Method Article

Aislamiento, caracterización y MicroRNA basado en la modificación genética de las células madre del folículo Dental humano

DOI:

10.3791/58089

⸱

November 16th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty at Rostock University, 3Department of Operative Dentistry and Periodontology, Rostock University Medical Center

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe la ingeniería genética transitoria de células dentales extraídas del folículo dental humano. La estrategia de modificación no aplicada puede llegar a ser una base para la mejora de los productos terapéuticos de células madre.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hasta la fecha, varios tipos de células madre en diferentes etapas de desarrollo están en el foco para el tratamiento de enfermedades degenerativas. Sin embargo, ciertos aspectos, como la muerte celular masiva inicial y bajos efectos terapéuticos, problemas de su traducción clínica amplia. Ingeniería genética de células antes del trasplante surgió como un método prometedor para optimizar los efectos terapéuticos de células madre. Sin embargo, todavía carecen de sistemas de entrega de genes seguros y eficientes. Por lo tanto, el desarrollo de métodos adecuados puede proporcionar un enfoque para resolver los retos actuales en terapias basadas en células madre.

El presente Protocolo describe la extracción y caracterización de células madre de folículo dental humana (hDFSCs) así como su modificación genética no-virales. El folículo dental postnatal dio a conocer como una fuente prometedora y de fácil acceso para la recolección de las células madre adultas multipotentes que poseen potencial de proliferación alta. El procedimiento de aislamiento descrito presenta un método simple y confiable para cosechar hDFSCs de cordales. Este protocolo incluye también métodos para definir las características de células madre de células aisladas. Para la ingeniería genética de hDFSCs, una estrategia optimizada transfección catiónico base de lípidos se presenta introducción de microARN altamente eficiente que permite sin producir efectos citotóxicos. MicroRNAs son candidatos adecuados para la manipulación de celda transitoria, como estos pequeños reguladores traslacionales controlan el destino y el comportamiento de células madre sin el peligro de la integración del genoma estable. Así, este protocolo representa un procedimiento seguro y eficaz para la ingeniería de hDFSCs que puede llegar a ser importante para la optimización de su eficacia terapéutica.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El folículo dental humano es un flojo Tejido fino conectivo de derivados de ectomesenchymally que rodea el diente en desarrollo1,2. Al lado de su función de coordinar la osteoclastogénesis y osteogénesis para el proceso de erupción del diente, este tejido presenta células madre y progenitoras especialmente para el desarrollo del periodonto3,4,5. Por lo tanto, el folículo dental se considera como una fuente alternativa para cosechar las células madre adultas humanas6,7.

Varios estudios demostraron que las células madre del folículo dental humana (hDFSCs) son capaces de diferenciarse en el linaje periodontal incluyendo osteoblastos, fibroblastos del ligamento y cementoblastos8,9,10 . Además, estas células fueron demostradas para que coincida con todas las características de las células estromales mesenquimales (MSCs) incluyendo la capacidad de auto renovación, adhesión plástica, expresión de marcadores de superficie específicos (por ejemplo,, CD73, CD90, CD105) así como osteogénico, adipogenic y condrogénica diferenciación potencial11,12,13. Otros estudios también revelaron un potencial de diferenciación de los nervios de hDFSCs2,14,15,16,17,18.

Debido a sus prometedoras propiedades y fácil acceso, hDFSCs se convirtió recientemente relevantes para tejido ingeniería19,20,21. Los primeros estudios se concentraron en el potencial de DFSCs para regenerar hueso periodontal y dientes raíces19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. Desde el conocimiento de la capacidad neurogénica de hDFSCs, su aplicación como tratamiento potencial para las enfermedades neurodegenerativas ha sido investigado31,32,33. HDFSCs también han cobrado importancia con respecto a la regeneración de otros tejidos (p. ej., epitelio corneal)34,35. El potencial terapéutico de hDFSC no se basa sólo en su potencial de diferenciación directa sino también en su actividad paracrina. Recientemente, hDFSCs se han demostrado para secretar una gran cantidad de factores bioactivos, como las metaloproteinasas de matriz (MMPs), factor de crecimiento insulínico (IGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento básico del fibroblasto (bFGF) y el crecimiento de hepatocito factor (HGF), que desempeñan un papel crucial de la angiogénesis, inmunomodulación, remodelación de la matriz extra celular y procesos reparativos36.

