Divulgamos los métodos para la caracterización de la ruptura de la membrana plasmática mediado MLKL en necroptosis incluyendo proyección de imagen de la microscopia convencional y confocal de células vivas, análisis de microscopia electrónica y enlace de lípidos basada en NMR.
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Artículo de método
Caracterización de la ruptura de la membrana plasmática mediado MLKL en Necroptosis
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Resumen
Resumen
Necroptosis es una vía de muerte celular programada desencadenada por la activación de los receptores interactúan quinasa 3 (RIPK3), que fosforila y activa la pseudokinase quinasa-como dominio de linaje mixto, MLKL, ruptura o permeabilizar la membrana plasmática . Necroptosis es un inflamatorio asociado a múltiples patologías, incluyendo autoinmunidad, enfermedades infecciosas y cardiovasculares, derrame cerebral, neurodegeneración y cáncer. Aquí, describimos protocolos que pueden utilizarse para caracterizar MLKL como el verdugo de la ruptura de la membrana plasmática de la necroptosis. Visualizamos el proceso de la necroptosis en las células usando proyección de imagen de células vivas con microscopía de fluorescencia confocal y convencionales y en células fijas usando microscopia electrónica, que reveló a la redistribución de MLKL desde el citosol al plasma membrana antes de la inducción de grandes agujeros en la membrana plasmática. Presentamos en vitro el análisis de resonancia magnética nuclear (RMN) con lípidos para identificar supuestos moduladores de la necroptosis MLKL mediada. Basado en este método, identificamos cuantitativas preferencias de unión a lípidos y fosfatidil-inositol fosfatos (PIPs) como crítico aglutinantes de MLKL que se requieren para targeting de membrana plasmática y permeabilización en necroptosis.
Introducción
Identificación de componentes genéticos de la necroptosis ha facilitado el uso de modelos animales para probar la implicación de la necroptosis en fisiología y enfermedad1,2,3,4,5. Nocaut de RIPK3 o MLKL en ratones tenía implicación mínima en desarrollo y adulto homeostasis sugiriendo que necroptosis no es esencial para la vida
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Protocolo
1. clonación y generación de la línea de la célula
- PCR amplifica la región NBB, correspondiente a residuos de aminoácidos 1-140 (NBB140), de humano cDNA MLKL para marco estándar basados en la enzima de la restricción la clonación con la Oligomerización dominio 2 x FK506 proteína de unión (2xFKBP o 2xFV) y Venus fluorescente proteína en la doxiciclina (Dox) - inducible vector retroviral pRetroX-TRE3G para obtener NBB140- 2xFV-Venus (tabla 1, figuras 1A-B).
- Inmortalizar la primaria mlkl- / - o ripk3- / - mlkl- / - ratón embrionarios fibroblastos (MEFs) obtenido....
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Resultados
Visualizar la ejecución de la necroptosis regulado en células vivas ha sido posible a través de la expresión inducible de una mínima construcción MLKL truncada, NBB140-2xFV-Venus. Esta construcción mantiene la capacidad de inducir la permeabilización de la membrana plasmática y se activa a través de Oligomerización Dim-inducida de la cassette FKBP (2xFV). Observar y cuantificar necroptosis por microscopía de células vivas imágenes, monitoreo cinéticamente (cada 5 min) la absorc.......
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Discusión
Ofrecemos protocolos para técnicas que se combinaron implicado MLKL como el supuesto verdugo de ruptura de membrana plasmática24. Además de descifrar la red reguladora que regula MLKL-mediada de la necroptosis, estas técnicas se pueden utilizar independientemente para caracterizar otros sistemas biológicos adecuados. Prácticamente hablando, estas técnicas son herramientas de descubrimiento de medio a bajo rendimiento.
Habitualmente hemos utilizado proyección de imagen d.......
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Clonación y generación de líneas celulares | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 plásmido | |
| transactivador Tet-On | Llambi et al., 2016 | ||
| Fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
| Clorhidrato de blasticidina S | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
| muerte celular fuerte y microscopía de células vivas | |||
| Clontech 631311 | CAS# 24390-14-5 | ||
| B/B Homodimeriizador AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
| SYTOX Verde | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
| NMR | |||
| 15 N Cloruro de amonio Cambridge | Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| DTT deuterado | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
| Óxido de deuterio | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| n-Dodecil-β-D-Maltopirranósido | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-α-fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato (cerebro, cerdo) (sal de amonio) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-distearolel-sn-glicero-3-fosfoinositol (sal de amonio) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-mio-inositol) (sal de amonio) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| Specialized Equipment | |||
| IncuCyte FLR o ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Imágenes de microscopía de células vivas | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam | Microscopio electrónico | Thermo Fisher Scientific | |
| Software | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Análisis de imágenes |
| FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM análisis |
| TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | Recopilación de datos de RMN |
| CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | Análisis de datos de RMN | |
| Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Microscopía confocal |
Referencias
- Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
- Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nat....
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Reimpresiones y permisos
