Aislamiento e identificación de las células inmunes Extravascular del corazón

Resumen

Este protocolo presenta un método sencillo y eficaz para aislar, identificar y cuantificar las células inmunes que reside en el miocardio de ratones durante el estado estacionario o inflamación. El protocolo combina la digestión enzimática y mecánica para la generación de una suspensión unicelular que puede ser más analizada por citometría de flujo.

Resumen

El sistema inmune es un componente esencial de un corazón sano. El miocardio es hogar de una rica población de subconjuntos diferentes de célula inmune con compartimentación funcional durante el estado estacionario y durante diferentes formas de la inflamación. Hasta hace poco, el estudio de las células inmunes en el corazón requiere el uso de la microscopía o protocolos de digestión mal desarrollados, que proporcionaron suficiente sensibilidad durante la inflamación severa pero no pudieron con confianza identifican pequeños — pero clave — las poblaciones de células durante el estado estacionario. Aquí, discutimos una combinación simple método enzimático (colagenasa, hialuronidasa y ADNasa) y digestión mecánica de corazones murino precedido por la administración intravascular de anticuerpos fluorescente etiquetado para diferenciar pequeños pero inevitable contaminantes intravascular de la célula. Este método genera una suspensión de células viables aisladas que pueden ser analizadas por citometría de flujo para identificación, phenotyping y cuantificación, o más purificado con clasificación celular activado por fluorescencia o la separación magnética de grano para transcripcionales estudios análisis o in vitro . Incluimos un ejemplo de un análisis de citometría de flujo de paso a paso para distinguir las poblaciones de células dendríticas del corazón y macrófagos clave. Para un experimento de tamaño medio (10 corazones) la terminación del procedimiento requiere de 2-3 h.

Introducción

Diferentes formas de estrés miocárdico o lesiones, incluyendo isquémico (isquemia reperfusión o infarto de miocardio) y no isquémica (hipertensión o miocarditis), promover el reclutamiento de células inflamatorias con reparadora y protectora, sino también propiedades patógenas. Ya en 1891, Romberg describió por primera vez la presencia de infiltrados celulares en el miocardio de pacientes infectados por el tifus y la fiebre escarlata¹. Sin embargo, el estudio detallado de las células inmunes cardiacas requiere el desarrollo de las técnicas más avanzadas de immunophenotyping. En consecuencia, sólo recientemente hemos empezado a entender que una población diversa de células inmunes con papeles de mantenimiento esencial durante el estado estacionario en el miocardio.

La histología ha sido y sigue siendo, el método más común para caracterizar a las células inmunes cardiacas durante la inflamación. Sin embargo, mientras que la histología representa una valiosa herramienta de diagnóstico, su uso en el estudio de las células inmunes cardiacas tiene limitaciones importantes. Las células inmunes que reside en el miocardio representan una proporción muy pequeña de las células totales y son más o menos uniformemente distribuidas en un espacio proporcionalmente enorme. Del mismo modo, varias formas de inflamación cardiaca, como la miocarditis viral, muestran patrones focal de inflamación. Esto significa que un análisis minucioso del sistema inmune del corazón requieren a menudo grados más altos de toma de muestras histológicas, aumentando el costo para reducir el sesgo. Por otra parte, la histología proporciona una cantidad muy limitada de información útil en la identificación de la célula (por ejemplo, el número de parámetros). Con un creciente número de subconjuntos de la célula que requieren la utilización de múltiples marcadores de expresión (incluyendo marcadores de superficie, factores de transcripción o moléculas secretadas), citometría de flujo se ha consolidado como la herramienta más potente para Inmunofenotipificación, debido al bajo costo y alto rendimiento.