Sin embargo, amplia traducción clínica de la terapia de células madre se deteriora aún por varios desafíos, como la muerte masiva de células iniciales y células beneficioso bajo efectos37,38. Ingeniería genética proporciona una estrategia prometedora para abordar estos desafíos y por lo tanto, puede realzar grandemente la eficacia terapéutica de células madre38,39,40. Para la manipulación de celda transitoria, microRNAs (miRs) son los candidatos idóneos, como estos pequeños reguladores traslacionales controlan el destino y el comportamiento de las células madre sin el peligro de genoma estable integración41,42, 43. hasta la fecha, se han identificado varios miRs beneficiosos promover la proliferación de la célula de vástago, supervivencia, homing, actividad paracrina, así como su diferenciación en varios linajes44. Por ejemplo, miR-133a ingeniería MSCs mostraron un aumento de la supervivencia y el engraftment en corazones de rata infartado, dando por resultado una función cardíaca mejorada en comparación con MSCs45. Además, miR-146a MSCs expresando mostraron secretan mayores cantidades de VEGF, que a su vez condujo a una mayor eficacia terapéutica en el tejido isquémico46.

Este manuscrito presenta un protocolo detallado para la extracción selectiva y la ingeniería genética de hDFSCs. Para ello, describimos la digestión enzimática y cosecha de los folículos dentales humanas, así como el aislamiento posterior de hDFSCs. Para caracterizar las células aisladas, instrucciones importantes para la verificación de propiedades MSC se han incluido siguiendo las directrices de la sociedad internacional de terapia celular13. Además, ofrecemos una descripción detallada para la generación de hDFSCs miR-modificado por aplicación de una estrategia de transfección basada en lípidos catiónicos y la evaluación de la eficiencia de transfección y citotoxicidad.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HDFSCs están aisladas de los folículos dentales de los dientes extraídos de la sabiduría proporcionados por el Departamento de Cirugía Oral y maxilofacial plástico de Rostock University Medical Center. Se obtuvo consentimiento informado y autorización por escrito de todos los pacientes. Este estudio fue autorizado por el Comité de ética local de la Universidad de Rostock (permiso No. A 2017-0158).

1. aislamiento de hDFSCs

Nota: Para evitar la contaminación bacteriana, dientes de la sabiduría no debe ser estalló antes de la extracción

