de la estructura del organelo en por lo menos 30-40% de la superficie celular citosólica.

5. lípidos vinculante de MLKL por espectroscopia de resonancia magnética Nuclear (RMN)

  1. Preparar 15NBB N etiquetado1-156 por expresión de la proteína estándar y purificación como descrito previamente24.
  2. Disolver 500 μg de sal de amonio 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (PI 18:0) y sal de amonio de 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (18:1 PI) en 500 μl de helada CHCl3 cada para concentraciones finales de 1 mg/mL.
  3. Someter a ultrasonidos 1 mg/mL 18:0 y 18:1 PI en un baño de sonicación durante 1 min a temperatura ambiente o hasta 5 minutos en una mezcla de hielo y agua.
  4. Alícuota de 1 mg/mL 18:0 y 18:1 PI en frascos de vidrio limpios para series individuales de titulación NMR (figura 4). Transferencia de lípidos en solventes orgánicos utilizando jeringas herméticas de vidrio.
    1. Alícuota 132 μl de 1 mg/mL 18:1 PI (masa molar = 880.137 g/mol) en CHCl3 para un volumen de resuspensión final de 1.200 μL en concentración μm 125.
      Nota: Para tubos de 5 m m NMR, preparar volúmenes de dilución seriada de > 1.000 μl y final RMN muestra volúmenes de > 500 μl. Para tubos de 3 mm NMR, preparar volúmenes de dilución seriada de > 300 μl y final RMN muestra volúmenes de > 150 μL.
  5. 1 mg/mL alícuota porcino cerebro sal de amonio de L-α-fosfatidilinositol-4, 5-bifosfato en 20:9:1 CHCl3/MeOH/H2O (cerebro de PI (4,5) P2) en frascos de vidrio limpios.
  6. Coloque los frascos en una corriente gaseosa de argón (Ar) o nitrógeno (N2) con flujo moderado a evaporar el solvente orgánico sin salpicar contra las paredes del frasco de vidrio. Cinco a treinta min es normalmente suficiente para los volúmenes de solvente orgánico de 10-200 μl.
  7. Colocar frascos de vidrio en la parte inferior de un Büchner o matraz de vacío con unas pinzas grandes, sellar con un tapón de goma y conecte el tubo de plástico conectado a una línea de vacío. Evacuar el matraz vacío suave durante la noche para eliminar materia orgánica residual.
  8. Superposición de partes alícuotas de la película de lípidos con gas inerte y sellar con una tapa hermética, almacenar a-20 ° C para el uso dentro de un mes o a-80 ° C para almacenamiento a largo plazo.
  9. Preparación de buffers de NMR muestra sin detergente (-Det) que contiene 20 mM NaxHyPO4 de pH 6.8, 10% D2O y con detergente (+ Det) que contiene 20 mM NaxHyPO4 de pH 6.8, 10% D2O, 0.34 m m n-dodecil-β-D-maltopyranoside (DDM).
  10. Add + Det buffer al frasco de vidrio con película de lípidos para alcanzar la concentración deseada y someter a ultrasonidos en baño de agua durante 30 minutos, alternando sonicación durante 10 min seguida por inspección visual.
    Nota: Sonicación puede calentar la muestra. Deje que se enfríe a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de la reconstitución de proteínas final muestra.
  11. Realizar dilución seriada de micelas de detergente lípidos en + Det búfer mediante sonicación de las mezclas 1:1 para la serie de la concentración deseada. Comenzando en la concentración de lípidos de 125 μm, tres repeticiones dará 62.5 μm, μm 31.3 y 15.6 lípidos μm en 0,34 mM DDM.
  12. Preparación control y referencia a muestras de NMR de proteínas y aditivos - Det y + Det buffers, respectivamente. Añadir proteína y aditivos para cada dilución de lípido en + buffer de Det.
    Nota: Para 15NBB N156, proteína es añadida a una concentración final de 40 μm y suplementada con 2 mM deuterado Ditiotreitol para mantener residuos de Cys reducidos.
  13. Transferir el volumen apropiado de las muestras a 5 mm o 3 mm tubos NMR (ver nota en el paso 5.4).