El uso de técnicas de immunophenotyping depende estrechamente en el desarrollo de protocolos de digestión eficiente que permitió para el análisis de células individuales de un gran número de células. El desarrollo de exhaustivos protocolos de extracción de la célula abre una nueva ventana de oportunidades en el estudio de la inmunología cardiaca. A través de la combinación de digestión, citometría de flujo y la transcriptómica, las principales poblaciones de macrófagos y células dendríticas que residen en el corazón han sido caracterizados^2,3. La población más abundante de las células inmunes cardiacas durante el estado estacionario son CD64⁺⁺ de MerTK los macrófagos, que pueden dividir más a fondo en su expresión de CCR2 o CD11c²base. CCR2⁺ macrófagos se originan de la hematopoyesis de la médula ósea adulta, mientras que la mayoría de CCR2 los macrófagos^– , que pueden expresar altos o bajos niveles de MHC-II, son principalmente de origen prenatal. Los macrófagos realizan funciones claves como reparación⁴ y retiro de escombros⁵ lesiones o apoyando la conectividad eléctrica⁶ en estado estacionario. Durante diferentes formas de la inflamación se producen una importante afluencia de Ly6C^Hola MHC-II^lo CD64^int monocitos, que más tarde se diferencian en Ly6C^Hola CCR2⁺ los macrófagos^2,7 . Una población perceptiblemente más pequeña, pero importante, de las células que residen en el miocardio de los individuos sanos se compone de células dendríticas^8,9. Los dos subconjuntos principales de DCs convencionales cardiacas (CDC) se han caracterizado recientemente: cDC1 (CD103⁺ DCs) y cDC2 (CD11b⁺ DCs). DCs desempeñan papeles importantes en la defensa contra la infección⁸ pero también pueden promover uno mismo-lesión durante la inflamación, particularmente durante el infarto de miocardio⁹.

Aquí, describimos un método simple para el aislamiento de las células inmunes cardíacas viables de miocardio de ratón. El método combina la digestión enzimática y mecánica con filtración celular-colador para obtener una suspensión unicelular que puede ser analizada, o más purificada, por clasificación de citometría de flujo o enriquecimiento de grano magnético. Las medidas exactas de células del miocardio extravasculares requieren perfusión cardiaca con el fin de eliminar los posibles contaminantes del torrente sanguíneo de la microcirculación cardiaca. Además, presentamos un paso opcional del etiquetado intravascular de células inmunes que pueden utilizarse para distinguir aún más células del miocardio de contaminantes intravasculares, basados en el Galkina et al protocolo¹⁰. Por último, presentamos un análisis de citometría de flujo básico para identificar las principales subpoblaciones de macrófagos y cDC.

Protocolo

Declaración de ética: este protocolo ha sido revisado y aprobado por el Comité de cuidado del Animal en la red de salud universitaria (Toronto, Canadá) y está de acuerdo con el Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal.

1. preparación de buffer

1. Preparar el tampón HBB (de Hank balanceado sal solución (HBSS), suero bovino inactivado por calor 2%, albúmina de suero bovino 0,2%). Añadir 10 mL de calor inactiva el suero bovino y 1 g de albúmina de suero bovino a 500 mL de HBSS. Filtro de esterilización a través de un filtro μm 0.2 y almacenar a 4 ° C.
2. Preparar el tampón FACS (tampón de fosfato salino (PBS), 2% calor inactiva el suero bovino, 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, pH 8.0)). Añadir inactivado de calor de 10 mL de suero bovino y 1 mL de EDTA de 0.5 M a 500 mL de PBS. Filtro de esterilización a través de un filtro μm 0.2 y almacenar a 4 ° C.
   Nota: Las soluciones pueden almacenarse a 4 ° C durante 1 mes.