  1. Preparación de soluciones requiere
    1. Preparar una solución salina tamponada con fosfato (PBS) / solución de penicilina-estreptomicina-glutamina (P-S-G): mezclar 495 mL de PBS con 5 mL de solución de P-S-G. Almacenar en alícuotas de 50 mL a 4 ° C.
    2. Preparar medio de cultivo de hDFSC: 445 ml de medio basal con 5 mL de agente antibiótico y 50 mL de suero bovino fetal (FBS). Almacenar a 4 ° C.
    3. Preparar colagenasa tipo stock solución (30 mg/mL): diluir 300 mg del tipo de colagenasa en 10 mL de medio basal suplementado con 1% de agente antibiótico. Mezcle la solución con energía. Filtrar la solución con un filtro de 0.2 μm. Tienda alícuotas de 500 μl de colagenasa tipo I solución a-20 ° C.
    4. Prepare solución Dispase II (40 mg/mL): diluir 40 mg del Dispase II en 10 mL de medio basal suplementado con 1% antibiótico agente. Mezcle la solución con energía. Filtrar la solución con un filtro de 0.2 μm. Almacenar en alícuotas de 500 μl de solución stock Dispase II a-20 ° C.
  2. Procedimiento quirúrgico
    1. Inyectar una cantidad suficiente (máximo: 2 mL) del anestésico local.
    2. Crear y levantar un colgajo mucoperióstico de tres lados. No es necesario levantar un colgajo lingual.
    3. Proteger el aspecto lingual con un elevador perióstico.
    4. Suavemente molino bucal y distal del hueso con una fresa redonda de metal duro.
    5. Aflojar el tejido del folículo con un elevador perióstico. Retire con cuidado el diente completo (germen) y folículo tirando de la corona (y folículo) con posterior (tercer molar) fórceps.
    6. Desbridar y regar la toma bien con solución de NaCl.
    7. Vuelva a colocar la aleta mucoperióstica con suturas de vicryl (véase Tabla de materiales).
    8. Sacar el folículo dental de la cavidad oral y en una alícuota de 50 mL de solución de PBS/P-S-G.
      Nota: La muestra puede guardarse a 4 ° C hasta el procesamiento posterior.
  3. Digestión enzimática del folículo dental
    1. Caliente previamente el medio de cultivo de hDFSC y solución de PBS/P-S-G a la temperatura ambiente (RT).
    2. Descongelar una alícuota de cada tipo de colagenasa I y II Dispase soluciones stock. Preparar una solución de digestión de 3 mg/mL tipo de colagenasa y 4 mg/mL Dispase II agregar 500 μl de cada colagenasa tipo I y solución a 4 mL de basal medio que contiene 1% agente antibiótico Dispase II.
    3. Lugar del folículo extraído en una placa Petri estéril y añadir 10 mL de solución de PBS/P-S-G para lavar el tejido extraído. Repita este paso de lavado dos veces.
    4. Pique el folículo extraído a los pedazos de aproximadamente 1 mm x 1 mm con un bisturí estéril dentro de la caja Petri con 10 mL de solución de PBS/P-S-G.
    5. Transferencia de tejido picadito y solución de PBS/P-S-G de la placa de Petri en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL. Lave la placa de Petri con 10 mL de solución de PBS/P-S-G y transferir la solución al mismo tubo.
    6. Centrifugar el tubo de centrífuga cónico de 10 min a 353 x g a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante.
    7. Añadir 5 mL de solución de digestión a los tejidos concentrados. Mezclar suavemente la solución y el tejido. Incubar la mezcla a 37 ° C y 5% de CO2 por 2 h en un incubador de agitación.
    8. Centrífuga digerido suspensión de células y tejidos en 353 x g durante 10 min a RT. descartar el sobrenadante y Resuspenda el sedimento obtenido en 6 mL de medio de cultivo hDFSC.
    9. Suspensión de células de la semilla en una de 25 cm2 matraz de cultivo de células e incubar las células a 37 ° C, 5% CO2 y 20% O2.
      Nota: Si el tejido no es totalmente digerido, transferir el tejido restante en el matraz de cultivo celular así.
    10. Cambiar el medio cuidadosamente 24 horas después de la siembra de la célula. Luego cambiar el medio cada tres días hasta confluencia.
      Nota: HDFSCs debe ser adherente de plástico 24 h después de la siembra de células y se puede separar de las células no adherentes y componentes de la sangre simplemente cambiando el medio.
  4. Recolección de células
    1. Caliente previamente el medio de cultivo hDFSC, solución de PBS/P-S-G y solución de ácido (EDTA) tripsina/etilendiaminotetracético a RT.
    2. Desechar el sobrenadante del frasco de cultivo y lavado las células confluentes con 5 mL de solución de PBS/P-S-G.
    3. Añadir 1 mL de solución de tripsina/EDTA al matraz de cultivo e incubar 3 min a 37 ° C. Detener el proceso de digestión mediante la adición de 3 mL de medio de cultivo de hDFSC en el matraz de la cultura.
    4. Transferir la suspensión de células en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL y centrifugar la suspensión durante 10 min a 353 x g en RT. descartar el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en una cantidad apropiada hDFSC de medio de cultivo.
    5. Contar celdas: suavemente mezclar 10 μl de suspensión celular con 10 μl de solución de azul tripán. Aplique 10 μL en una cámara de recuento y calcular la cantidad de células hDFSC.