  14. Manual cargar muestras en instrumento NMR o arreglar en una plataforma de automatización como el cargador de SampleCase.
  15. Adquisición de espectros de RMN compuestos utilizando programas de pulso estándar para espectros de protón H 1como control de calidad seguido por espectros de correlación 2D 1H -15N como espectroscopía de relajación transversal optimizada (TROSY) o heteronuclear múltiples quantum coherencia (SOFAST-HMQC)33.
    Nota: El uso de tubos de 3 mm NMR requiere 64 análisis por 1 H -15N TROSY (3 h) ó 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 min). Analizar números se reduce a la mitad para tubos de 5 m m NMR.
  16. Espectros de RMN 2D procesados pueden añadirse a un repositorio de CARA34 para el análisis u otro software de elección para el usuario.
  17. Análisis de software por anotación de resonancias de NMR 2D para tres picos bien dispersos y resueltos para cada estado de la proteína. Grabar las amplitudes de pico para cada uno de los seis picos para cada condición de búfer que contiene NBB156 (figura 5A).
    1. Uso de CARA a preparar una lista por lotes-integración (título del menú principal, haga clic en "espectro | Configuración por lotes lista"...) de todos los espectros recogidos y analizar utilizando un archivo de asignación solo pico (título del menú principal, haga clic en "cumbres | Importar Peaklist".. .y elegir un archivo definido por el usuario .peaks con 6 picos total, 3 para cada estado de la proteína, definido dentro de).
    2. La programación del tono ("integrador | Ajustar modelo de pico"...) de ancho X 0,06 ppm y ancho Y 0,30 ppm (título del menú principal, haga clic en "integrador | Ajustar modelo de pico"...) antes de grabar el resultado final en dos selecciones de menú (1. Haga clic en título del menú principal "integrador | Integrar la lista por lotes") (2. Haga clic en título del menú principal "picos | Exportar tabla de integración") (figura 5B).
      Nota: Las resonancias de amida de la espina dorsal para residuos M21, V53, L105 han sido asignadas para el estado NBB156 rodillera cerrada. El estado abierto-brace fue asignado a la columna vertebral amida resonancias de residuos G130 A141 y la epsilon protón cadena lateral resonancia de W133 usando 3D NMR experimentos24.
  18. Normalizar las muestras para la comparación directa de diferentes imanes o condiciones de la muestra por promedio de las amplitudes de rodillera abierta tres de las muestras de referencia y calcular un factor de normalización relacionadas con las dos referencias. Calcular las amplitudes escaladas de resonancias de156 NBB utilizando el factor de normalización y amplitudes negativas del ajuste a cero (tabla 2).
    Ejemplos: 1) comparando muestras de diferentes imanes: imán A, NBB156DDM e imán B, NBB156+ DDM. 2) comparación detergente: 0,34 DDM y 1,7 mM DDM.
  19. Calcular para cada resonancia la fracción escala de cerrado o abierto-soporte dividiendo con la gama de mínima a máxima amplitud de todos los espectros recogidos que contienen referencias apropiadas de NBB libre156 y totalmente abierto-brace NBB156 en detergente.
  20. Parcela las amplitudes NMR normalizadas en función de la concentración de lípidos y comparar la fracción de rodillera abierta NBB156 en diferentes condiciones (Fig. 5C).
    Nota: Como alternativa, análisis de la fracción de la conformación de la rodillera cerrada contra la concentración de lípidos se pueden realizar para comparar atascamiento del lípido a NBB156. Nosotros preferimos el análisis anterior porque es más rápido y mejores informes sobre la fracción completamente comprometido por lípidos.