2. etiquetado de leucocitos que circulan

1. Preparar asépticamente inyección de CD45 anti ratón con 1 μg de anticuerpo diluido en tampón de fosfato estéril salino (PBS) para un volumen de inyección final de 200 μL/ratón. Volumen de carga en una jeringa de insulina 28,5 G y mantener lejos de la luz.
   Nota: Utilice dos anticuerpos anti-CD45 marcado con fluorocromo diferente para distinguir el intravascular (teñido a través de la administración de i.v.) de la tinción intracardiaco (manchado después de la digestión; ver paso 4).
2. Caliente previamente ratones (8 – 12 semanas) exponiendo la cola a una lámpara de calor rojo durante 5 minutos.
   ADVERTENCIA: No recaliente el animal. Mantenga la lámpara a una distancia segura (> 30 cm).
   1. Refrenar el animal en posición esternal utilizando un dispositivo apropiado. Exponer y estabilizar la cola con la mano no dominante por inmovilizar la base de la cola con el índice y el dedo medio y la región medio-distal de la cola con el pulgar y el dedo anular.
      PRECAUCIÓN: No aplique demasiada fuerza en la punta de la cola ya que la piel puede ser halada. Inserte la aguja con el bisel hacia arriba en la vena. Mantenga la aguja paralela a la vena en todo momento ya que es fácil punzar la vena.
      Nota: Sangre en la jeringa puede ocurrir y es un signo de una buena inyección. Doblar la aguja a un ángulo de 90° puede facilitar la administración de i.v.. Confirme con su oficina de seguridad como agujas de flexión pueden representar un peligro.
   2. Inyectar por vía intravenosa 200 μL en la vena de la cola. El líquido debe fluir fácilmente y eliminar temporalmente la vena.
      PRECAUCIÓN: No fuerce el líquido en si encuentra resistencia. Esto es signo de mala colocación de la aguja.
   3. Permiten el anticuerpo a circular durante 5 minutos antes humanamente euthanizing ratón.