2. Caracterización de hDFSCs

  1. Immunophenotyping
    1. Preparación de las células para análisis cytometric del flujo
      1. Preparación de soluciones requiere
        1. PBS/EDTA (2 mM) de preparar: Mezcle 996 mL de PBS con 4 mL de EDTA (0.5 M).
        2. Preparar el tampón de tinción: mezcla de 995 mL de PBS/EDTA (2 mM) con 5 g de BSA. Filtrar la solución utilizando una unidad de filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 ° C hasta uso.
        3. Preparar la solución stock de paraformaldehido (PFA) (4%): diluir 4 g PFA en 100 mL de PBS y calentar la solución a 80 ° C. Mezclar la solución y ajustar el pH a 7.3. Parte alícuota obtuvo solución de la PFA en cantidades respectivas (1.5 mL) y almacenar a-20 ° C hasta uso.
          PRECAUCIÓN: Debido a los humos PFA son tóxicos, preparar la solución PFA en una campana de ventilación.
      2. Después de la cosecha (1.4) de la célula, transferir 14 muestras de 5 x 104 células en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugar la suspensión a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
        Nota: Realizar el siguiente trabajo en una sala más bien sombreada. Mantener las células y los reactivos en el hielo a menos que se indique lo contrario.
      3. Resuspenda las células en ciertas cantidades de tampón de tinción (4 ° C) y añadir FcR bloqueo reactivo (4 ° C) como se indica en la tabla 1.
      4. Añadir los siguientes anticuerpos hacia el lado interno de la respectiva muestra como se indica en la tabla 1: Allophycocyanin (APC) ratón humana CD29; Ratón APC control de isotipo κ IgG1; Proteína Peridinin-clorofila (PerCP)-Cyanine5.5 ratón humana CD44; PerCP-Cyanine5.5 mouse IgG2b control de isotipo κ; V500 ratón humana CD45; V500 mouse IgG1 control de isotipo κ; Ficoeritrina (PE) ratón humana CD73; Ratón de PE control de isotipo κ IgG1; PerCP-Cyanine5.5 ratón humana CD90; Ratón de PerCP-Cyanine5.5 control de isotipo κ IgG1; ratón contra CD105: Alexa Fluor (AF) 488; control negativo de IgG1 de ratón: AF488; PE-Cyanine7 ratón humana CD117; PE-Cyanine7 mouse IgG1, control de isotipo κ. Después de que los anticuerpos se han añadido a cada muestra, girar por anticuerpos y mezclar suavemente. Incubar las soluciones durante 10 min a 4 ° C.
      5. Añadir 1 mL de PBS (4 ° C) y centrifugar las muestras a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
      6. Resuspenda las células en 100 μl de PBS (4 ° C) y agregar 33 μl de PFA (4%). Mezclar las soluciones y almacenar en hielo o a 4 ° C hasta el análisis cytometric del flujo.
    2. Medición de citometría de flujo de células
      Nota: Realizar el siguiente trabajo en una sala más bien sombreada. Mantener las células en hielo hasta la medición.
      1. Para examinar la expresión de antígenos de superficie, transferir muestras en tubos adecuados para mediciones de citometría de flujo.
      2. Medir por lo menos 2 x 104 eventos usando un citómetro de flujo. Analizar como se muestra en la figura 2.
  2. Potencial de diferenciación multipotentes de hDFSCs
    1. Utilice un disponible en el mercado humano mesenquimales células madre funcional Kit de identificación para confirmar adipogenic osteogénica y condrogénica diferenciación potencial de hDFSCs. Aplicar burro anti-cabra AF488 de anticuerpo secundario para la coloración de la proteína de unión a ácidos grasos 4 (FABP4) y aggrecan así como burro anti-ratón AF488 de anticuerpo secundario para la tinción de la osteocalcina. Para la tinción de núcleos, uso de medio de montaje con 4', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI).
      Nota: Preparar muestras sin anticuerpo primario como controles negativos para análisis microscópicos.
    2. Analizar la expresión de proteínas por microscopía confocal de barrido láser. Configuración de microscopía: objetivo de 40 x con inmersión en aceite; la excitación láser de 488 nm (para AF488) y 405 nm (para DAPI).

3. transfección de hDFSCs

  1. Después de la célula (1.4) la cosecha, la semilla hDFSCs en una placa de cultivo celular de 24 pozos 24 h antes de la transfección.
    Nota: A partir de la densidad celular es aproximadamente de 4 x 104 células por pocillo. Células deben llegar a confluencia de ~ 80% en el día de la transfección.
    Nota: La semilla una muestra adicional de la célula como control para el análisis cytometric del flujo.
  2. Preparación de complejos de transfección
    Nota: Para evitar contaminación por RNasas, limpie el área de trabajo directamente antes de la preparación de complejos de transfección con solución de descontaminación de Rnasa. Utilizar sólo material libre de ARNasas y soluciones.
    Nota: Realizar el siguiente trabajo en una sala más bien sombreada.
    1. Preparar la solución stock de miR (50 μm): resuspender miR precursor marcado con Cy3 (5 nmol) en 100 μl de agua libre de nucleasa. Solución madre de alícuota miR obtenidos en la tienda en la oscuridad a-20 ° C hasta uso y cantidades respectivas (5 μl).
    2. Diluir 40 pmol de miR (0,8 μl de la solución madre de miR de 50 μm) en 66,7 μl de medio de suero reducido. Mezclar suavemente la solución
    3. Diluir 0.67 μl de reactivo de transfección basada en lípidos catiónicos en 66,7 μl de medio de suero reducido. Mezcle la solución suavemente e incubar 5 min a TA.
    4. Después de la incubación, añadir el reactivo de transfección previamente diluido a la miR previamente diluida. Mezcle la solución suavemente e incubar por 15 min a TA.
  3. Añadir gota a gota los complejos preparados transfección directamente al medio de cultivo en las células. Mezclar suavemente, meciendo la placa de cultivo celular de 24 pozos y hacia atrás.
  4. Incube las células a 37 ° C, 5% CO2y 20% O2 durante 24 h.