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Resultados

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Visualizar la ejecución de la necroptosis regulado en células vivas ha sido posible a través de la expresión inducible de una mínima construcción MLKL truncada, NBB140-2xFV-Venus. Esta construcción mantiene la capacidad de inducir la permeabilización de la membrana plasmática y se activa a través de Oligomerización Dim-inducida de la cassette FKBP (2xFV). Observar y cuantificar necroptosis por microscopía de células vivas imágenes, monitoreo cinéticamente (cada 5 min) la absorc...

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Discusión

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Ofrecemos protocolos para técnicas que se combinaron implicado MLKL como el supuesto verdugo de ruptura de membrana plasmática24. Además de descifrar la red reguladora que regula MLKL-mediada de la necroptosis, estas técnicas se pueden utilizar independientemente para caracterizar otros sistemas biológicos adecuados. Prácticamente hablando, estas técnicas son herramientas de descubrimiento de medio a bajo rendimiento.

Habitualmente hemos utilizado proyección de imagen d...

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Clonación y generación de líneas celulares
pRetroX-TRE3GClontech631188 plásmido
transactivador Tet-OnLlambi et al., 2016
Fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) mlkl-/-Dillon et al., 2014
Clorhidrato de blasticidina SThermo Fisher ScientificBP2647100 CAS#3513-03-9
muerte celular fuerte y microscopía de células vivas
Clontech 631311CAS# 24390-14-5
B/B Homodimeriizador AP20187Takara635059 CAS# 195514-80-8
SYTOX VerdeThermo Fisher ScientificS7020
Syto16Thermo Fisher ScientificS7578
NMR
15 N Cloruro de amonio CambridgeIsotope LaboratoriesNLM-467-10 CAS# 12125-02-9
DTT deuteradoCambridge Isotope LaboratoriesDLM-2622-1
Óxido de deuterioSigma Aldrich617385-1 CAS# 7789-20-0
n-Dodecil-β-D-MaltopirranósidoAnatraceD310 CAS# 69227-93-6
L-α-fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato (cerebro, cerdo) (sal de amonio)Avanti Polar Lipids840046X CAS# 383907-42-4
1,2-distearolel-sn-glicero-3-fosfoinositol (sal de amonio) (18:0 PI)Avanti Polar Lipids850143 CAS# 849412-67-5
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-mio-inositol) (sal de amonio) (18:1)Avanti Polar Lipids850149 CAS# 799268-53-4
Specialized Equipment
IncuCyte FLR o ZOOMEssen BioScience, Inc.Imágenes de microscopía de células vivas
Helios NanoLab 660 DualBeam Microscopio electrónicoThermo Fisher Scientific
Software
IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)Essen BioScience, Inc.http://www.essenbioscience.comAnálisis de imágenes
FEI MAPSThermo Fisher Scientifichttps://www.fei.com/software/maps/EM análisis
TopSpin v3.2Bruker BioSpinhttp://www.bruker.comRecopilación de datos de RMN
CARA v1.9.1.7http://cara.nmr.ch/ Análisis de datos de RMN
Slidebook3i (Intelligent Imaging Innovations)https://www.intelligent-imaging.com/slidebookMicroscopía confocal

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
  2. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
  3. Murphy, J. M., et al. The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).
  4. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
  5. Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
  6. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  7. Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. An evolutionary perspective on the necroptotic pathway. Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).
  8. Newton, K., Manning, G. Necroptosis and Inflammation. Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).
  9. Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. Viral modulation of programmed necrosis. Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).
  10. Newton, K., et al. RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury. Cell Death & Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).
  11. Kearney, C. J., Martin, S. J. An Inflammatory Perspective on Necroptosis. Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).
  12. Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
  13. Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).
  14. Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview. Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).
  15. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
  16. Wang, H., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3. Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).
  17. Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).
  18. Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).
  19. Dillon, C. P., et al. RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3. Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).
  20. Rickard, J. A., et al. RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis. Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).
  21. Kaiser, W. J., et al. Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL. Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).
  22. Upton, J. W., Kaiser, W. J. DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection. Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).
  23. Tanzer, M. C., et al. Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop. Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).
  24. Quarato, G., et al. Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis. Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).
  25. Davies, K. A., et al. The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis. Cell Death & Differentiation. , (2018).
  26. Su, L., et al. A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL. Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).
  27. Dondelinger, Y., et al. MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates. Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).
  28. Llambi, F., et al. BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation. Cell. 165 (2), 421-433 (2016).
  29. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), 18586(2011).
  30. Perez, A. J., et al. A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126(2014).
  31. Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).
  33. Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. 15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins. Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).
  34. Keller, R. The computer aided resonance assignment tutorial. Cantina Verlag. , (2004).
  35. Chen, W., et al. Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling. Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).
  36. Tanzer, M. C., et al. Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL. Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).

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