3. corazón de aislamiento y la digestión

1. Eutanasia a ratones con CO₂ o por cualquier otro procedimiento de eutanasia institucionalmente aceptado.
   1. Eutanasia de CO₂ , coloque el ratón en la cámara de CO₂ y la tasa de utilización a 20% del volumen por minuto (es decir, si la cámara es de 10 L, llenado en 2 L/min). Funcionar durante 2 min y monitor ratón hasta que ha dejado de respirar.
   2. Apague el CO₂ y dejar el ratón un adicional 1-2 min Asegúrese de que ha dejado de respirar antes de abrir la cámara y realizar un pellizco del dedo del pie para confirmar que el ratón está muerto antes de proceder a procesar el ratón.
2. Rocíe el ratón con etanol al 70%. Levante la piel en el abdomen y diseccionar el ratón cortando a lo largo del principio de la línea media ventral a nivel de las caderas hasta el esternón. Abrir el abdomen y mover el hígado para exponer el diafragma.
3. Cortar el diafragma y las costillas en ambos lados de la línea media, siendo cuidadoso para evitar pinchar los pulmones y el corazón.
   1. Exponer el corazón por peeling espalda las costillas, luego corte primero las aurículas izquierdas seguidas de la aurícula derecha.
      PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al cortar las aurículas, asegurando arterias ni venas no se lesionan, como esto puede disminuir la eficacia del lavado de la sangre contenida en los órganos.
   2. Inundar el corazón con 15 – 20 mL de PBS frío utilizando una jeringa de 60 mL con una aguja de 21 G y PBS frío. Suavemente Sujete la base del corazón con unas pinzas e Inserte la aguja en el ventrículo izquierdo cerca del ápice. Repita el procedimiento en el ventrículo derecho. Una correcta inyección resulta en blanco pulmones y hígado pálido.
      Nota: La perfusión debe realizarse en 5 minutos después de la eutanasia para evitar la coagulación de la sangre, que puede contaminar los órganos de interés con las células circulantes.
4. Sostenga la base del corazón con unas pinzas y suavemente tire el corazón, luego separar el corazón mediante la reducción de las principales arterias pulmonares y las venas, aorta y el saco pericárdico.
   1. Limpiar el corazón sosteniendo suavemente el corazón entre los dedos del índice y el pulgar en una toalla de papel limpio libre de pelusas y extraiga las aurículas y los restos de las arterias principales y venas y otros contaminantes con el fórceps.
      Nota: Asegúrese de retira la totalidad de las aurículas y no otros tejidos como el pulmón o los vasos sanguíneos, están presentes como estos tejidos tienen sus propias células inmunes residentes. En particular, el pulmón tiene una población grande de la célula inmune que puede enmascarar a las poblaciones más pequeñas de ésos dentro del miocardio.
5. Coloque el corazón en un recipiente plástico de 5 cm con 50 μl de PBS frío.
   1. Picar el corazón usando tijeras disección curvas hasta que no hay piezas visibles y tiene una consistencia suave.
      Nota: Trate de mantener el corazón en un área de contenido del plato en picar para minimizar la pérdida de tejido.
   2. Transferencia de tejido de thetrituratedheart usando fórceps curvado en el tubo de microcentrífuga de 2 mL con de 800 μl frío Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM).
6. Añadir 450 U/mL ofcollagenase I, 60 U/mL de hialuronidasa tipo I-S y 60 U/mL de DNasa-I para cada muestra.
   1. Incubar las muestras a 37 ° C en un agitador oscilante a 50 rpm durante 45 – 60 minutos.
7. Después de la digestión, brevemente muestras de vórtice (20 s) y colocar inmediatamente en hielo para mantener las muestras a 4 ° C.
   1. Utilizando una pipeta de 1 mL, pipetear las muestras hacia arriba y hacia abajo hasta que las muestras de tejido son homogéneas y no obstruir la punta de la pipeta.
      Nota: Definir un número específico de veces para pipeta puede aumentar la reproducibilidad. Si el corazón no se digiere óptimamente, piezas del miocardio pueden obstruir la pipeta. Pulir suavemente la punta de la pipeta contra el tubo de microcentrífuga ayudará a homogeneizar los trozos más grandes de tejido.
8. Humedezca previamente un filtro de celular de 40 μm a un tubo cónico de 50 mL con 1 mL de frío HBB.
   1. Añada la muestra homogeneizada en el filtro y lavar a través vertiendo lentamente 12 – 14 mL de frío HBB.
   2. Transferencia de muestras de filtrado a un tubo cónico de 15 mL con y guardar a 4 ° C.
9. Centrifugar las muestras a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Aspire de sobrenadante.
   1. Lyse células de sangre rojas añadiendo 1 mL de tampón de lisis de amonio cloruro de potasio (ACK) para cada muestra. Resuspender las muestras con un vórtex e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
   2. Una vez que ha completado la lisis, agregar 5 – 8 mL de frío de Hank balanceado sal solución (HBSS) para detener la hemólisis.
10. Centrifugar las muestras a gfor 400 x 5 min a 4 ° C. Aspire de sobrenadante.
11. Añadir 1 mL de tampón FACS a cada muestra y su traslado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con.
    Nota: El protocolo puede hacer una pausa aquí para un máximo de 2 h con las muestras almacenadas a 4 ° C.

4. flujo Cytometry de tinción y análisis

1. Centrifugar las muestras a 400 x g durante 5 min a 4 ° C.
   1. Para reducir el atascamiento no específico anticuerpo, diluido 1: 100 anti-CD16/CD32 y bloqueador de monocitos (1:20) (véase Tabla de materiales) que representa el 50 FACS μl por muestra. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
   2. Preparar la contabilidad de dilución (1: 250 para cada anticuerpo) del anticuerpo para 50 μl de FACS por muestra.
      Nota: Un tinte de viabilidad puede incluirse en el cóctel de anticuerpos para excluir las células muertas. Por otra parte, exclusión de tamaño pequeño por análisis de flujo puede ser usado (figura 1C y D).
   3. Sin lavar, agregar 50 μl de mezcla principal anticuerpo para cada uno de la muestra y mezclar.
   4. Incubar las muestras a 4 ° C por 30 min en la oscuridad.
2. Añadir 600 μl FACS a cada muestra para lavar y centrifugar las muestras a 400 x g durante 5 min a 4 ° C.
3. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 300 μL FACS. Mantener las muestras a 4 ° C en la oscuridad.
   Nota: Algunos colorantes de viabilidad, como DAPI, requieren tinción dentro de 10 minutos antes de ejecutar la citometría de flujo.
4. Analizar mediante citometría de flujo (ver figuras 1 y 2) dentro de lo próximo 3 h. Si más tiempo es necesario, a corto plazo fijación utilizando un paraformaldehido de baja concentración (0.5 – 1% en PBS) se recomienda para preservar la coloración.
   Nota: Se recomienda filtrar las muestras por un colador de célula 40 μm antes de análisis de citometría de flujo iniciar para evitar la obstrucción de los fluidos de la citometría de flujo.