4. Análisis de la transfección

Nota: Realizar el siguiente trabajo en una sala más bien sombreada.

  1. Cosecha después de la transfección de la célula
    Nota: Recopilar todas las soluciones de células de una muestra en el mismo tubo de centrífuga cónico de 15 mL.
    1. 24 h después de la transfección, recoger el sobrenadante de las muestras en tubos de centrífuga correspondiente.
    2. Lavar las células con 1 mL de PBS, PBS de transferencia en el tubo de centrifugadora respectivos y agregar 500 μl tripsina/EDTA (RT) a las células. Incubar las soluciones por 3 min a 37 ° C.
    3. Parar la tripsinización añadiendo 1 mL de medio de cultivo (RT) a las células y la transferencia de la solución en el tubo de centrifugadora respectivos. Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min a 4 ° C.
      Nota: De este tiempo, mantener las células y los reactivos en el hielo a menos que se indique lo contrario.
  2. Preparación de las células para análisis cytometric del flujo
    1. Deseche el sobrenadante. Resuspenda las células en 100 μl de tampón de tinción (4 ° C) y solución de transferencia celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    2. Añadir 0,5 μl de colorante reactivo amina a las muestras para distinguir entre células vivas y muertas. Suavemente mezcle la solución e incubar 10 min a 4 ° C.
    3. Añadir 1 mL de PBS (4 ° C) a las células y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
    4. Resuspenda las células en 100 μl de PBS (4 ° C) y agregar 33 μl de PFA (4%). Mezclar las soluciones y almacenar en hielo o a 4 ° C hasta el análisis cytometric del flujo.
  3. Medición de citometría de flujo de células
    Nota: Realizar el siguiente trabajo en una sala más bien sombreada. Mantener las células en hielo hasta la medición.
    1. Transferir las muestras a tubos adecuados para mediciones de citometría de flujo.
    2. Examinar la viabilidad celular y la eficiencia de absorción de miR utilizando un citómetro de flujo. Medir por lo menos 2 x 104 eventos. Utilice la estrategia bloquea representada en la figura 4.
      Nota: Utilice las células untransfected como control negativo para arreglar la compuerta el uso de las células positivas Cy3 y calcular la muerte celular causada por transfección.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos una instrucción detallada aislamiento cosecha hDFSCs del tejido del folículo dental humana. Por el fácil acceso del folículo dental durante la cirugía de rutina, es una fuente prometedora para la extracción de células madre adultas.