Resultados

Hasta la fecha, ningún buen método ha sido diseñado para aislar las células inmunes de otras componentes de la célula cardiaca, como cardiomiocitos. Por lo tanto, el análisis de la suspensión de la célula cardiaca mediante citometría de flujo requiere la sincronización con CD45 para identificar las poblaciones de células inmunitarias, seguidas por celular único y pequeño tamaño exclusión bloquea (figura 1A). Alternativamente, una tinción de v...

Discusión

Inflamación miocardio o la miocarditis, es una característica de las enfermedades cardiovasculares más. Sin embargo, el miocardio no está desprovista de sus propios componentes inmunes en Estados no patológicos. Durante el estado estacionario, muchas células inmunes residen en el miocardio y desempeñan las funciones esenciales de mantenimiento y protección. La caracterización de estas diversas poblaciones de células no habría sido posible sin métodos como la que se presenta en el presente Protocolo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución salina tamponada con fosfato	Wisent	311-010-CL	1x PBS
21 G x 1 1/2 (0,8 mm x 40 mm) Aguja PrecisionGlide	BD	305167
Hank' s Solución salina equilibrada	Wisent	311-511-CL	1x HBSS
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Suero bovino	Sigma	B9433
0,5 M Ácido etilendiaminotetraacético	BioShop	EDT111
Filtro de vacío, 0,2 µ m Filtropur V50	Sarstedt	83.1823.001
28 G 1/2 1 cc jeringa de insulina	BD	329424
60 mL	BD	309653
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Wisent	319-005-CL	1x DMEM con 4,5 g/L de glucosa y L-glutamina y piruvato de sodio
colagenasa I	Sigma	C0130	de Clostridium histolyticum
Hialuronidasa tipo I-S	Sigma	H3506
DNasa-I	Sigma	D4513	de páncreas bovino
Filtro de células, 40 y micro; m Nylon	Falcon	352340
Tampón de lisis de cloruro de amonio y potasio (ACK)	Lonza	10-546E
Alexa Fluor 700 anti-ratón/humano CD11b Biolegend		101222	dilución 1:250
APC/Cy7 anti-ratón Ly-6c	Biolegend	128025	dilución 1:250
APC anti-ratón CD103	Biolegend	121414	dilución 1:250
Brilliant Violet 605 anti-ratón CD11c	Biolegend	117334	dilución 1:250
PE anti-ratón Ly-6G	Biolegend	127607	:250 dilución
Pacific Blue anti-ratón I-Ab Biolegend		116422	dilución 1:250
FITC anti-ratón CD64 (FcgRI)	Biolegend	139315	dilución 1:250
PE/Cy7 anti-ratón CD45 Biolegend		103113	dilución 1:250
PerCP/Cy5.5 anti-ratón CD45 Biolegend		103132	dilución 1:40
TruStain fcX (anti-ratón CD16/32)	Biolegend	101320	dilución 1:100
Bloqueador de monocitos True-Stain Biolegend		426101	dilución 1:20
FlowJo V10	TreeStar Inc		https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Ratón: Batf3-/-	El Laboratorio Jackson	JAX: 013755