El hDFSCs aislado demostró todas las características descritas para la definición de MSCs13. De hecho, las células eran de plástico adherente debajo se descr...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células madre adultas están en foco para el tratamiento de varias enfermedades degenerativas. En particular, ósea la médula (BM)-derivado de las células madre, incluyendo las células madre hematopoyéticas (HSCs) y MSCs, están bajo intensa investigación clínica47. Sin embargo, BM la cosecha es un procedimiento invasivo que causa dolor en el sitio de la donación y puede conducir a eventos adversos48. Recientemente, el tejido dental postnatal ha emergido como una nueva y a...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por el programa de Cajamarca del centro médico de la Universidad de Rostock (889018) y la Fundación húmeda (2016-11). Además, P.M. y R.D. son apoyados por el BMBF (VIP + 00240).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anticuerpo anti CD105 humano de ratón: Alexa Fluor 488Bio-RadMCA1557A488Clon SN6, monoclonal
IgG1 de ratón Anticuerpo de control negativo: Alexa Fluor 488Bio-Rad Bio-RadMCA928A488monoclonal
APC Anticuerpo anti-CD29 de ratónBD Biosciences559883Clon MAR4, monoclonal
APC Mouse IgG1, κ Anticuerpo de control de isotipoBD Biosciences555751clon MOPC-21, monoclonal
Ratón Anti-humano Anticuerpo CD73BD Biosciences550257clon AD2, monoclonal
PE Ratón IgG1, κ Anticuerpo de control de isotipoBD Biosciences555749clon MOPC-21, monoclonal
PE-Cy7 Anticuerpo CD117 de ratón BDBiosciences339217 Clon 104D2, monoclonal
PE-Cy7 IgG1 de ratón monoclonal, κ Anticuerpo de control de isotipoBD Biosciences557872 clon MOPC-21, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Anticuerpo CD44 de ratón antihumanoBD Biosciences560531clon G44-26, monoclonal
PerCP-Cy5.5 IgG2b de ratón, κ Anticuerpo de control de isotipoBD Biosciences558304Clon 27-35, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Ratón Anti-humano CD90  AnticuerpoBD Biosciences561557Clon 5E10, monoclonal
PerCP-Cy5.5 IgG1 de ratón, κ Anticuerpo de control de isotipoBD Biosciences55095Clon MOPC-21, monoclonal
V500 Anticuerpo CD45 de ratón BDBiosciences560777Clon HI30, monoclonal
V500 IgG1 de ratón, κ Anticuerpo de control de isotipoBD Biosciences560787 Clon X40, reactivo de bloqueo monoclonal
FcR, humanoMiltenyi Biotec130-059-901
UltraPure EDTAThermo Fisher Scientific15575-0200.5M, pH 8.0
SteritopMerck MilliporeSCGPT05RE0.22 µ m, radioesterilizado, polietersulfona
BSASigma-AldrichA7906
PFAMerck Millipore1040051000
Kit de identificación funcional de células madre mesenquimales humanasR& D SystemsSC006
Solución de descontaminación de RNasa; Solución de descontaminación de ARNasa RNaseZapThermo Fisher ScientificAM9780
Precursor marcado con Cy3 miR; Control negativo de Pre-miR marcado con colorante Cy3 #1Thermo Fisher ScientificAM171205 nmol
Control negativo de precursores de miARN Pre-miR #1Reactivo
transfección a base de lípidos catiónicos de Thermo Fisher Scientific AM17110 5 nmol; Lipofectamine 2000 Reactivo de transfecciónThermo Fisher Scientific11668019
Medio sérico reducido; Opti-MEM I Medio de suero reducidoThermo Fisher Scientific31985070
Donkey anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H + L), Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11055policlonal
Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21202policlonal
Medio de montaje; Fluoroshield conmedio de montaje para histologíaSigma-AldrichF6057-20ML
Microscopio confocal ELYRA PS.1 LSM 780Citómetro de flujo Zeiss
BD FACS LSRII BDBiosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2BD Biosciences
Software ZEN2011Zeiss
Trypsin/EDTA (0,05%/ 0.02%)BiochromL2143en PBS, sin: Ca2+, Mg2+
Colorante reactivo amina; VIVOS/MUERTOS&comercio; Kit de tinción de células muertas de infrarrojo cercano reparableThermo Fisher ScientificL10119
PBS (1x)Thermo Fisher Scientific10010023pH: 7,4; w/o: Ca y Mg
P-S-G (100x)Thermo Fisher Scientific10378016
medio basal; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12Thermo Fisher Scientific11039021
Antibiótico, ZellShieldBiochromW 13-0050
FBSThermo Fisher Scientific10500064
Colagenasa tipo IThermo Fisher Scientific17100017
Dispasa IIThermo Fisher Scientific17105041
Filtro, filtro de jeringa Sterifix 0.2 y micro; mBraun4099206
50  mL tubo de centrífuga cónicoSarstedt62.547.254
15 mL tubo de centrífuga cónicoSarstedt62.554.502
Matraz de cultivo celular 75 cm2Sarstedt833.910.002
Matraz de cultivo celular, 25 cm2Sarstedt833.911.002
Medio de congelación, BiofreezeBiochromF 2270
CriotubosThermo Fisher Scientific3772671,8 mL
Solución azul de tripanoSigma-AldrichT81540,4 %
Cámara de recuentoPaul Marienfeld
Anestésico local, xilocitina (clorhidrato de lidocaína) 2% con epinefrina (adrenalina) 0,001%Mibe
solución de NaClBraun0.9 %
Vicryl satures, Vicryl rapideEthicon3 - 0
PE de DAPI Solución

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: Applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839-851 (2015).
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